Imagens ao vivo e análise de contrações musculares no embrião de Drosophila

Resumo

Aqui, nós apresentamos um método para registrar contrações embrionárias do músculo em embriões da Drosophila em uma maneira não invasora e detalhe-orientada.

Resumo

As contrações musculares coordenadas são uma forma de comportamento rítmico observado precocemente durante o desenvolvimento em embriões de Drosophila . Os circuitos de feedback sensorial neuronal são necessários para controlar esse comportamento. A falha produzir o teste padrão rítmico das contrações pode ser indicativa de anomalias neurológicas. Nós encontramos previamente que os defeitos na proteína O-mannosylation, uma modificação posttranslational da proteína, afetam a morfologia do axônio de neurônios sensoriais e resultam em contrações coordenadas anormais do músculo nos embriões. Aqui, nós apresentamos um método relativamente simples para gravar e analisar o teste padrão de contrações peristáltica do músculo pela imagem latente viva de embriões do estágio atrasado até o ponto da eclosão, que nós usamos para caracterizar o phenotype da contração do músculo da proteína Mutants O-mannosyltransferase. Os dados obtidos a partir dessas gravações podem ser utilizados para analisar as ondas de contração muscular, incluindo frequência, direção de propagação e amplitude relativa de contrações musculares em diferentes segmentos corporais. Nós igualmente examinamos a postura do corpo e tomado a vantagem de um marcador fluorescente expressado especificamente nos músculos para determinar exatamente a posição do midline do embrião. Uma aproximação similar pode igualmente ser utilizada para estudar vários outros comportamentos durante o desenvolvimento, tal como o rolamento e a eclosão do embrião.

Introdução

A contração do músculo peristáltico é um comportamento motor rítmico semelhante ao andar e nadar em humanos^1,2,3. As contrações musculares embrionárias observadas em embriões de fase tardia da Drosophila representam um exemplo de tal comportamento. A Drosophila é um organismo modelo excelente para estudar vários processos de desenvolvimento, porque a evolução embrionária na Drosophila é bem caracterizada, relativamente curta e fácil de monitorizar. O objetivo geral do nosso método é registrar e analisar cuidadosamente o padrão wavelike de contração e relaxamento dos músculos embrionários. Utilizamos uma abordagem simples, não invasiva, que oferece uma visualização detalhada, gravação e análise de contrações musculares. Este método também pode ser potencialmente utilizado para estudar outros processos in vivo, tais como o rolamento embrionário visto em embriões de estágio tardio, pouco antes da eclosão. Em estudos prévios, as contrações musculares embrionárias foram analisadas principalmente em termos de frequência e direção^1,2. A fim de estimar a extensão relativa das contrações à medida que progridem ao longo do eixo do corpo na direção anterior ou posterior, usamos embriões expressando GFP especificamente nos músculos. Esta análise fornece uma forma mais quantitativa de analisar as contrações musculares e revelar como a postura corporal em embriões é mantida durante a série de ondas peristálticas de contrações musculares.

Contrações musculares peristálticas são controladas por circuitos de gerador de padrão central (CPG) e comunicações entre os neurônios do sistema nervoso periférico (PNS), o sistema nervoso central (SNC) e os músculos^4,5. A falha produzir contrações peristáltica normais do músculo pode conduzir aos defeitos tais como a falha ao chocar² e a locomoção larval anormal⁶ e pode ser indicativa de anomalias neurológicas. A imagem latente viva de ondas peristáltica da contração do músculo e a análise detalhada de fenótipos da contração podem ajudar a descobrir os mecanismos patogénicos associados com os defeitos genéticos que afetam os músculos e os circuitos neural envolvidos na locomoção. Nós usamos recentemente essa aproximação para investigar os mecanismos que resultam em um phenotype da torção da postura do corpo de mutantes de protein O-mannosyltransferase (pomt)⁷.

