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Resumo

Aqui, descrevemos a geração e aplicação de um conjunto de transgénicos Arabidopsis thaliana linhas permitindo expressão inducible, tecido-específica nos três os meristemas principais, a meristema apical de atirar, a meristema apical de raiz e o cambium.

Resumo

Expressão inducible, tecido-específica é uma ferramenta importante e poderosa para estudar a dinâmica espaço-temporal da perturbação genética. Combinando o GreenGate flexível e eficiente sistema com o comprovada e aferido LhGR sistema (aqui denominado GR-LhG4) para a expressão inducible de clonagem, geraram um conjunto de linhas de Arabidopsis transgênicas que pode guiar a expressão de um efetor gaveta em uma variedade de tipos de célula específica nos três os meristemas planta principal. Para este fim, escolhemos o sistema GR-LhG4 previamente desenvolvido, com base em um fator de transcrição quimérico e cognato pOp-tipo promotor garantindo controlo apertado sobre uma ampla gama de níveis de expressão. Além disso, para visualizar o domínio de expressão onde o fator de transcrição sintética está ativo, um repórter fluorescentes mTurquoise2 ER-localizada sob o controle do promotor pOp4 ou pOp6 é codificado em linhas de motorista. Aqui, descrevemos as etapas necessárias para gerar uma linha de driver ou efetoras e demonstrar como expressão específica do tipo celular pode ser induzida e seguido no meristema apical de fotos, a meristema apical de raiz e o cambium de Arabidopsis. Usando vários ou todos os driver de linhas, o efeito de contexto específico de expressar um ou múltiplos fatores (efetores) sob controle do promotor sintético pOp pode ser avaliadas rapidamente, por exemplo em plantas de F1 de um cruzamento entre um efetor e múltiplo linhas de motorista. Esta abordagem é exemplificada pela expressão ectópica de VND7, um factor de transcrição do NAC capaz de induzir a deposição de parede ectópica secundária de célula de forma autónoma de célula.

Introdução

Uma grande limitação em biologia na era postgenomic é para decifrar o papel específico do contexto de um determinado fator ou perturbação genética. Perturbações genéticas constitutivas como abordagens da função de perda e ganho-de-função muitas vezes só permitem a análise de ponto de extremidade de processos de adaptação ao longo da vida, ofuscando a distinção entre efeitos primários e secundários. Além disso, funções específicas do contexto podem ser mascaradas ou diluídas por efeitos de grande escala em tecidos distantes ou durante as outras fases do desenvolvimento. Além disso, em casos extremos, a letalidade pode exclui qualquer visão mecanicista. Idealmente, para contornar esses problemas, pode-se analisar o efeito aguda perturbação genética dentro de um contexto específico, como um tipo específico de célula de forma tempo-resolvido. Para conseguir isso, ferramentas genéticas para expressão de tipo específico de célula inducible, são necessários1. Para fornecer um recurso para a rápida avaliação da dinâmica de uma resposta a uma determinado efetoras spatiotemporal, combinamos a facilidade de clonagem fornecidos pelo sistema GreenGate2 com a eficácia comprovada do sistema a GR-LhG4,3, 4,5,6. Podemos ter gerado um conjunto de linhas que expressam o fator de transcrição quimérico que lhg4 fundido para o domínio de ligação do ligante do receptor (GR) corticoide rato7 sob o controle de célula bem caracterizadas de promotores específicos tipo8. Em condições de repouso, o fator de transcrição permanece fora do núcleo, como o domínio GR é ligado pelo HSP90 citosólica. Com a adição de dexametasona ligante sintético (Dex), translocação nuclear é induzida e LhG4 vai mediar a transcrição das fitas de expressão sob controle de um promotor de cognato sintético pOp-tipo , tais como um repórter mTurquoise2 incluídas nas linhas de motorista Visualizar o domínio de expressão após a indução.  Assim, as linhas de motorista tecnicamente também contêm uma gaveta effector. O cruzamento de um conjunto de linhas de motorista com uma linha carregando uma gaveta effector com, por exemplo, um gene de interesse sob o controle do promotor pOp-tipo mesmo assim, permite a avaliação rápida das consequências agudas ou a longo prazo da expressão effector em uma ampla gama de tipos de células.

