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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, descriviamo la generazione e applicazione di un insieme di transgeniche di Arabidopsis thaliana linee espressione inducibile, tessuto-specifica abilitazione in tre meristemi principali, il meristema apicale di sparare, radice meristema apicale e il cambio.

Abstract

Espressione inducibile, tessuto-specifici è un importante e potente strumento per studiare la dinamica spazio-temporale di perturbazione genetica. Combinando la GreenGate flessibile ed efficiente con il collaudato e analizzato LhGR sistema (qui chiamato GR-LhG4) per l'espressione inducibile di clonazione, abbiamo generato un insieme di linee transgeniche di Arabidopsis che può guidare l'espressione di un effettore Cassetta in una gamma di tipi cellulari specifici nei tre meristemi stabilimento principale. A tal fine, abbiamo scelto il sistema GR-LhG4 precedentemente sviluppato basato su un fattore di trascrizione chimerica e un promotore di cognate pOp-tipo garantendo il controllo stretto sopra una vasta gamma di livelli di espressione. Inoltre, per visualizzare il dominio di espressione dove il fattore di trascrizione sintetica è attivo, un reporter fluorescente mTurquoise2 ER-localizzata sotto il controllo del promotore pOp4 o pOp6 è codificato in linee di driver. Qui, descriviamo i passaggi necessari per generare una linea driver o effettore e dimostrare come espressione specifica del tipo di cella può essere indotta e seguita nel meristema apicale sparare, radice meristema apicale e il cambio di Arabidopsis. Utilizzando linee di alcuni o tutti i driver, l'effetto specifico contesto di esprimere uno o molteplici fattori (effettori) sotto il controllo del promotore sintetico pOp può essere valutati rapidamente, ad esempio in piante F1 di un incrocio tra un effettore e multiplo linee di driver. Questo approccio è esemplificato dall'espressione ectopica di VND7, un fattore di trascrizione NAC in grado di indurre la deposizione di parete cella secondaria ectopica in maniera autonoma delle cellule.

Introduzione

Una limitazione importante nella biologia, nell'era della postegnomica è quello di decifrare il ruolo specifico del contesto di un determinato fattore o perturbazione genetica. Genetici costitutivi perturbazioni come approcci di funzione di perdita e guadagno di funzione permettono spesso solo endpoint analisi di processi di adattamento permanente, offuscando la distinzione tra effetti primari e secondari. Inoltre, funzioni specifiche di contesto possono essere mascherate o diluite dagli effetti su larga scala nei tessuti distanti o durante altre fasi di sviluppo. Inoltre, in casi estremi, letalità può precludere qualsiasi visione meccanicistica. Idealmente, per ovviare a questi problemi, si potrebbe analizzare l'effetto di perturbazione acuta genetica all'interno di un contesto specifico come uno specifico tipo cellulare in un modo risolta nel tempo. Per raggiungere questo obiettivo, strumenti genetici per inducibile, espressione di tipo specifico delle cellule sono necessarie1. Per fornire una risorsa per la rapida valutazione spazio-temporale della dinamica di una risposta a un determinato effettore, abbiamo combinato la facilità della clonazione fornito da GreenGate system2 con la provata efficacia del GR-LhG4 system3, 4,5,6. Abbiamo generato una serie di linee che esprimono il fattore di trascrizione chimerica che lhg4 fusa per il dominio di legame del ligando del ratto del corticoide del ricevitore (GR)7 sotto il controllo di ben caratterizzati cella tipo promotori specifici8. In condizioni di riposo, il fattore di trascrizione rimane di fuori del nucleo, come il dominio GR è vincolato il HSP90 citosolico. Con l'aggiunta di ligando sintetico desametasone (Dex), traslocazione nucleare è indotta e LhG4 medierà trascrizione delle cassette di espressione sotto il controllo di un promotore sintetico cognate pOp-tipo , come un reporter di mTurquoise2 tra le linee di driver per visualizzare il dominio di espressione dopo induzione.  Così, le linee di driver tecnicamente inoltre contengono una cassetta dell'effettore. L'attraversamento di un insieme di driver linee con una linea che trasportano una cassetta effettrici con, ad esempio, un gene di interesse sotto il controllo dello stesso tipo di pOp promotore così permette la rapida valutazione delle conseguenze acute o a lungo termine dell'espressione dell'effettore in una vasta gamma di tipi di cellule.

