הדמיה חיה וניתוח של התכווצויות שרירים בתוך העובר דרוזופילה

Summary

כאן, אנו מציגים שיטה להקליט התכווצויות שרירים עובריים בעוברי דרוזוהילה בצורה לא פולשנית ומונחה פרטים.

Abstract

התכווצויות שרירים מתואמת הם צורה של התנהגות קצבית לראות מוקדם במהלך הפיתוח של העוברים דרוסופילה . מעגלי משוב חושי סנסוריים נדרשים לשלוט באופן פעולה זה. אי הפקת דפוס קצבי של התכווצויות יכול להיות מעיד על חריגות נוירולוגיות. בעבר גילינו כי פגמים בחלבון O-mannosyזילציה, שינוי חלבון posttranslational, להשפיע על מורפולוגיה אקסון של נוירונים חושים ולגרום התכווצויות שרירים מתואמת נורמלי עוברים. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה יחסית להקלטה וניתוח התבנית של התכווצויות שרירים הפריסטלטיות על ידי הדמיה חיה של עוברי שלב מאוחר עד לנקודת הבקיעה, אשר השתמשנו כדי לאפיין את התכווצות שרירים מרשם של חלבון . או-מנסילאז מוטציות נתונים שהתקבלו מהקלטות אלה ניתן להשתמש כדי לנתח גלי התכווצות שרירים, כולל תדירות, כיוון התפשטות ומשרעת יחסי של התכווצויות שרירים בחלקי גוף שונים. בדקנו גם את תנוחת הגוף ואת היתרון של סמן פלורסנט הביע במיוחד השרירים כדי לקבוע במדויק את מיקומו של העובר באמצע הקו. גישה דומה יכולה להיות מנוצל גם לחקר התנהגויות שונות במהלך הפיתוח, כגון העובר מתגלגל והבקיעה.

Introduction

התכווצות שרירים פריסטלטית היא התנהגות מוטורית קצבית דומה הליכה ושחייה בבני אדם^1,2,3. התכווצויות שרירים עובריים לראות Drosophila ילה עוברים בשלב מאוחר מייצגים דוגמה של התנהגות כזאת. דרוזופילה היא אורגניזם מודל מצוין לחקר תהליכים התפתחותיים שונים, משום שפיתוח עובריים בדרוסופילה מאופיין היטב, קצר יחסית, וקל לניטור. המטרה הכוללת של השיטה שלנו היא להקליט בקפידה ולנתח את דפוס ההתכווצות של התכווצות והרפיה של השרירים העובריים. השתמשנו בגישה פשוטה, לא פולשנית המציעה הדמיה מפורטת, הקלטה וניתוח של התכווצויות שרירים. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד אחרים בתהליכים vivo, כגון מתגלגל עובריים לראות העוברים בשלב מאוחר רק לפני הבקיעה. במחקרים קודמים, התכווצויות שרירים עובריים נותחו בעיקר במונחים של תדר וכיוון^1,2. על מנת לאמוד את היקף יחסי של הצירים כפי שהם התקדמות לאורך ציר הגוף בכיוון הקדמי או האחורי, השתמשנו העוברים ביטוי GFP במיוחד השרירים. ניתוח זה מספק דרך כמותית יותר לנתח התכווצויות שרירים כדי לחשוף כיצד תנוחת הגוף העוברים נשמרת במהלך סדרה של גלי הפריסטטיים של התכווצויות שרירים.

התכווצויות שרירים פריסטלטיות נשלטות על ידי מחולל תבנית מרכזית (CPG) מעגלים ותקשורת בין נוירונים במערכת העצבים ההיקפית (היקפית), מערכת העצבים המרכזית (cn), והשרירים^4,5. אי הפקת התכווצויות שרירים נורמלית הפריסטלטית יכול להוביל לפגמים כגון כישלון בצוהר² ו זחל נורמלי תנועה⁶ והוא יכול להיות מעיד על חריגות נוירולוגיות. הדמיה חיה של גלים הפריסטטיים של התכווצות שרירים וניתוח מפורט של פנוטיפים התכווצות יכול לעזור לחשוף מנגנונים פתוגניים הקשורים פגמים גנטיים המשפיעים על השרירים ומעגלים עצביים מעורב תנועה. לאחרונה השתמשנו בגישה זו כדי לחקור מנגנונים כי התוצאה של פיתול יציבה הגוף פנוטיפ של pפרוטאין O-mannosyltבראנפראז (pomt) מוטציות⁷.