Aqui, nós fornecemos um protocolo descrevendo os procedimentos necessários para gerar as linhas de driver e efetoras e demonstrar como expressão específica do tipo celular pode ser induzida e seguido no meristema apical de fotos, a meristema apical de raiz e o cambium da Arabidopsis. Para ilustrar a valentia e a especificidade desta abordagem, nós utilizamos o fator de transcrição conhecidos VND7 que é capaz de conduzir o engrossamento em espiral do tipo xilema secundário celular parede ectopically9. Tratamento de F1 de um cruzamento entre o Carbono2grl3vuoluk10,11 motorista e a pOp6:VND7 effector linha leva à formação de células de xilema, como gravidez ectópica na bainha de amido células da Arabidopsis da haste.

Para facilitar a geração de grandes conjuntos de DNA necessária para a construção de plasmídeos de expressão driver e efetoras, usamos o rápido e eficiente GreenGate clonagem método2. GreenGate clonagem é baseado no tipo II S, enzimas de restrição como Eco31I ou sua isoschizomer BsaI2. Estas enzimas cortar a jusante de seus sites de reconhecimento assimétrica produzindo saliências com variando a composição de base. Incorporando o Eco31I /Bsaeu restrição sites em oligonucleotides e alocando sequências específicas saliência para elementos de DNA, clonagem modular é alcançado, facilitando a geração de grandes módulos (assemblies). No quadro GreenGate, módulos de DNA se enquadram em categorias A-F com base na sequência de saliência que servem como adaptadores e são montadas nessa ordem. Portanto, as primeiras demão projetadas para amplificar seu produto desejado devem estar de acordo com o módulo selecionado2 (figura 1A). Se há um interno Eco31I /Bsaeu site e a sequência não é compatível com os módulos de entrada e destino GreenGate, você pode prosseguir sem mutagenizing, mas com menor eficiência. Como alternativa, use o mutagenesis local-dirigido para remover Eco31I /Bsaeu locais de restrição, tomando cuidado para não alterar os aminoácidos em produtos de genes.

Protocolo

Vetores e módulos podem ser obtidos no repositório sem fins lucrativos, Addgene (https://www.addgene.org).