Qui, forniamo un protocollo che descrive le procedure necessarie per generare le linee pilota ed effettrici e dimostrare come espressione specifica del tipo di cella può essere indotta e seguita nel meristema apicale sparare, radice meristema apicale e il cambio di Arabidopsis. Per illustrare la bravura e la specificità di questo approccio, utilizziamo il fattore di trascrizione ben noto VND7 che è in grado di pilotare ectopically cella secondaria xilema-come agenti d'ispessimento parete9. Trattamento di F1 da un incrocio tra la riga di driver pSCR11 10,e la linea di effettori pOp6:VND7 conduce alla formazione ectopica xilema-come delle cellule nel fodero dell'amido staminali cellule di Arabidopsis .

Per facilitare la generazione di grandi assiemi di DNA richiesto per la costruzione di driver ed effettrici plasmidi di espressione, abbiamo usato il veloce ed efficiente GreenGate clonazione metodo2. Clonazione di GreenGate è basato sugli enzimi di limitazione di tipo II S come Eco31I o sua isoschizomer Bsami2. Questi enzimi tagliato a valle dei rispettivi siti di riconoscimento asimmetrica producendo strapiombi con varia composizione base. Incorporando Eco31I /Bsaho siti di restrizione nell'oligonucleotidi e allocare sbalzo specifiche sequenze di elementi del DNA, clonazione modulare è raggiunto, facilitare la generazione di grandi assiemi. Nel quadro GreenGate, moduli di DNA si dividono in categorie A-F basato sulla sequenza di sporgenza che fungono da adattatori e vengono assemblate in quell'ordine. Pertanto, il primer disegnati per amplificare il vostro prodotto desiderato dovrebbe essere secondo il modulo selezionato2 (Figura 1A). Se c'è un interno Eco31I /BsaI sito e la sequenza non è compatibile con i moduli di ingresso e destinazione di GreenGate, si può procedere senza mutagenizing, ma con minore efficienza. In alternativa, utilizzare mutagenesi sito-diretta per rimuovere Eco31I /Bsaho siti di restrizione facendo attenzione a non per cambiare gli amminoacidi in prodotti del gene.

Protocollo

Vettori e moduli possono essere ottenuti dal repository non-profit, Addgene (https://www.addgene.org).