החלבון O-mannosylation (פום) הוא סוג מיוחד של שינוי פוסט-ממדי, שם מתווסף הסוכר סרין או שאריות של חלבונים של מסלול הפרשה^8,9. פגמים גנטיים ב פום לגרום dystrophies שרירים מולדים (CMD) בבני אדם^10,11,12. בדקנו את המנגנונים הסיבתי של מחלות אלו באמצעות דרוסופילה כמערכת מודל. מצאנו כי עוברים עם מוטציות ב Drosophila ילה חלבון O-mannosyltransferase גנים POMT1 ו POMT2 (הידוע הבטן מסובב (rt) ו מעוות (tw)) להראות מ עקירה ("סיבוב") של חלקי הגוף, אשר התוצאה היא יציבה גוף⁷. מעניין, פגם זה בד בבד עם השלב ההתפתחותי כאשר התכווצויות שרירים הפריסטלטיות להיות בולטות⁷.

מאז יציבה גוף חריג העוברים מוטציה פום מתעוררת כאשר השרירים והאפידרמיס הם כבר הקימו וגלים הפריסטלטיים של התכווצויות שרירים מתואמת החלו, שיערו כי יציבה הגוף לא נורמלי יכול להיות תוצאה של שריר נורמלי התכווצויות במקום פגם שריר או/ו אפידרמיס מורפולוגיה⁷. CMDs יכול להיות משויך עם התכווצויות שרירים חריגים ופגמים יציבה¹³, ובכך ניתוח של התנוחה פנוטיפ ב- drosophila pomt מוטציות עשוי להבהיר מנגנונים פתולוגיים הקשורים dystrophies שרירי . על מנת לחקור את היחסים בין הגוף הפנוטיפ של מוטציות מוטנטים וליקויים אפשריים בגלים הפריסטטיים של התכווצויות שרירים, החלטנו לנתח התכווצויות שרירים בפירוט באמצעות לחיות גישת הדמיה.

הניתוח שלנו של גלי התכווצות הפריסטטיות בעוברים הדרוזופילה חשף שני מצבי התכווצות נפרדים, המיועדים כסוג 1 ומסוג 2 גלים. מסוג 1 גלים הם גלים פשוטים הפצת מן הקדמי לאחורי או להיפך. הגלים מסוג 2 הם גלים ביפאטיים היוזמים בקצה הקדמי, מופצים באמצע הדרך בכיוון האחורי, מסתיימים לרגע, יוצרים כיווץ סטטי זמני, ולאחר מכן, במהלך השלב השני, הם נסחפים באמצעות כיווץ פריסטי המחפיץ . קדימה מהקצה האחורי פראי טיפוס העוברים בדרך כלל ליצור סדרה של התכווצויות המורכבת של כ 75% סוג 1 ו -25% סוג 2 גלים. לעומת זאת, עוברי מוטציה של Pomt ליצור סוג 1 ו 2 גלים בערך שוויון תדרים יחסית.

הגישה שלנו יכול לספק מידע מפורט לניתוח כמותי של התכווצויות שרירים העובר מתגלגל⁷. גישה זו יכול גם להיות מותאם לניתוח של התנהגויות אחרות הקשורות התכווצויות שרירים, כגון בקיעה וזחילה.

Protocol

1. הכנה

1. להכין כלוב זבוב על ידי הפיכת כ 50 חורים בתוך 100 mL קיבולת פלסטיק תלת-ממדי הפינה באמצעות מחט חם 25 גרם (ראה טבלת חומרים).
2. להכין 60 mm x 15 מ"מ מנות פטרי עם מיץ תפוחים-אגר (3% אגר ו 30% מיץ תפוחים).
3. הכינו ממרח שמרים טריים על ידי ערבוב גרגרי שמרים יבשים ומים. הפיצו את שמרים להדביק על לוחות תפוח אגר כדי להגדיל את הטלת ביצים.
4. הרדים על 50-60 זבובים (להשתמש במספר שווה של זכרים ונקבות) על CO₂ ולשים אותם בכלוב לטוס.
   הערה: שימוש בחלק מוגבר של הנקבות (עד ~ 2:1 יחס של נקבות: זכרים) עשוי לסייע להגדיל את כמות הביצים הונחו עבור כמה גנוטיפים.
5. לצרף צלחת התפוח אגר מיכל פטרי עם שמרים להדביק את כלוב לטוס הדוק ולאטום אותו עם חימר דוגמנות. ודא שהוא חתום בכל הפינות.
6. המתן עד שהזבובים יתעוררו מהרדמה ולאחר מכן הפוך את הכלוב כך שצלחת פטרי נמצאת כעת בתחתית. הכניסו את הכלוב לתוך אינקובטור עם טמפרטורה מבוקרת (25 ° c) ולחות (60%).
7. אפשר זבובים להטיל ביצים עבור 2-3 h, להחליף את צלחת התפוח עם אחד טרי, ולתת את הצלחת עם ביצים גיל עבור 19-20 h בחממה.
   הערה: לפני השלב לעיל, זבובים חייב להיות מסונכרן כדי להקל על אוסף של שלב 17e-f (19-21 h ח. י.) עוברים. זה יכול להיות מושגת על ידי העברת זבובים לכלוב עם הצלחת טרי שמרים-תפוח לוחית אגר 3-4 פעמים עבור 12 h (פעם בכל 3-4 h). שמירה על זבובים בסביבה מבוקרת האור במעגל (LD מחזור) יכול גם לעזור עם איסוף אוכלוסיה מסונכרנת של עוברים, אבל זה לא היה חיוני בניסויים שלנו.

