Live Imaging и анализ мышечных сокращений в дрозофилы эмбриона

Резюме

Здесь мы представляем метод записи эмбриональных мышечных сокращений в эмбрионах Дрозофилы в неинвазивной и подробно-ориентированной манере.

Аннотация

Скоординированные сокращения мышц являются одной из форм ритмического поведения видели рано во время развития в дрозофилы эмбрионов. Нейронные сенсорные цепи обратной связи необходимы для контроля такого поведения. Неспособность произвести ритмическую картину сокращений может свидетельствовать о неврологических аномалиях. Ранее мы обнаружили, что дефекты в белке O-mannosylation, постпереводной модификации белка, влияют на аксон морфологии сенсорных нейронов и привести к ненормальным скоординированных сокращений мышц в эмбрионах. Здесь мы представляем относительно простой метод для записи и анализа структуры перистальтических сокращений мышц путем живой визуализации эмбрионов поздней стадии до точки вылупления, который мы использовали для характеристики фенотипа белка сокращения мышц O-mannosyltransferase мутантов. Данные, полученные из этих записей, могут быть использованы для анализа волн сокращения мышц, включая частоту, направление распространения и относительную амплитуду мышечных сокращений на разных сегментах тела. Мы также изучили осанку тела и воспользовались флуоресцентным маркером, выраженным специально в мышцах, чтобы точно определить положение среднего эмбриона. Аналогичный подход также может быть использован для изучения различных других моделей поведения во время разработки, таких как катание эмбрионов и вылупление.

Введение

Перистальтический сокращения мышц является ритмическое моторное поведение, аналогичное ходьбе и плаванию у людей^1,2,3. Эмбриональные сокращения мышц видели в Дрозофилы поздней стадии эмбрионов представляют собой пример такого поведения. Дрозофила является отличной моделью организма для изучения различных процессов развития, потому что эмбриональное развитие в дрозофиле хорошо характеризуется, относительно короткий, и легко контролировать. Общая цель нашего метода заключается в тщательной записи и анализе волнообразных моделей сокращения и расслабления эмбриональных мышц. Мы использовали простой, неинвазивный подход, который предлагает детальную визуализацию, запись и анализ мышечных сокращений. Этот метод также может быть потенциально использован для изучения других процессов in vivo, таких как эмбриональный прокат, наблюдаемый в эмбрионах на поздних стадиях эмбрионов непосредственно перед вылуплянием. В предыдущих исследованиях, эмбриональные сокращения мышц в основном были проанализированы с точки зрения частоты и направления^1,2. Для того, чтобы оценить относительную степень сокращений, как они прогрессируют вдоль оси тела в передней или задней направлении, мы использовали эмбрионы, выражающие GFP специально в мышцах. Этот анализ предоставляет более количественный способ анализа мышечных сокращений и выявить, как осанка тела в эмбрионах поддерживается во время серии перистальтических волн мышечных сокращений.

Перистальтические сокращения мышц контролируются центральным генератором шаблона (CPG) схемами и связи между нейронами периферической нервной системы (PNS), центральной нервной системы (ЦНС), и мышц 4^,5. Неспособность производить нормальные перистальтические сокращения мышц может привести к дефектам, таким как неспособность люк² и ненормальные личиночного движения⁶ и может свидетельствовать о неврологических аномалий. Live изображения перистальтических волн сокращения мышц и подробный анализ фенотипов сокращения может помочь выявить патогенные механизмы, связанные с генетическими дефектами, влияющими на мышцы и нейронные цепи, участвующие в передвижении. Недавно мы использовали этот подход для исследования механизмов, которые приводят к осаде тела торсионфеи фенотипа protein O-mannosyltransferase (POMT) мутантов⁷.

Белок O-mannosylation (POM) является особым типом постпереводной модификации, где манноза сахар добавляется в сыворотки или трионин остатки секреторных белков пути^8,9. Генетические дефекты в POM вызывают врожденные мышечные дистрофии (CMD) у людей^10,11,12. Мы исследовали возбудительные механизмы этих заболеваний с использованием дрозофилы в качестве модели системы. Мы обнаружили, что эмбрионы с мутациями в протеине Drosophila O-mannosyltransferase генов POMT1 и POMT2 (также известной о вращающемся животе (rt) и витой (tw)) показывают смещение ("вращение") сегментов тела, что приводит к аномальной осанке тела^7. Интересно, что этот дефект совпал с стадией развития, когда перистальтические сокращения мышц становятся заметными⁷.