1. clonagem usando GreenGate

  1. Cartilhas do projeto usando as saliências listadas na tabela 1, substituir 'NNNN' com sequências de tipo-específico do adaptador do módulo listado abaixo: para a frente: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + 3´ de sequência específica, reverter: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) + reverso complemento de 3´ sequência específica. Adicione as bases sublinhadas para garantir a manutenção do quadro de leitura.
    Saliências de módulo:
    Nota: no âmbito GreenGate padrão, seis módulos, A-F, são montados com um backbone de vetor de transformação de plantas em uma expressão do plasmídeo (Figura 1). Normalmente, o um módulo dará abrigo sequências de promotor, um B-módulo um N-terminal tag ou "dummy" sequência6, um C-módulo um CDS, uma marca D-módulo C-terminal ou manequim, um módulo E um terminador e um F-módulo uma gaveta de resistência para a seleção dos transgênicos plantas. Adaptador para acoplamento com outras unidades preassembled estão disponíveis para uso em vez do F de módulo2.
  2. Amplificação por PCR
    1. Amplifica a sequência de interesse com os primers desenhados por reação em cadeia da polimerase (PCR) de acordo com protocolos padrão.
    2. Separe o produto do PCR em um gel de agarose. Impostos especiais de consumo e coluna purificam o fragmento correto usando um comercial kit (veja a Tabela de materiais) conforme as instruções do fabricante.
  3. Criação do módulo de entrada
    1. Separadamente, digerir o vetor de módulo e o fragmento PCR (etapa 1.2.) (Figura 1 A, B) com Eco31I/Bsaeu usando 100-500 ng de DNA (vetor ou fragmento), 3 µ l 10 x buffer de digestão e 5-10 U Eco31I em um tubo e levar o volume a 30 µ l com DDQ2O.
    2. Misture delicadamente por pipetagem para cima e para baixo e spin-down brevemente a 1.000 x g. Incube a 37 ° C, em um bloco de calor por 15 min (ou na sequência da recomendação de tempo a enzima de restrição comprado).
    3. Após a digestão, a coluna purificar cada amostra usando um comercial kit (veja a Tabela de materiais) e quantificar o DNA obtido através da determinação da densidade óptica em 260 nm (OD260), utilizando um espectrofotômetro.
    4. Mix de 30 a 100 ng digerido insert e o vetor de ng digerido 10 – 50 pipetando acima e para baixo várias vezes e incubar com 1 µ l T4 Ligase (5 U / µ l e 3 µ l 10 x buffer de ligadura T4 em um volume total de 30 µ l à temperatura ambiente durante 1 h (seguindo a recomendação do fornecedor T4 ligase) (ver Tabela de materiais).
      Nota: Calcule o vetor de módulo: destino de entrada desejada relação molar (por exemplo, 3:1) para a ligadura dependendo da concentração e comprimento das inserções do módulo de entrada.
    5. Para aumentar a eficiência de transformação, o calor inativar o T4 ligase incubando a reação a 65 ° C por 20 min.
    6. Uso o produto da ligadura para transformar competentes de Escherichia coli células de acordo com os protocolos de laboratório padrão e a propagação de bactérias em placas de ágar suplementadas com ampicilina (100 µ g/mL)
    7. Incube a placa com bactérias a 37 ° C durante a noite.
    8. Tela para colônias com o módulo de entrada desejado por PCR utilizando os primers 86A1 (5 '-GTTGTGTGGAATTGTGAGC-3 ') e 86A2 (5 '-GTTTTCCCAGTCACGACG-3 ') e condições padrão PCR de colônia.
      Nota: Esta combinação de cartilha é válida para todos os módulos de entrada como os primers bind para o backbone do vetor de entrada.