2. אוסף העוברים

1. בזהירות לאסוף עוברים עם מכחול רטוב למקם אותם בצלחת זכוכית איסוף מלא 1x PBS.
2. בחר את העוברים שלהם הקנה הנשימה שלהם מלא אוויר. דלקת הקנה מלאת האוויר מצביעה על כך שעוברים הגיעו לשלב 17, והתכווצויות השרירים הפריסטלטיות שלהם היו אמורות להתחיל. קנה הנשימה הופך להיות גלוי בבירור כאשר הם מלאים אוויר, אשר יכול לשמש כסמן עבור שלב 17.
3. מקום מיצים התפוח אגר הלוח על שקופית זכוכית והעברת עוברים בזהירות מ-PBS אל לוח. לסדר את העוברים. עם הצד הגחוני שלהם למעלה
   הערה: הצדדים הגהים של העוברים יכולים להיות מכובדים על ידי מיקום של תוספות בקליפת הברזל.
4. להפוך גבול שעווה מלבני על שקופית זכוכית אחרת באמצעות עט שעווה (ראה טבלת חומרים).
5. מניחים סרט דביק דו צדדי בתוך הגבול הזה ובעדינות להרים את העוברים על ידי הנמכת שקופית זו אל לוח אגר. הפעילו לחץ עדין כדי לוודא שעוברים נדבקים בקלטת היטב, כאשר הצד השני שלהם למעלה. במקרה הצורך, ניתן לגלגל את העוברים על הקלטת כדי לתקן את האוריינטציה שלהם. האם כל המניפולציות בעת ניטור עוברים תחת מיקרוסקופ ניתוח.
6. לכסות עוברים עם 1x PBS עבור הדמיה חיה של התכווצויות שרירים.
   הערה: כמה הליכים המתוארים לעיל קשורים לטכניקות בסיסיות של דרוזוהילה המשמשות במחקרים רבים. תיאורים מפורטים יותר של טכניקות משותפות של דרוזופילה ניתן למצוא במקום אחר¹⁴.

3. הקלטת עוברים

1. לבצע הדמיה חיה של העוברים רכוב על מיקרוסקופ אפיפלרליים עם פונקציה לשגות זמן מצלמה דיגיטלית עם מסנני פליטה מתאים (ראה טבלה של חומרים) באמצעות עדשת המים 10x היעד טבילה.
   הערה: כאן השתמשנו עוברים המבטאים GFP בשרירים. סמנים פלורסנט אחרים עם אור עירור מתאים וערכות מסנן פליטה יכול לשמש גם (למשל, עבור זיהוי tdTomato, ניתן להשתמש במסנן עוצמת הצבע ET-561 הגדרת עירור ופליטה סביב האופטימלי 554 nm ו 581 nm, בהתאמה).
2. בצע הקלטת וידאו חיה של עוברים באמצעות תוכנה מתאימה (ראה טבלת חומרים) עבור כ 1-2 h עם שיעור הרכישה של 4 מסגרות/s.
   הערה: כדי לנתח גלגול של העובר המתפתח בתוך המעטפת שלה, עוברים ללא ביטוי של סמנים פלורסנט ניתן להשתמש. לשם כך, האור רגיל המשודר תאורה ללא מסננים ספקטרלי מוחל על התנועה העובר להמחיש בתוך המעטפת (ראה סרט 2).