1. clonazione usando GreenGate

  1. Disegno primer utilizzando gli strapiombi elencati nella tabella 1, sostituendo 'NNNN' con sequenze di adattatore tipo-specifico modulo elencati di seguito: avanti: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + 3 ´ sequenza specifica, inversa: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) + retromarcia complemento di 3 ´ sequenza specifica. Aggiungere le basi sottolineate per assicurare manutenzione del telaio di lettura.
    Sporgenze di modulo:
    Nota: In ambito predefinito GreenGate, sei moduli, A-F, sono assemblati con una dorsale di vettore di trasformazione impianto in plasmide un'espressione (Figura 1). In genere, il modulo A sarà porto sequenze promotrici, un B-modulo un N-terminale tag o "fittizio" sequenza6, un C-modulo di un CD, un tag di modulo a D un C-terminale o manichino, un modulo di un terminator e un F-modulo di una cassetta di resistenza per la selezione di transgenici piante. Adattatore per accoppiamento con altre unità preassemblate sono disponibili per uso invece di F modulo2.
  2. Amplificazione di PCR
    1. Amplificare la sequenza di interesse con i primer progettati da reazione a catena della polimerasi (PCR) secondo protocolli standard.
    2. Separare il prodotto PCR su un gel di agarosio. Accise e colonna purificare il frammento corretto utilizzando uno spot kit (Vedi Tabella materiali) secondo le istruzioni del produttore.
  3. Creazione del modulo di ingresso
    1. Digerire separatamente il vettore di modulo e il frammento della PCR (punto 1.2.) (Figura 1 A, B) con Eco31I/Bsaio uso 100-500 ng di DNA (vettore o frammento), 3 µ l 10 x buffer di digestione e di 5-10 U Eco31I in un tubo e portare il volume a 30 µ l con ddH2O.
    2. Mescolare delicatamente su e giù il pipettaggio e centrifugare brevemente a 1.000 x g. Incubare a 37 ° C su un blocco di calore per 15 min (o in seguito alla raccomandazione di tempo dell'enzima di restrizione acquistato).
    3. Dopo la digestione, colonna purificare ogni campione utilizzando un commerciale kit (Vedi Tabella materiali) e quantificare il DNA ottenuto da determinare la densità ottica a 260 nm (OD260) utilizzando uno spettrofotometro.
    4. Mix il 30 – 100 ng digerito insert e il vettore di 10 – 50 ng digerito pipettando su e giù più volte e incubare con 1 µ l ligasi T4 (5 U / µ l e 3 µ l 10 x T4 buffer di legatura in un volume totale di 30 µ l a temperatura ambiente per 1 h (seguendo la raccomandazione del fornitore ligasi T4) (Vedi Tabella materiali).
      Nota: Calcolare il vettore di modulo: destinazione di voce rapporto molare desiderata (ad esempio, 3:1) per la legatura a seconda della concentrazione e lunghezza degli inserti modulo voce.
    5. Per aumentare l'efficienza di trasformazione, calore inattivare la ligasi T4 incubando la reazione a 65 ° C per 20 min.
    6. Uso il prodotto di legatura per trasformare competente Escherichia coli cellule secondo i protocolli di laboratorio standard e diffusione i batteri sui piatti di agar completati con ampicillina (100 µ g/mL)
    7. Incubare la piastra con i batteri a 37 ° C per una notte.
    8. Schermo per colonie con il modulo di voce desiderata dalla PCR utilizzando i primer 86A1 (5 ′-GTTGTGTGGAATTGTGAGC-3 ') e 86A2 (5 ′-GTTTTCCCAGTCACGACG-3 ′) e condizioni standard di PCR della Colonia.
      Nota: Questa combinazione di primer è valida per tutti i moduli di ingresso come i primer si legano alla dorsale di vettore della voce.
    9. Selezionare singole colonie per l'isolamento di plasmide. Utilizzare la coltura liquida 2 mL LB completato con ampicillina (100 µ g/mL) e incubare per una notte in uno shaker di 37 ° C.