    9. Selecione única colônias para o isolamento do plasmídeo. Use cultura líquida de 2 mL LB suplementada com ampicilina (100 µ g/mL) e incubar durante uma noite em um shaker de 37 ° C.
    10. Plasmídeos isolados da cultura líquida durante a noite com um Kit de mini-preparação ou a extração desejada protocolo (consulte Tabela de materiais).
    11. Para identificar os plasmídeos com a inserção correta, executar análise de enzimas de restrição, por exemplo selecionando duas enzimas que cortam com exclusividade na sua inserção pela mistura de 200 ng do plasmídeo, 2 µ l 10 x buffer de digestão, 5-10 U de selecionado enzimas de restrição e ddH2 O a 20 µ l.
    12. Sequenciar os plasmideos selecionados usando as primeiras demão 86A1 e 86A2 (consulte a etapa 1.3.9.).
  4. Criação do módulo de destino:
    Nota: Para o plasmídeo de destino use o destino desejado módulo pGGZ001, pGGZ002 ou pGGZ0032 (Figura 1).
    1. Em um tubo adicione e misture o vetor de destino vazio 50-150 ng (pGGZ003, por exemplo), cheio de 50 a 300 ng de cada módulo de entrada, 2 µ l 10 x buffer de buffer de digestão, 1,5 µ l 10mm ATP, 1 µ l T4 Ligase (30 U / µ l), 5-10 µ l de U Eco31I e dH2O para um volume total de 20 µ l.
      Nota: Calcule o vetor de módulo: destino de entrada desejada relação molar (por exemplo, 3:1) para a ligadura dependendo da concentração e comprimento das inserções do módulo de entrada.
    2. Misture e realizar a reação GreenGate2 usando um PCR thermocycler alternando 30 vezes entre 37 ° C por 5 min e 16 ° C por 2 min, seguido por passos simples de 5 min a 50 ° C e 5 min a 80 ° C.
    3. Para aumentar a eficiência, adicionar 1 µ l T4 Ligase (30 U / µ l) e 1,5 µ l 10mm ATP para a reação e incube por 1h à temperatura ambiente, seguida por calor-inactivação de T4 DNA Ligase a 65 ° C por 20 min.
    4. Utilize a reação da ligadura competentes de Escherichia coli e espalhar as bactérias em placas de ágar, suplementadas com a espectinomicina apropriado agente seletivo (50 µ g/mL).
    5. Incube a Escherichia coli transformada na placa a 37 ° C durante a noite.
    6. Para confirmar a transformação, re-marcam cada uma das colónias única selecionadas na espectinomicina (50 µ g/mL) e ampicilina (100 µ g/mL) contendo placas, respectivamente. Use apenas as colônias que crescem em espectinomicina mas não em placas de ampicilina.
    7. Incubar as colônias de Escherichia coli durante a noite a 37 ° C.
    8. Selecione única colônias para isolamento do plasmídeo. Use cultura líquida de 2 mL LB suplementada com espectinomicina (50 µ g/mL) e incubar durante uma noite em um shaker de 37 ° C.
    9. Isolar o plasmídeo correspondente com um Kit de mini-preparação (ver Tabela de materiais).
    10. Verifique pela análise de enzimas de restrição (Veja 1.3.12.) e sequência selecionada positivas construções usando as primeiras demão 88 3 (5 '-ACCTCTCGGGCTTCTGG-3. '), 88 4 (5 '-CCTTTTTACGGTTCCTG-3 '). Se a inserção não pode ser totalmente sequenciada com estas primeiras demão, projetar primers internos para sequenciamento.
      Nota: Para identificar clones com o número correto de sequências de repetição pOp (ver discussão), as primeiras demão pOp6 (pOp6_F, 5 '-TGCATATGTCGAGCTCAAGAA-3 '; e pOp6colaram, 5 '-CTTATATAGAGGAAGGGTCTT-3 ') que se ligam na suma, flanquear sequências pode ser usado para amplificação por PCR e eletroforese em gel subsequentes para discriminar por tamanho.
  5. Criação de supermodule intermediário