4. ניתוח ההקלטות

1. לייצא את הווידאו המוקלט ישירות לתוך תמונה J עבור ניתוחים נוספים (g., כמו קבצי AVI).
2. ב-ImageJ, חתוך את הקלטות הווידאו לגודל העוברים הבודדים על-ידי ציור תיבה סביב כל עובר ולאחר מכן לחיצה על התמונה > יבול. זה מפחית במידה ניכרת את הגודל של קבצי וידאו מבלי להשפיע על הרזולוציה שלה ומקלה על הניתוח שלהם.
3. סובב תמונות שנחתכו כדי להשיג מיקום אנכי של קו האמצע ביחס למסך, על-ידי לחיצה על תמונה ≫ שינוי צורה > סובב.
   הערה: בחירת תצוגה מקדימה במהלך תהליך זה תספק הדרכה לסיבוב, הצגת קווי רשת כדי להבטיח מיקום אנכי של קו האמצע.
4. אנליזה כמותית של העובר מתגלגל :
   הערה: לניתוחי מרחק, ודא תחילה שהתמונות כוללות מידע קנה מידה. ניתן להוסיף את קנה המידה של התמונה על-ידי בחירה באפשרות ' נתח ≫ קביעת קנה מידה' ולאחר מכן הזנת המרה של פיקסלים למרחקים, לדוגמה, מיקרומטר
   1. סמן את המיקום של אחד או את שני הגרניים במסגרת הראשונה של הווידאו בנקודה באמצע בין הקצוות האחוריים והקדמי. לחץ על לנתח > כלים > רועי מנהל ולהקליט מיקום זה כמו פרוסה מספר y קואורדינטות-x קואורדינטות ידי ציור תיבת של כ 7 יקרומטר על ידי 7 יקרומטר מסביבו והקלדת t על המקלדת. ודא שבעת הקלדת t, אזור מעניין נבחר בווידאו. לחלופין, בחר בכרטיסיה הוספה (t) במנהל הROI כדי לתעד את מיקום קנה הנשימה במקום להקליד את הפקודה.
      הערה: אזור העניין יכול להשתנות בצורה או בגודל בהתאם לאזור העובריים או לאירוע התפתחותי שנלמד.
   2. סמן את המיקום של אותו אזור של קנה הנשימה לאחר כל התכווצות פריסטלטית. מדוד את המרחק מהמיקום שלפני הכיווץ למיקום שלאחר הכיווץ על-ידי ציור קו המחבר בין המרכזים של כל תיבה והקלדת m בלוח המקשים. המר את המרחק ל-יקרומטר באמצעות מידה ידועה של תמונות. לחילופין, למדוד את המרחק ב-יקרומטר בצעד אחד על ידי לחיצה על לנתח את סרגל > קבוע ולהזין את פקטור ההמרה פיקסל-מיקרון ידוע כדי להניב דוח ב מיקרון.
      הערה: ניתן להזין מרחק בפיקסלים יחד עם המרחק המתאים ב-μm.
   3. לתאם את המרחק והכיוון של כל אירוע מתגלגל עם כיוון התפשטות התכווצות שרירים ב 8 עוברים לפחות עבור הבדלים משמעותיים סטטיסטית.
5. ניתוח כמותי של התכווצויות שרירים עובריים:
   1. השימוש עוברים המבטא סמנים פלורסנט בשרירים (g., השתמשנו בזבובים טרנסגניים המבטא בונה היתוך של Myosin Heavy Cסלסטיאל יזם ו gfp שנקרא mhc-gfp⁵) כדי לנתח פרמטרים התכווצות שרירים כגון משרעת התכווצות.
   2. השתמש בהקלטה של הבדיקה פלורסנט לצייר אזור מעניין (למשל, קופסה של 15 יקרומטר כדי 45 יקרומטר [hxw]) ממורכז על השרירים (אשר ברור לעין עקב נוכחות של סמן פלורסנט) של פלח גוף מסוים, ובחר את הוסף (t) tab על ה e ROI מנהל להקליט את המיקום של ההחזר. לחץ על ROI מנהל > למדוד כדי להקליט את עוצמת הפלורסנט הממוצעת של כל אזור של עניין שנבחר עבור כל מסגרת של הווידאו.
   3. הזז את התיבה למרכזים של חלקי גוף אחרים של עניין ולחץ על הוסף (t) במנהל הROI כדי להקליט את עמדותיהם. זה ייתן אזורים של עניין בגודל זהה בכל חלקי הגוף כדי להיות מנותח. בחר לפחות אחד אחורי, אחד המדיאלי, ומקטע קדמי אחד, לדוגמה, A7, A4 ו-T2, בהתאמה.
   4. במנהל הROI, בחר את כל אזורי הריבית הנרשמים כקואורדינטות מספר פרוסה-y של קואורדינטת x (לדוגמה, על-ידי בחירה בעת החזקת Ctrl) ולחץ על מידת > רב יותר כדי למדוד את הפלורסנט הממוצע אינטנסיביות של כל אזור מעניין עבור כל המסגרות של הווידאו, ולדווח על כל מדידה בטבלה. כל אזור מעניין הוא עמודה של הטבלה, וכל מסגרת היא שורה. העבר את הטבלה לתוכנית גיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נוסף.
   5. התווה גרף עם מספר מסגרת על ציר x ועוצמת פלורסנט מתכוונת על ציר ה-y. ניתן להמיר מספר מסגרת לזמן באמצעות קצב המסגרות (4 מסגרות/s) של הווידאו (איור 1א).
   6. קביעת משרעת התכווצות שרירים על ידי הערכת העלייה בעוצמת הזריחה GFP ביחס לקו הבסיס. התכווצויות שרירים להגדיל את עוצמת GFP כפי שהם מביאים יותר GFP לתוך הסביבה של אזור המוקד כמו שרירים יותר לקבל במהלך התכווצויות אלה (סרט 1)⁷. צור פלואורסצנטית בסיסית כעוצמה הממוצעת בין גלי התכווצות. נרמל את עוצמת ה-GFP לתוכנית הבסיסית על-ידי חלוקת כל ערך העוצמה של ROI על-ידי העוצמה הבסיסית.
      הערה: לכל פרופיל יש פלואורסצנטית בסיסי שונה, מאחר שייתכנו רמות ביטוי שונות במקטעי שרירים שונים.
      הערה: סיבוך פוטנציאלי אחד הוא כי הזריחה GFP עשוי להשתנות במשך הזמן עקב הלבנת תמונה. זה יכול להיפתר על ידי ניטור שינויים בתוכנית בסיסית פלואורסצנטית באמצעות גודל לדוגמה מספיק עבור ניתוח גל (אנחנו בדרך כלל להשתמש סטים של 10 גלי פלורסנט ולוודא כי הבסיס הוא קבוע בקירוב על ידי לקיחת ממוצע של הפסגה בלבד קיצון כמו בסיס כי ירדו באור הזריחה על ידי 10% או פחות יחסית השיא הראשוני קיצון). התאורה הנורית פולס עשוי להיות מיושם גם כדי לרכך את הבעיה¹⁶.
   7. השוואת התכווצויות שרירים על הצד השמאלי והימני של העובר על ידי ניתוח עוצמות שיא משני צידי העובר עבור מקטעים זהים. השתמש משרעת התכווצות והזמן של עוצמות שיא כדי לבחון את ההבדלים במידה והעיתוי של גלי התכווצות שרירים פריסטלטית הפצת לאורך שני צידי העובר.
   8. השוואת העוצמה המנורמלת של GFP במקטעים שונים (למשל, באזורים האחוריים, המדילי והאחורי) במהלך הפצת גל התכווצות שרירים כדי לבחון שינויים התכווצות כמו גל מפיץ. ניתוח זה קובע גם את כיוון הגל (קרי, בין אם הוא מפיץ לעבר אזורים הקדמי או האחורי של העובר).