    10. Plasmidi isolati dalla coltura di liquida durante la notte con un Kit di mini-Prep o l'estrazione desiderata di protocollo (Vedi Tabella materiali).
    11. Per identificare i plasmidi con l'inserto corretto, eseguire analisi di restrizione enzimatica, ad esempio selezionando due enzimi che tagliano in modo univoco del suo inserto mescolando 200 ng di plasmide, 2 µ l 10 x buffer di digestione, 5-10 U di selezionati enzimi di restrizione e ddH2 O a 20 µ l.
    12. Sequenza i plasmidi selezionati utilizzando il primer 86A1 e 86A2 (v. punto 1.3.9).
  4. Creazione del modulo di destinazione:
    Nota: Per il plasmide di destinazione utilizzare la destinazione desiderata modulo pGGZ001, pGGZ002 o pGGZ0032 (Figura 1).
    1. In una provetta aggiungere e mescolare vettore di destinazione vuoto di 50 – 150 ng (pGGZ003, per esempio), 50-300 ng di ciascuno riempito il modulo di ingresso, 2 µ l 10 x buffer buffer di digestione, 1,5 µ l 10 mM ATP, 1 µ l della ligasi T4 (30 U / µ l), 5-10 µ l di U Eco31I e dH2O ad un volume totale di 20 µ l.
      Nota: Calcolare il vettore di modulo: destinazione di voce (ad esempio 3:1) rapporto molare desiderata per la legatura a seconda della concentrazione e lunghezza degli inserti modulo voce.
    2. Mescolare ed eseguire la reazione di GreenGate2 utilizzando un termociclatore PCR alternando 30 volte tra 37 ° C per 5 min e 16 ° C per 2 min, seguita da singoli passaggi di 5 min a 50 ° C e 5 min a 80 ° C.
    3. Per aumentare l'efficienza, aggiungere 1 µ l della ligasi T4 (30 U / µ l) e 1,5 µ l 10 mM ATP alla reazione e incubare per 1 h a temperatura ambiente, seguita da inattivazione termica di T4 DNA ligasi a 65 ° C per 20 min.
    4. Utilizzare la reazione di legatura per trasformare competente e. coli e diffondere i batteri sui piatti di agar completati con la spectinomicina appropriato agente selettivo (50 µ g/mL).
    5. Incubare il trasformato e. coli sulla piastra a 37 ° C per una notte.
    6. Per confermare la trasformazione, ri-striscia ognuna delle colonie singole selezionate su spectinomicina (50 µ g/mL) e ampicillina (100 µ g/mL) contenenti piastre, rispettivamente. Utilizzare solo le colonie che crescono su spectinomicina ma non su piastre di ampicillina.
    7. Incubare le colonie di e. coli durante la notte a 37 ° C.
    8. Selezionare singole colonie per l'isolamento del plasmide. Utilizzare la coltura liquida 2 mL LB completato con spectinomicina (50 µ g/mL) e incubare per una notte in uno shaker di 37 ° C.
    9. Isolare i plasmidi corrispondenti con un mini-Prep Kit (Vedi Tabella materiali).
    10. Verifica di analisi di restrizione enzimatica (Vedi 1.3.12.) e sequenza selezionata costrutti positivi utilizzando primer 88 3 (5 ′-ACCTCTCGGGCTTCTGG-3 '), 88 4 (5 ′-CCTTTTTACGGTTCCTG-3 '). Se l'inserto non può essere completamente sequenziato con questi iniettori, disegnare primers interna per il sequenziamento.
      Nota: Per identificare i cloni con il numero corretto di pOp ripetere sequenze (vedi discussione), il primer pOp6 (pOp6_F, 5 ′-TGCATATGTCGAGCTCAAGAA-3 '; e pOp6r, 5 ′-CTTATATAGAGGAAGGGTCTT-3 ') che si legano nella breve che fiancheggiano sequenze utilizzabile per l'amplificazione di PCR e successiva elettroforesi per discriminare da dimensioni.
  5. Creazione di sovra intermedio
    1. Per combinare due set indipendenti di moduli di ingresso, come richiesto per la generazione il GR-LhG4 driver linee con cassetta integrata reporter-effector, prima generazione due plasmidi intermedio, chiamate supermoduli2, prima di assemblare l'espressione finale plasmide in pGGZ001 o pGGZ003.