A proteína O-mannosilação (POM) é um tipo especial de modificação pós-translacional, onde um açúcar de manose é adicionado aos resíduos de serina ou treonina de proteínas da via secretora^8,9. Defeitos genéticos em POM causam distrofias musculares congênitas (CMD) em humanos^10,11,12. Nós investigamos os mecanismos causais destas doenças usando a Drosophila como um sistema modelo. Nós encontramos que os embriões com mutações nos genes POMT1 e POMT2 da proteína O-mannosyltransferase de Drosophila (aka girado abdômen (RT) e Twisted (TW)) mostram um deslocamento ("rotação") dos segmentos corporais, o que resulta em uma postura corporal anormal⁷. Curiosamente, este defeito coincidiu com o estágio de desenvolvimento quando as contrações musculares peristálticas se tornam proeminentes⁷.

Desde que a postura anormal do corpo em embriões do mutante de POM levanta-se quando a musculatura e a epiderme são formadas já e as ondas peristáltica de contrações coordenadas do músculo começaram, nós supor que a postura anormal do corpo poderia ser um resultado do músculo anormal contrações em vez de um defeito no músculo ou/e na morfologia da epiderme⁷. CMDs pode ser associado com as contrações musculares anormais e defeitos da postura¹³, e assim a análise do phenotype da postura em mutantes de Drosophila pomt pode elucidar os mecanismos patológicos associados com as distrofias musculares . A fim investigar a relação entre o phenotype da postura do corpo de mutantes de Drosophila pomt e de anomalias possíveis em ondas peristáltica de contrações do músculo, nós decidimos analisar as contrações do músculo em detalhe usando um vivo abordagem de imagem.

Nossa análise de ondas de contração peristáltica em embriões de Drosophila revelou dois modos distintos de contração, designados como ondas tipo 1 e tipo 2. As ondas do tipo 1 são ondas simples propagando-se de anterior para posterior ou vice-versa. As ondas tipo 2 são ondas bifásicas que iniciam na extremidade anterior, propagam-se a meio caminho na direção posterior, momentaneamente interrompem, formando uma contração estática temporal, e então, durante a segunda fase, são varridos por uma contração peristáltica que se propaga para a frente da extremidade posterior. Embriões de tipo selvagem normalmente geram uma série de contrações que consiste em aproximadamente 75% tipo 1 e 25% tipo 2 ondas. Em contraste, os embriões Pomt Mutant geram ondas tipo 1 e tipo 2 em frequências relativas aproximadamente iguais.

Nossa abordagem pode fornecer informações detalhadas para análise quantitativa das contrações musculares e do embrião circulante⁷. Essa abordagem também pode ser adaptada para análises de outros comportamentos envolvendo contrações musculares, como eclosão e rastejamento.

Protocolo

1. preparação

1. Prepare uma gaiola da mosca fazendo aproximadamente 50 furos em um copo plástico do tri-canto da capacidade de 100 mL usando uma agulha quente de 25 G (veja a tabela dos materiais).
2. Prepare 60 mm x 15 mm de Petri com suco de maçã-Agar (3% agar e 30% suco de maçã).
3. Prepare a pasta fresca do fermento misturando grânulos e água secos do fermento. Espalhe a pasta de levedura sobre as placas de agar maçã para aumentar a postura de ovos.
4. Anestesie cerca de 50-60 moscas (use aproximadamente números iguais de machos e fêmeas) em CO₂ e colocá-los na gaiola de mosca.
   Nota: Usando uma proporção aumentada de fêmeas (até ~ 2:1 proporção de fêmeas: machos) pode ajudar a aumentar a quantidade de ovos colocados para alguns genótipos.
5. Anexar um suco de maçã-Agar petri prato com pasta de levedura para a gaiola de mosca firmemente e selá-lo com a modelagem de argila. Certifique-se que está selado em todos os cantos.
6. Aguarde até que as moscas despertem da anestesia e, em seguida, inverta a gaiola de tal forma que a placa de Petri está agora na parte inferior. Coloque a gaiola em uma incubadora com temperatura controlada (25 ° c) e umidade (60%).
7. Permitir moscas para colocar ovos para 2-3 h, substitua a placa de maçã com um fresco, e deixe a placa com ovos de idade para 19-20 h em uma incubadora.
   Nota: Antes da etapa acima, as moscas devem ser sincronizadas para facilitar a coleta de embriões de estágio 17e-f (19-21 h AEL). Isso pode ser conseguido através da transferência de moscas para uma gaiola com uma levedura fresca-suco de maçã-Agar placa 3-4 vezes para 12 h (uma vez a cada 3-4 h). Manter moscas no ambiente de luz circadiana controlada (ciclo LD) também pode ajudar na coleta de uma população sincronizada de embriões, mas isso não foi essencial em nossos experimentos.