    1. Para combinar dois conjuntos independentes de módulos de entrada, conforme necessário para gerar as GR-LhG4 motorista linhas com gaveta integrada repórter-effector, primeiro construir dois plasmídeos intermediário, chamadas supermodules2, antes de montar a expressão final plasmídeo em pGGZ001 ou pGGZ003.
    2. Não se esqueça de adicionar o adaptador F-H no final do primeiro supermodule e adaptador de H-A no início da segunda supermodule (aqueles que servem como conexões entre duas construções) como descrito2.
      Nota: Apenas o módulo intermediário pGGN000 carrega a gaveta de resistência. Para gerar o plasmídeo de expressão, realize a reação GreenGate com o vetor de destino e os pGGN000 e pGGM000 supermodules de intermédios. Como alternativa, misture o vetor de destino, pGGN000 supermodule de intermédios e os restantes módulos simples para realizar a reação de GreenGate2. O último método é menos eficiente do que o anterior, mas pode ser mais rápido.
    3. Para criar um supermodule de pGGM000/pGGN000, misture 1,5 µ l (100-300 ng / µ l) de cada um dos módulos de entrada com 1 µ l (30 ng / µ l) vazio intermediário vetor (pGGM000 ou pGGN000), buffer de digestão 2 µ l x 10, 1,5 µ l 10mm ATP, 1 µ l T4 Ligase (30 U / µ l) e 5-10 U Eco31I em um volume total de 20 µ l.
      Nota: Calcular o vetor de módulo: destino de entrada desejada relação molar (por exemplo, 3:1) para a ligadura dependendo da concentração e comprimento das inserções do módulo de entrada
    4. Misture e realizar a reação GreenGate etapa 1.4.2
    5. Para aumentar a eficiência, adicionar 1 µ l T4 Ligase e 1,5 µ l ATP (10 mM) e incube por 1h à temperatura ambiente, seguida por calor-inativação a 65 ° C por 20 min.
    6. Use 10 µ l de reação da ligadura para transformar competentes de Escherichia coli e raia em placas contendo canamicina (50 µ g/mL).
    7. Realizar a incubação durante a noite da transformada e. coli na placa a 37 ° C.
    8. Re-marcam cada uma das colónias única selecionadas na canamicina (50 µ g/mL) e ampicilina (100 µ g/mL) contendo placas, respectivamente.
    9. Realizar a incubação overnight das colônias Escherichia coli na placa a 37 ° C.
    10. Selecione única colônias que crescem apenas em canamicina mas não ampicilina para isolamento do plasmídeo. Use cultura líquida de 2 mL LB suplementada com canamicina (50 µ g/mL) e incubar durante uma noite em um shaker de 37 ° C.
    11. Isolar o plasmídeo correspondente usando um prep mini kit (veja a Tabela de materiais).
    12. Verifique o plasmídeo por análise de enzimas de restrição (Veja 1.3.12.) e confirmar por sequenciamento utilizando primers 87E2 (5´-AGGCATCAAACTAAGCAGAAG-3´) e 87E3 (5´-CGTTTCCCGTTGAATATGGC-3´) recozimento à coluna vertebral pGGM000/pGGN000. Se a inserção não pode ser totalmente sequenciada com estas primeiras demão, projetar primers internos para sequenciamento.
      Nota: Se a clonagem em vetores pGGM000 ou pGGN000 não for bem sucedida, uma solução possível é digerir o pGGM000 ou pGGN000 com Eco31I, executado em um gel e purificar do gel, o fragmento de espinha dorsal (aproximadamente 2000 bp) pGGM000 ou pGGN000 sem o gaveta de ccdB (aproximadamente 1400 bp). Prossiga normalmente com a reação da ligadura.
  6. Transforme uma tensão de pSOUP+ da . tumefaciens (por exemplo, ASE), como a origem de replicação (ori r. tum...) em vetores o destino do pSa exigem a presença do auxiliar do plasmídeo pSOUP12. Raia para fora as bactérias em placas LB contendo cloranfenicol (34 µ g/mL), canamicina (50 µ g/mL), espectinomicina (50 µ g/mL) e tetraciclina (12,5 µ g/mL). Incube o transformado a. tumefaciens na placa em uma incubadora de 28 ° C durante dois ou três dias.