    2. Assicurarsi di aggiungere alla fine del primo sovra e adattatore H-all'inizio della seconda sovra (quelli servono come connessioni tra due costrutti) come descritto2adattatore F-H.
      Nota: Solo il modulo intermedio di pGGN000 trasporta la cassetta di resistenza. Per generare il plasmide di espressione, è necessario eseguire la reazione di GreenGate con il vettore di destinazione e i supermoduli intermedi pGGN000 e pGGM000. In alternativa, mescolare vettore di destinazione, pGGN000 sovra intermedi e i restanti moduli singoli per eseguire la reazione di GreenGate2. Il secondo metodo è meno efficiente di quella precedente, ma può essere più veloce.
    3. Per creare una sovra pGGM000/pGGN000, miscelare 1,5 µ l (100-300 ng / µ l) di ciascuno dei moduli di ingresso con 1 µ l (30 ng / µ l) intermedio vettore vuoto (pGGM000 o pGGN000), 2 µ l x 10 digestione buffer, 1,5 µ l 10 mM ATP, 1 µ l della ligasi T4 (30 U / µ l) e 5-10 U Eco31I in un volume totale di 20 µ l.
      Nota: Calcolare il vettore di modulo: destinazione di voce rapporto molare desiderata (ad esempio, 3:1) per la legatura a seconda della concentrazione e lunghezza degli inserti modulo voce
    4. Mescolare ed eseguire la reazione di GreenGate come descritto al punto 1.4.2
    5. Per aumentare l'efficienza, aggiungere 1 µ l della ligasi T4 e 1,5 µ l ATP (10 mM) e incubare per 1 h a temperatura ambiente, seguita da inattivazione termica a 65 ° C per 20 min.
    6. Utilizzare 10 µ l di reazione di legatura per trasformare competente e. coli e striscia su piastre contenenti kanamicina (50 µ g/mL).
    7. Eseguire incubazione overnight del trasformato Escherichia coli sulla piastra a 37 ° C.
    8. Ri-striscia ognuna delle colonie singole selezionate su kanamicina (50 µ g/mL) e ampicillina (100 µ g/mL) contenenti piastre, rispettivamente.
    9. Eseguire una notte incubazione delle colonie di e. coli sulla piastra a 37 ° C.
    10. Selezionare singole colonie che crescono solo su kanamicina ma non su ampicillina per l'isolamento del plasmide. Utilizzare la coltura liquida 2 mL LB completato con kanamicina (50 µ g/mL) e incubare per una notte in uno shaker di 37 ° C.
    11. Isolare i plasmidi corrispondenti utilizzando un mini-prep kit (Vedi Tabella materiali).
    12. Verifica i plasmidi di analisi di restrizione enzimatica (Vedi 1.3.12). e confermare mediante sequenziamento utilizzando primer 87E2 (a 5 minuti-AGGCATCAAACTAAGCAGAAG-3 ´) e 87E3 (a 5 minuti-CGTTTCCCGTTGAATATGGC-3 ´) ricottura per la spina dorsale di pGGM000/pGGN000. Se l'inserto non può essere completamente sequenziato con questi iniettori, disegnare primers interna per il sequenziamento.
      Nota: Se la clonazione nei vettori pGGM000 o pGGN000 ha esito negativo, una possibile soluzione è per digerire il pGGM000 o pGGN000 con Eco31I, correre su un gel e purificare dal gel il frammento di spina dorsale (circa 2000 bp) pGGM000 o pGGN000 senza il ccdB cassetta (circa 1400 bp). Quindi procedere normalmente con la reazione di legatura.
  6. Trasformare un ceppo di pSOUP+ di a. tumefaciens (ad es. ASE), come l'origine di pSa di replicazione (ori r. tum.) nei vettori di destinazione richiedono la presenza del plasmide helper pSOUP12. Striscia fuori batteri su piastre LB contenenti cloramfenicolo (34 µ g/mL), kanamicina (50 µ g/mL), spectinomicina (50 µ g/mL) e la tetraciclina (12,5 µ g/mL). Incubare il trasformato a. tumefaciens sulla piastra in un incubatore a 28 ° C per due o tre giorni.