2. recolha de embriões

1. Cuidadosamente escolher embriões com um pincel molhado e colocá-los em um prato de vidro de coleta preenchido com 1X PBS.
2. Selecione os embriões que têm suas traqueia cheias de ar. Traqueia cheia de ar indicam que os embriões chegaram ao estágio 17, e suas contrações musculares peristálticas deveriam ter começado. Os traqueia tornam-se claramente visíveis quando são preenchidos com ar, que pode servir como um marcador para o estágio 17.
3. Coloc uma laje do agar do suco de maçã em uma corrediça de vidro e transfira com cuidado embriões de PBS à laje. Alinhe os embriões com seu lado ventral para cima.
   Nota: Os lados dorsal e ventral dos embriões podem ser distinguidos pela posição dos apêndices dorsais na casca de ovo.
4. Faça um limite de cera retangular em outra corrediça de vidro usando uma caneta de cera (ver tabela de materiais).
5. Coloque uma fita adesiva dupla face dentro desse limite e gentilmente pegar os embriões, baixando este slide para a laje de agar. Aplique a pressão delicada para assegurar-se de que os embriões fure à fita bem, com seu lado dorsal acima. Se necessário, os embriões podem ser enrolados na fita para corrigir a sua orientação. Faça todas as manipulações ao monitorar embriões um microscópio de dissecção.
6. Cubra embriões com 1X PBS para imagens ao vivo de contrações musculares.
   Nota: Alguns procedimentos descritos acima estão relacionados às técnicas básicas de Drosophila usadas em muitos estudos. Descrições mais detalhadas de técnicas comuns de Drosophila podem ser encontradas em outros lugares¹⁴.

3. registo de embriões

1. Realize imagens ao vivo de embriões montados em um microscópio epiflourescence com uma função de lapso de tempo e uma câmera digital com filtros de emissão adequados (ver tabela de materiais) usando uma lente objetiva de imersão de água 10x.
   Nota: Aqui nós usamos embriões expressando GFP nos músculos. Outros marcadores fluorescentes com luz de excitação adequada e conjuntos de filtros de emissão também podem ser usados (por exemplo, para detecção de tdTomato, pode-se usar um conjunto de filtros Chroma ET-561 para excitação e emissão em torno de 554 nm e 581 nm ideais, respectivamente).
2. Executar a gravação de vídeo ao vivo de embriões usando software adequado (ver tabela de materiais) para cerca de 1-2 h com uma taxa de aquisição de 4 frames/s.
   Nota: Para analisar o rolamento do embrião em desenvolvimento dentro de sua casca, os embriões sem expressão de marcadores fluorescentes podem ser usados. Para este fim, a iluminação de luz transmitida regular sem filtros espectrais é aplicada para visualizar o movimento do embrião dentro do reservatório (ver filme 2).