2. geração de plantas transgênicas de Arabidopsis

  1. Transformação de Arabidopsis thaliana.
    Nota: Transforme a. thaliana plantas de acordo com Zhang et al., 2006,13.
  2. Seleção de linhas transgénicas.
    1. Para selecionar as plantas transformadas, use o esquema de seleção usado no GABI-Kat14 para resistência à sulfadiazina15.
    2. Para selecionar linhas estáveis com um evento de integração único possível, escolha aqueles em geração T2, que mostram a relação de 3:1 segregação no marcador de resistência. Propagar essas linhas para geração de T3 e selecionar as plantas homozigotos para o gene de resistência. Como alternativa, execute uma análise de Southern Blot ou um padrão quantitativo em tempo real do PCR (SA-qPCR)16 para selecionar linhas de inserção única.

3. indução de trans-ativação em linhas de motorista de Arabidopsis

  1. Raiz
    1. Para testar a expressão de repórter na . thaliana motorista linhas geradas através as etapas 1 e 2, esterilizar as sementes, como descrito abaixo.
      1. Adicionar 0,5-1,0 mL de 70% etanol + 0,01% de detergente não-iônico para cerca de 100 sementes (20 mg) em um tubo de reação de 1,5 ml e inverter o tubo algumas vezes. Spin para baixo a 1000 x g por 15 s e aspire o sobrenadante.
      2. Adicionar 0,5-1,0 mL de etanol absoluto. Inverter o tubo várias vezes, spin para baixo para 1.000 x g durante 15 s e descartar o sobrenadante.
      3. Adicionar 0,5-1,0 mL de etanol absoluto e inverter o tubo t algumas vezes, então spin para baixo a 1.000 x g durante 15 s e descartar o sobrenadante.
      4. Permitir que as sementes secar o interior do capô. Se as sementes vão ser estratificada em tubos de continuar com a etapa 3.1.1.6.
      5. Adicionar 0,5-1,0 mL de água estéril e inverter o tubo algumas vezes. Spin para baixo a 1.000 x g durante 15 s e descartar o sobrenadante.
      6. Adicionar 0,5-1,0 mL de água estéril e inverter o tubo várias vezes. Spin para baixo a 1.000 x g durante 15 s e descartar o sobrenadante.
      7. Adicionar 0,5-1,0 mL de água estéril.
    2. Prepare meia-força Murashige e Skoog médio, pH 5,8 e adicionar 0,9% planta agar e 1% de sacarose. Após a autoclavagem adicionar dexametasona (Dex), dissolvidos em DMSO, para uma concentração final de 10-30 µM para placas de indução e uma quantidade igual de DMSO para placas de controle, respectivamente.
    3. Colocar as sementes para a imagem latente de raiz em placas e estratificá-los por 48 h em escuridão e o frio (4 ° C).
    4. Coloque as placas na posição vertical em uma incubadora de planta (longo dia 16/8 h, 22 ° C, umidade, 65%) e cultivá-las por cinco dias.
    5. Cinco dias após a germinação (dag), as mudas usando laser confocal, microscopia eletrônica de varredura da imagem.
  2. Haste
    1. Esterilize as sementes conforme descrito em 2.1.1. e coloque as sementes ½ MS, ágar de planta de 0,9% e placas de sacarose 1%. Estratificar por 48 h em escuridão e o frio (4 ° C).
    2. Seis a sete dias após a germinação, transferi as mudas para o solo, cada planta em um único pote (longo dia 16/8 h, 22 ° C, umidade, 65%).
    3. Induzi trans-ativação em hastes regando com Dex ou solução simulada, ou mergulhando as plantas em Dex ou simulado, respectivamente.
    4. Para molhar, use uma solução de Dex 25 µM em água, preparada a partir de um estoque de 25 mM Dex dissolvido em etanol. Água a cada 2-3 dias até o tempo desejado de indução.
    5. Para mergulhar, prepare um copo de 1 L, 750 mL de água contendo 0,02% silwet L-77 com 25 µM de Dex ou quantidade equivalente de DMSO de Dex e tratamento simulado, respectivamente. Molhar plantas individuais por 30 s na indução ou na solução de simulação. Repeti a cada 2-3 dias até o tempo desejado da imagem.
      Nota: Após a imersão, as plantas devem ser mantidas em alta umidade durante uma hora.
  3. Atire meristema Apical (SAM)
    1. Esterilize as sementes conforme descrito em 2.1.1. Preparar pratos com ½ MS, ágar de planta de 0,9% e 1% médio de sacarose e colocar as sementes em placas. Armazene as placas durante dois dias na escuridão e o frio para estratificação.
    2. Coloque as placas na posição vertical em uma incubadora de planta. Seis a sete dias após a germinação, transferi as mudas para o solo, cada planta em um único pote (longo dia 16/8 h, 22 ° C, umidade, 65%).
    3. Quando a haste é cerca de 1 cm de comprimento (25-30 dag), pulverize a inflorescência SAM com 10-50 µM Dex em H20 usando uma máscara de rosto. Para a indução e a imagem latente em fases posteriores do desenvolvimento, induzi SAMs de hastes mais ou brotações laterais.
      Nota: SAMs também podem ser induzida por paintbrushing a solução de Dex para evitar que gotas de pulverização. Use uma máscara quando Dex é aplicado por pulverização.
    4. 24-48 h após a indução, dissecar as SAMs e proceder à imagem (ver 4.3).
      Nota: Apenas un-induzida de plantas foram usadas para propagação para reduzir a probabilidade de silenciamento. Plantas em T2/T3 foram usadas para a imagem latente.

4. imagem de expressão de repórter em linhas de motorista de Arabidopsis .