2. generazione di piante transgeniche di Arabidopsis

  1. Trasformazione di Arabidopsis thaliana.
    Nota: Trasformare piante di a. thaliana secondo Zhang et al., 200613.
  2. Selezione di linee transgeniche.
    1. Per selezionare le piante trasformate, utilizzare lo schema di selezione utilizzato al GABI-Kat14 per resistenza a sulfadiazina15.
    2. Per selezionare linee stabili con un evento di integrazione possibile singolo, scegliere quelli a generazione T2, che mostrano il rapporto di segregazione di 3:1 nel marcatore di resistenza. Propagare queste linee T3 generazione e selezionare le piante omozigoti per il gene di resistenza. In alternativa, eseguire un'analisi Southern Blot o standard quantitativi Real-Time PCR (SA-qPCR)16 per selezionare linee singolo inserimento.

3. induzione di trans-attivazione in Arabidopsis driver linee

  1. Radice
    1. Per testare reporter espressione in a. thaliana driver linee generate attraverso i passaggi 1 e 2, sterilizzare i semi come descritto di seguito.
      1. Aggiungere 0,5-1,0 mL di 70% etanolo + 0,01% detergente non ionico per circa 100 semi (20 mg) in una provetta di reazione da 1,5 ml e Inverti il tubo un paio di volte. Rotazione verso il basso a 1000 x g per 15 s e aspirare il supernatante.
      2. Aggiungere 0,5-1,0 mL di etanolo assoluto. Capovolgendo il tubo, spin giù per 1.000 x g per 15 s e scartare il surnatante.
      3. Aggiungere 0,5-1,0 mL di etanolo assoluto e Inverti il tubo t un paio di volte, poi girare giù a 1.000 x g per 15 s e scartare il surnatante.
      4. Consentire semi asciugare all'interno della cappa. Se i semi stanno per essere stratificato in tubi di continuare con il passaggio 3.1.1.6.
      5. Aggiungere 0,5-1,0 mL di acqua sterile e Inverti il tubo un paio di volte. Rotazione verso il basso a 1.000 x g per 15 s e scartare il surnatante.
      6. Aggiungere 0,5-1,0 mL di acqua sterile e Inverti il tubo più volte. Rotazione verso il basso a 1.000 x g per 15 s e scartare il surnatante.
      7. Aggiungere 0,5-1,0 mL di acqua sterile.
    2. Preparare mezzo-forza Murashige e Skoog medi, pH 5,8 e aggiungere 0,9% pianta agar e 1% di saccarosio. Dopo la sterilizzazione in autoclave aggiungere desametasone (Dex), sciolto in DMSO, ad una concentrazione finale di 10-30 µM a piastre a induzione e una pari quantità di DMSO per placche di comando, rispettivamente.
    3. Mettere i semi per l'imaging di radice sui piatti e li stratificare per 48 h nel buio e freddo (4 ° C).
    4. Mettere le piastre in posizione verticale in un incubatore di pianta (lunga giornata (16/8 h), 22 ° C, umidità, 65%) e farle crescere per cinque giorni.
    5. Cinque giorni dopo la germinazione (dag), immagine le piantine utilizzando la microscopia a scansione laser confocale.
  2. Stelo
    1. Sterilizzare i semi come descritto al punto 2.1.1. e mettere i semi su ½ MS, agar pianta 0,9% e 1% saccarosio piastre. Stratificare per 48 h nel buio e freddo (4 ° C).
    2. Sei o sette giorni dopo la germinazione, trasferire le piantine al suolo, ogni pianta in un vaso singolo (lunga giornata (16/8 h), 22 ° C, umidità, 65%).
    3. Indurre, trans-attivazione in fusti da annaffiare con Dex o soluzione finto, o immergendo le piante in Dex o finto, rispettivamente.
    4. Per l'irrigazione, utilizzare una soluzione di Dex 25 µM in acqua preparata da uno stock di 25 mM Dex disciolto in etanolo. Acqua ogni 2-3 giorni fino a quando il tempo desiderato di induzione.
    5. Per immersione, preparare un becher da 1 litro, 750 mL di acqua contenente 0,02% del silwet L-77 con 25 µM di Dex o quantità equivalente di DMSO per il Dex e finto trattamento, rispettivamente. Immergere le singole piante per 30 s nell'induzione o nella soluzione finta. Ripetere ogni 2-3 giorni fino a quando il tempo desiderato di imaging.
      Nota: Dopo l'immersione, le piante dovrebbero essere mantenute nell'alta umidità per un'ora.
  3. Sparare il meristema apicale (SAM)
    1. Sterilizzare i semi come descritto al punto 2.1.1. Preparare piatti con ½ MS, agar pianta 0,9% e 1% saccarosio medie e mettere semi sui piatti. Conservare le piastre per due giorni nel buio e freddo per stratificazione.
    2. Mettere le piastre in posizione verticale in un incubatore di pianta. Sei o sette giorni dopo la germinazione, trasferire le piantine al suolo, ogni pianta in un vaso singolo (lunga giornata (16/8 h), 22 ° C, umidità, 65%).
    3. Quando il gambo è lungo circa 1 cm (25-30 dag), spruzzare l'infiorescenza SAM con 10-50 µM Dex in H20 che porta una maschera. Per induzione e l'imaging nelle fasi successive di sviluppo, indurre SAMs di steli più lunghi o germogli laterali.
      Nota: SAMs può anche essere indotto da paintbrushing la soluzione di Dex per evitare gocce irrorate. Utilizzare una maschera quando Dex è applicato a spruzzo.
    4. 24-48 h dopo l'induzione, sezionare il SAMs e procedere a imaging (vedere 4.3).
      Nota: Solo le piante non-indotte sono state utilizzate per la propagazione per ridurre la probabilità di silenziamento genico. Piante in T2/T3 sono stati utilizzati per l'imaging.