תוצאות

התכווצויות שרירים נורמלי קנולות מוצגים WT (פראי סוג, קנטון-S) העובר בסרט 1. התדר הממוצע של גלים הפריסטטיים של התכווצויות שרירים בניתוח שלנו היה 47 התכווצויות לשעה ואת משרעת הממוצע היה 60% מעל הבסיס עבור עוברי WT. מתגלגל העובר מוצג עבור העובר WT בסרט 2, כאשר החץ הלבן מסמן את ה...

Discussion

השיטה שלנו מספקת דרך כמותית לנתח התנהגויות העובר חשוב במהלך הפיתוח, כגון גלי השריר הפריסטטי התכווצות, כולל גל תקופתיות, משרעת ודפוס, כמו גם אפקט גל על העובר מתגלגל ויציבה. זה יכול להיות שימושי ניתוחים של מוטציות שונות כדי ללמוד את התפקיד של גנים ספציפיים בוויסות אלה והתנהגויות אחרות במהלך ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital camera	Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0	C13440-20CU	With different emission filters
Forceps	FST Dumont	11254-20	Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm
LED	X-cite BDX (Excelitas)	XLED1
Microscope	Carl Ziess Examiner D1	491405-0005-000	Epiflourescence with time lapse
Needle	BD	305767	25 G x 1-1/2 inch
Paintbrush	Contemporary crafts		Any paintbrush will work
Petri dishes	VWR	25384-164	60 mm x 15 mm
Software	HCImage Live
Thread Zap Wax pen	Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon)	TZ1300	Burner Tool
Tricorner plastic beaker	VWR	25384-152	100 mL