  1. Raiz
    1. Transferência de mudas de placa para uma solução de iodeto (PI) de propidium µ g/mL 10 e Counter-manchá-las por 5 min.
    2. Colocar as raízes em um microscópio de imagem câmara (câmara de cultura do tecido 1-bem no vidro tampa II, consulte Tabela de materiais) e imagem-los usando um laser confocal microscópio com um 63 x objetivo de imersão de água (ver Tabela de materiais).
    3. Para visualizar a fluorescência de PI, use um comprimento de onda de excitação de 488 nm e coletar a emissão entre 590 e 660 nm. Para mTurquoise2 fluorescência usar 458 excitação nm e recolher das emissões entre 460 e 615 nm.
  2. Haste
    1. Executar a mão horizontal seções de corte de caules das plantas com uma lâmina de barbear, excisão de um segmento de aproximadamente 3 cm. fixar a haste com o dedo no lado oposto da seção desejada para cortar. Executar vários cortes bem sequencialmente, mas note que apenas as seções de uma posição semelhante no tronco devem ser comparadas.
    2. Após cada corte, mergulhe a lâmina de barbear em uma placa de Petri contendo água da torneira e recolher as seções de tronco. Mancha seções neste ponto ou montar diretamente em corrediças do microscópio.
    3. Para a coloração, preparar um 1 mL 250 µ g/ml de solução de PI de água em um pequeno prato de petri (ver Tabela de materiais). Mergulhe as seções por 5 min e enxágue-os em água. Transferi-los para corrediças do microscópio com pinça fina ou um pincel fino. Tome cuidado para não apertar as amostras com a lamela.
    4. Imagem de amostras usando um laser confocal microscópio com um 25 x mergulhando lente de imersão de água (ver Tabela de materiais). Diodo emissor de luz de uso 561 nm laser para excitar a fluorescência de PI e coletar de 570 a 620 nm. Uso de 405 nm para excitar o efetor de fluoróforo mTurquoise2 codificado pelo driver linha construções e coletar emissão de 425 a 475 nm.
  3. Atire meristema Apical
    1. Corte o caule 2 cm abaixo da ponta do tiro com a pinça. Segure o tronco com uma mão e use a pinça fina para remover os botões florais e grande primordia. Para remover o jovem primordia, consertar o SAM em uma posição ereta em uma placa de Petri contendo 3% de agarose. Use um binóculo e a pinça para remover primordia jovem perto do SAM. Como alternativa, usar uma cânula de injeção (consulte a Tabela de materiais) para cortar estes primordia.
    2. Mancha o SAM dissecado em uma solução de 250 µ g/mL PI para 5-10 min. executar diretamente por pipetagem algumas gotas de solução em cima do SAM preparado a coloração coloração ou transfira a amostra para um tubo preenchido com solução de coloração. Mantenha o SAM totalmente submerso durante o processo de coloração.
    3. Coloque o SAM manchado em um pequeno prato de petri (ver Tabela de materiais) com 3% agarose médio e cubra o SAM com DDQ2O.
    4. Imagem dissecado SAMs usando um laser confocal microscópio equipado com um 25 x mergulhando lente de imersão de água (ver Tabela de materiais).
    5. Diodo emissor de luz de uso 561 nm laser para excitar a fluorescência de PI e coletar de 570 a 620 nm. Uso de 405 nm para excitar a mTurquoise2 fluoróforo e coletar a emissão de 425 a 475 nm.
      Gravar imagem empilha abrangência 50 µm na direção-z com um tamanho de passo de 0,5 µm.
      Nota: SAM de imagem conforme descrito aqui requer um laser confocal vertical digitalização microscópio e uma lente (aqui, uma água mergulhando lente) com longa distância de trabalho.

Resultados

Geração de linhas de driver e efetoras através de clonagem GreenGate

O GreenGate clonagem sistema baseia-se na GoldenGate clonagem e uso a endonuclease de restrição do tipo IIS Bsaeu ou sua isoschizomer Eco31I. Como saliências produz a enzima distante do seu local de reconhecimento assimétrica, a composição de base das saliências podem ser livremente escolhido, que é a base forma a modularidade do sistema. Cada elemento gerado pelo PCR, por exemplo...