4. imaging dell'espressione di reporter in Arabidopsis driver linee.

  1. Radice
    1. Trasferimento piantine dal piatto per una soluzione di ioduro (PI) di 10 µ g/mL propidio e anti-macchia li per 5 min.
    2. Mettere le radici in un microscopio imaging camera (camera di coltura del tessuto 1-pozzetto vetro di copertura II, Vedi Tabella materiali) e la loro immagine utilizzando un laser confocale a scansione microscopio con un 63 x obiettivo a immersione in acqua (Vedi Tabella materiali).
    3. Per visualizzare la fluorescenza di PI, utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm e raccogliere delle emissioni tra il 590 e 660 nm. Per mTurquoise2 fluorescenza utilizzare 458 eccitazione di nanometro e raccogliere emissione tra 460 e 615 nm.
  2. Stelo
    1. Eseguire mano orizzontale tagliata sezioni dei fusti delle piante con una lama di rasoio, asportando un segmento di circa 3 cm. Fissare lo stelo con il dito sul lato opposto della sezione desiderata per tagliare. Eseguire tagli di precisione diversi in sequenza, ma si noti che devono essere confrontate solo sezioni da una posizione simile nel gambo.
    2. Dopo ogni taglio, immergere la lametta in una piastra Petri contenente acqua di rubinetto e raccogliere le sezioni di gambo. Macchia sezioni a questo punto o montare direttamente su vetrini da microscopio.
    3. Per la colorazione, preparare un 1 mL di 250 µ g/mL di soluzione di PI di acqua in un piccolo piatto di petri (Vedi Tabella materiali). Immergere le sezioni per 5 min e sciacquarli in acqua. Trasferirli su vetrini da microscopio con una pinzetta o un pennello fine. Fare attenzione a non spremere i campioni con il vetrino coprioggetti.
    4. Immagine di campioni utilizzando un laser confocale scansione microscopio con un 25 x immersione obiettivo d'immersione in acqua (Vedi Tabella materiali). Luce laser di uso 561 nm per eccitare la fluorescenza di PI e raccogliere da 570 a 620 nm. Uso 405 nm per eccitare l'effettore del fluoroforo mTurquoise2 codificato dal driver linea costrutti e raccogliere emissione da 425 a 475 nm.
  3. Sparare il meristema apicale
    1. Tagliare il gambo 2 cm sotto la punta di sparare con il forcipe. Tenere il gambo in una mano e utilizzare una pinzetta per rimuovere i germogli di fiore e primordia grande. Per rimuovere il giovane primordia, difficoltà il SAM in posizione verticale in una piastra Petri contenente agarosio al 3%. Utilizzare un binocolo e pinze per rimuovere giovane primordia vicino SAM. In alternativa, utilizzare una cannula di iniezione (vedere Tabella materiali) per tagliare questi primordi.
    2. Macchiare il SAM dissecato in una soluzione di 250 µ g/mL PI per 5-10 minuti eseguire colorazione sia direttamente tramite pipettaggio poche gocce di soluzione in cima il SAM preparato la macchiatura o trasferire il campione in una provetta riempita con soluzione di colorazione. Tenere il SAM completamente sommersa durante la procedura di colorazione.
    3. Inserire il SAM macchiato in un piccolo piatto di petri (Vedi Tabella materiali) 3% medio di agarosio e coprire il SAM con ddH2O.
    4. Immagine dissecato SAMs utilizzando un laser confocale scansione microscopio equipaggiato con un 25 x immersione obiettivo d'immersione in acqua (Vedi Tabella materiali).
    5. Luce laser di uso 561 nm per eccitare la fluorescenza di PI e raccogliere da 570 a 620 nm. Uso 405 nm per eccitare l'emissione di fluoroforo e raccogliere mTurquoise2 da 425 a 475 nm.
      Registrare la serie di immagini che coprono 50 µm in direzione z con un passo di 0,5 µm.
      Nota: SAM imaging come descritto qui richiede un verticale laser confocale scansione microscopio e una lente (qui, un acqua immersione lente) con lunga distanza di lavoro.