4. análise das gravações

1. Exporte o vídeo gravado diretamente para a Image J para análises adicionais (por exemplo, como arquivos AVI).
2. No ImageJ, recorte as gravações de vídeo para o tamanho de embriões individuais, desenhando uma caixa ao redor de cada embrião e, em seguida, clicando na imagem > cultura. Isso reduz consideravelmente o tamanho dos arquivos de vídeo sem afetar sua resolução e facilita sua análise.
3. Gire imagens cortadas para alcançar a posição vertical da linha média do embrião em relação à tela, clicando na imagem > Transform > Rotate.
   Nota: A seleção de Visualização durante esse processo fornecerá orientação para rotação, mostrando linhas de grade para garantir a posição vertical da linha média.
4. Análise quantitativa do rolamento de embriões :
   Observação: para análises de distância, primeiro confirme se as imagens incluem informações de escala. A escala de imagem pode ser adicionada selecionando analisar ≫ definir escalae, em seguida, inserindo uma conversão de pixels em distâncias, por exemplo, micrômetros
   1. Marque a posição de um ou ambos os Tracheae no primeiro quadro do vídeo em um ponto a meio caminho entre extremidades posteriores e anteriores. Clique em Analyze > Tools > ROI Manager e registre esta posição como coordenada de número-y de fatia coordenada-x desenhando uma caixa de aproximadamente 7 μm por 7 μm ao redor e digitando t no teclado. Certifique-se de que ao digitar t, uma região de interesse é selecionada no vídeo. Como alternativa, selecione a guia Adicionar (t) no Gerenciador de ROI para registrar a posição da traqueia em vez de digitar o comando.
      Nota: A região de interesse pode variar em forma ou tamanho, dependendo da região embrionária ou do evento de desenvolvimento que está sendo estudado.
   2. Marque a posição da mesma área da traquéia após cada contração peristáltica. Meça a distância da posição da pre-contração à posição da borne-contração desenhando uma linha que conecta os centros de cada caixa e datilografe m no teclado. Converta a distância para μm usando uma escala conhecida de imagens. Alternativamente, meça a distância em μm em uma única etapa clicando em analisar ≫ definir escala e insira o fator de conversão de pixel para mícron conhecido para produzir um relatório em mícrons.
      Nota: Uma distância em pixels pode ser inserida junto com sua distância correspondente em μm.
   3. Correlacionar a distância e a direção de cada evento circulante com a direção da propagação da contração muscular em pelo menos 8 embriões para diferenças estatisticamente significantes.
5. Análise quantitativa de contrações musculares embrionárias:
   1. Use embriões expressando marcadores fluorescentes nos músculos (por exemplo, usamos moscas transgênicas expressando uma construção de fusão de MYosin Heavy CHain promoter e GFP chamado MHC-GFP⁵) para analisar os parâmetros de contração muscular, como amplitude de contração.
   2. Use a gravação da leitura fluorescente e desenhe uma região de interesse (por exemplo, uma caixa de 15 μm a 45 μm [HXW]) centrada nos músculos (que são claramente visíveis devido à presença de marcador fluorescente) de um segmento de corpo particular, e selecione a aba Add (t) no th e ROI Manager para registrar a posição do ROI. Clique no Gerenciador de ROI > Measure para registrar a intensidade fluorescente média de cada região de interesse selecionado para cada quadro do vídeo.
   3. Mova a caixa para os centros de outros segmentos do corpo de interesse e clique em Adicionar (t) no Gerenciador de ROI para registrar suas posições. Isso dará às regiões de interesse de tamanho idêntico em todos os segmentos do corpo a serem analisados. Selecione pelo menos um segmento posterior, um medial e um anterior, por exemplo, A7, A4 e T2, respectivamente.
   4. No Gerenciador de ROI, selecione todas as regiões de interesse registradas como coordenada de coordenada-x de número de fatia (por exemplo, selecionando enquanto mantém pressionada a tecla CTRL) e clique em mais > medida multi para medir a média fluorescente intensidade de cada região de interesse para todos os frames do vídeo, e relate cada medida em uma tabela. Cada região de interesse é uma coluna da tabela, e cada quadro é uma linha. Transfira a tabela para um programa de planilhas para análises adicionais.
   5. Plotar um gráfico com o número do quadro no eixo x e a intensidade fluorescente média no eixo y. O número do quadro pode ser convertido ao tempo usando a taxa de quadros (4 frames/s) do vídeo (Figura 1a).
   6. Determine a amplitude da contração muscular ao estimar o aumento da intensidade da fluorescência da GFP em relação à linha de base. As contrações musculares aumentam a intensidade da GFP à medida que trazem mais GFP para a vizinhança da área focal à medida que mais músculos são puxados durante estas contrações (filme 1)⁷. Estabeleça uma fluorescência basal como a intensidade média entre as ondas de contração. Normalize a intensidade do GFP para a linha de base dividindo cada valor de intensidade de ROI pela intensidade da linha de base.
      Nota: Cada perfil tem uma fluorescência de linha de base diferente, pois pode haver diferentes níveis de expressão em diferentes segmentos musculares.
      Nota: Uma complicação potencial é que a fluorescência do GFP pode mudar ao longo do tempo devido ao branqueamento fotográfico. Isto pode ser resolvido através da monitorização de alterações na linha de base de fluorescência e utilizando um tamanho de amostra suficiente para as análises de ondas (normalmente utilizamos conjuntos de 10 lâmpadas fluorescentes e confirmamos que a linha de base é aproximadamente constante, tendo uma média de apenas os picos minima como linha de base que diminuíram em fluorescência em 10% ou menos em relação ao pico mínimo inicial). Uma iluminação LED Pulse também pode ser aplicada para atenuar esse problema¹⁶.
   7. Compare as contrações musculares nos lados esquerdo e direito do embrião analisando intensidades de pico em ambos os lados do embrião para os mesmos segmentos. Use a amplitude da contração e o tempo das intensidades máximas para examinar diferenças na extensão e no sincronismo de ondas peristáltica da contração do músculo que propagam ao longo de ambos os lados do embrião.
   8. Comparar a intensidade normalizada da GFP em diferentes segmentos (por exemplo, nas regiões anterior, medial e posterior) durante a propagação da onda de contração muscular para examinar as alterações na contração à medida que a onda se propaga. Esta análise também determina a direção da onda (ou seja, se se propaga em direção às regiões anterior ou posterior do embrião).