Discussão

Aqui, descrevemos os passos necessários para gerar e aplicar um conjunto de ferramentas abrangente e versátil para inducible, célula tipo específico trans-ativação. Atravessando a fronteira transportando cassettes effector sob controle do promotor pOp com linhas de motorista permite estudar os efeitos de expressão mis na geração F1, permitindo a rápida avaliação de perturbação genética em uma ampla gama de tipos de células. Alternativamente, effector construções podem ser usadas para t...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Trabalho em nossos laboratórios é suportado pelo Fundação de pesquisa alemã (DFG) subvenções WO 1660/6-1 (S.W.) e GR 2104/4-1 (T.G.) e SFB1101 (para T.G. e J.U.L) e por um Conselho Europeu de investigação consolidador conceder (PLANTSTEMS 647148) de T.G.  S.W. é suportado através de Emmy Noether comunhão da DFG através de Grant WO 1660/2.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
AmpicillinCarl Roth GmbH + Co. KGK029.1
ATPSigma-AldrichA9187
ChloramphenicolSigma-AldrichC1919
Column purificationQiagenQIAquick PCR Purification Kit (250)
Culture chamber for imagingSarstedt AG & Co. KG1-well tissue culture chamber, on cover glass II
DexamethasoneSigma-AldrichD4903
DMSOFisher Scientific, UKD139-1
Eco31IThermo Fisher ScientificFD0294
injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2)Sterican, Braun
KanamycinCarl Roth GmbH + Co. KGT832.2
Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectivLeica, Wetzlar, Germany
MS mediumDuchefa, Haarlem, NetherlandsM0221.0050
Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x  1.1 NA water immersion objectiveNikon, Minato, Tokyo, Japan
Petri dish 35/10 mmGreiner Bio-One GmbH, Germany627102
Petri dish 60/150 mmGreiner Bio-One GmbH, Germany628102
Petri dish 120/120/17Greiner Bio-One GmbH, Germany688102
Plant agarDuchefa, Haarlem, NetherlandsP1001
Plasmid extractionQiagenQIAprep Spin Miniprep Kit
Propidium iodide (PI)Sigma-AldrichP4170
RazorbladeClassic, Wilkinson Sword GmbH7005115E
Reaction tubesSarstedt AG & Co. KG72.690.001
Silwet L-77Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany
SpectinomycinAppliChem GmbH3834.001
SpectrophotometerThermo Fisher ScientificNanoDrop 2000c
SucroseCarl Roth GmbH + Co. KG4621.1
SulfadiazineSigma-AldrichS6387
TetracyclineAppliChem GmbH2228.0025
T4 Ligase 5 U/µlThermo Fisher ScientificEL0011
T4 Ligase 30 U/µlThermo Fisher ScientificEL0013

Referências

  1. Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. Transactivated and chemically inducible gene expression in plants. The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).
  2. Lampropoulos, A., et al. GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).
  3. Baroux, C., et al. Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).
  4. Craft, J., et al. New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis. The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).
  5. Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).
  6. Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco. The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).
  7. Picard, D. Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis. Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).
  8. Schurholz, A. K., et al. A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis. Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).
  9. Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).
  10. Di Laurenzio, L., et al. The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root. Cell. 86 (3), 423-433 (1996).
  11. Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127 (3), 595-603 (2000).
  12. Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).
  13. Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
  14. Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database. Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).
  15. . Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine Available from: https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html (2018)
  16. Huang, Y., et al. Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation. PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).
  17. Wallner, E. S., et al. Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation. Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).
  18. Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems. Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).
  19. Watanabe, Y., et al. Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls. Science. 350 (6257), 198-203 (2015).
  20. Yamaguchi, M., et al. VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system. Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).
  21. Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis. BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).
  22. Aoyama, T., Chua, N. H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).
  23. Decaestecker, W., et al. CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis. bioRxiv. , (2018).

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