Risultati

Generazione di driver ed effettrici linee attraverso la clonazione GreenGate

La GreenGate clonazione sistema si basa su GoldenGate clonazione e uso l'endonucleasi di restrizione di tipo IIS Bsaio o la sua isoschizomer Eco31I. Come l'enzima produce sporgenze lontane dal suo sito di riconoscimento asimmetrica, la composizione di base degli strapiombi possono essere liberamente scelto, che è la base forma la modularità del sistema. Ogni elemento di PCR-generat...

Discussione

Qui, descriviamo i passaggi necessari per generare e applicare un toolkit completo e versatile per inducibile, cella tipo specifico trans-attivazione. Linee trasporto cassette effettrici sotto il controllo del promotore pOp con driver linee incrociate permette di studiare gli effetti di mis-espressione nella generazione F1, consentendo la rapida valutazione genetica perturbazione in una vasta gamma di tipi di cellule. In alternativa, effettore costrutti possono essere utilizzate per trasformare driver l...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Lavoro nei nostri laboratori è sostenuto dalla Fondazione di ricerca tedesca (DFG) sovvenzioni WO 1660/6-1 (a S.W.) e GR 2104/4-1 (a T.G.) e SFB1101 (da T.G. e J.U.L) e da un Consiglio europeo della ricerca consolidator concedere (PLANTSTEMS 647148) a T.G.  S.W. è supportato attraverso il Emmy Noether Fellowship del DFG attraverso Grant WO 1660/2.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
AmpicillinCarl Roth GmbH + Co. KGK029.1
ATPSigma-AldrichA9187
ChloramphenicolSigma-AldrichC1919
Column purificationQiagenQIAquick PCR Purification Kit (250)
Culture chamber for imagingSarstedt AG & Co. KG1-well tissue culture chamber, on cover glass II
DexamethasoneSigma-AldrichD4903
DMSOFisher Scientific, UKD139-1
Eco31IThermo Fisher ScientificFD0294
injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2)Sterican, Braun
KanamycinCarl Roth GmbH + Co. KGT832.2
Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectivLeica, Wetzlar, Germany
MS mediumDuchefa, Haarlem, NetherlandsM0221.0050
Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x  1.1 NA water immersion objectiveNikon, Minato, Tokyo, Japan
Petri dish 35/10 mmGreiner Bio-One GmbH, Germany627102
Petri dish 60/150 mmGreiner Bio-One GmbH, Germany628102
Petri dish 120/120/17Greiner Bio-One GmbH, Germany688102
Plant agarDuchefa, Haarlem, NetherlandsP1001
Plasmid extractionQiagenQIAprep Spin Miniprep Kit
Propidium iodide (PI)Sigma-AldrichP4170
RazorbladeClassic, Wilkinson Sword GmbH7005115E
Reaction tubesSarstedt AG & Co. KG72.690.001
Silwet L-77Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany
SpectinomycinAppliChem GmbH3834.001
SpectrophotometerThermo Fisher ScientificNanoDrop 2000c
SucroseCarl Roth GmbH + Co. KG4621.1
SulfadiazineSigma-AldrichS6387
TetracyclineAppliChem GmbH2228.0025
T4 Ligase 5 U/µlThermo Fisher ScientificEL0011
T4 Ligase 30 U/µlThermo Fisher ScientificEL0013

Riferimenti

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