Resultados

Contrações musculares peristálticas normais são mostradas em um embrião de WT (Wild-Type, Canton-S) no filme 1. A frequência média de ondas peristálticas de contrações musculares em nossa análise foi de 47 contrações por hora e a amplitude média foi de 60% acima da linha de base para embriões de WT. O rolamento do embrião é mostrado para um embrião do peso no filme 2, com a seta branca que marca a posição inicial de uma traquéia e uma seta preta que descrev...

Discussão

Nosso método fornece uma maneira quantitativa de analisar comportamentos importantes do embrião durante o desenvolvimento, tais como ondas peristáltica da contração do músculo, incluindo a periodicidade da onda, a amplitude e o teste padrão, assim como o efeito da onda no rolamento e na postura do embrião. Isso pode ser útil em análises de diferentes mutantes para estudar o papel de genes específicos na regulação desses e outros comportamentos durante o desenvolvimento embrionário. Foram utilizadas alteraç...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital camera	Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0	C13440-20CU	With different emission filters
Forceps	FST Dumont	11254-20	Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm
LED	X-cite BDX (Excelitas)	XLED1
Microscope	Carl Ziess Examiner D1	491405-0005-000	Epiflourescence with time lapse
Needle	BD	305767	25 G x 1-1/2 inch
Paintbrush	Contemporary crafts		Any paintbrush will work
Petri dishes	VWR	25384-164	60 mm x 15 mm
Software	HCImage Live
Thread Zap Wax pen	Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon)	TZ1300	Burner Tool
Tricorner plastic beaker	VWR	25384-152	100 mL