Поскольку аномальная осанка тела в poM мутантэмбрионов возникает, когда мускулатура и эпидермис уже сформированы и перистальтические волны скоординированных мышечных сокращений начали, мы предположили, что ненормальная осанка тела может быть результатом аномальной мышцы сокращения, а не дефект в мышцах или / и эпидермис морфологии⁷. CMDs может быть связано с аномальными сокращениями мышц и дефектами осанки¹³, и, таким образом, анализ осанки фенотипа у мутантов Drosophila POMT может выяснить патологические механизмы, связанные с мышечной дистрофией . Для того, чтобы исследовать связь между осанкой тела фенотипом мутантов Drosophila POMT и возможными отклонениями в перистальтических волнах мышечных сокращений, мы решили детально проанализировать мышечные сокращения с помощью живого подход к визуализации.

Наш анализ перистальтических волн сокращения эмбрионов Дрозофилы выявил два различных режима сокращения, обозначенных как волны типа 1 и типа 2. Тип 1 волны простые волны, распространяющиеся от передней до задней или наоборот. Тип 2 волны двухфазных волн, которые инициируют на передней части, размножаются на полпути в задней направлении, на мгновение остановить, образуя временное статическое сокращение, а затем, во время второй фазы, прокатилась перистальтического сокращения, которое распространяется вперед от заднего конца. Эмбрионы дикого типа обычно генерируют серию сокращений, которая состоит примерно из 75% волн типа 1 и 25%. В отличие от этого, эмбрионы мутантов POMT генерируют волны типа 1 и типа 2 на примерно равных относительных частотах.

Наш подход может предоставить подробную информацию для количественного анализа мышечных сокращений и эмбриона прокатки⁷. Этот подход может быть также адаптирован для анализа других моделей поведения, связанных с мышечными сокращениями, таких как вылупление и ползание.

протокол

1. Подготовка

1. Подготовка летать клетке, сделав около 50 отверстий в 100 мл потенциала трехугловой пластиковый стакан с помощью горячей 25 G иглы (см. Таблица материалов).
2. Приготовьте 60 мм х 15 мм петри блюда с яблочным соком-агаром (3% агара и 30% яблочного сока).
3. Подготовка свежих дрожжей пасты путем смешивания сухих дрожжей гранулы и вода. Распространение дрожжевой пасты на яблочные пластины агара, чтобы увеличить яйцекладка.
4. Анестезируйте около 50-60 мух (используют примерно одинаковое количество самцов и самок) на CO₂ и помещают их в клетку для мух.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование повышенной доли самок (до 2:1 соотношение самок: мужчины) может помочь увеличить количество отложенных яиц для некоторых генотипов.
5. Прикрепите яблочный сок-агар Петри блюдо с дрожжевой пасты к лету клетке плотно и запечатать его с моделированием глины. Убедитесь, что он запечатан на всех углах.
6. Подождите, пока мухи проснутся от анестезии, а затем инвертировать клетку так, что чашка Петри в настоящее время на дне. Поместите клетку в инкубатор с контролируемой температурой (25 градусов по Цельсию) и влажностью (60%).
7. Разрешить мухам откладывать яйца на 2-3 ч, заменить яблочную тарелку на свежую, и пусть тарелка с яйцами возраста 19-20 ч в инкубаторе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед вышеуказанным шагом мухи должны быть синхронизированы, чтобы облегчить сбор эмбрионов 17e-f (19-21 h AEL). Этого можно достичь путем переноса мух в клетку со свежей дрожжевой соком-агарной пластиной 3-4 раза по 12 ч (раз в 3-4 ч). Ведение мух в контролируемой циркадной световой среде (LD цикла) также может помочь в сборе синхронизированной популяции эмбрионов, но это не было существенным в наших экспериментах.

2. Коллекция эмбрионов

1. Тщательно выбирайте эмбрионы влажной кистью и помещайте их в коллекционную стеклянную тарелку, наполненную 1x PBS.
2. Выберите эмбрионы, которые имеют свои трахеи заполнены воздухом. Заполненные воздухом трахеи указывают на то, что эмбрионы достигли стадии 17, и их перистальтические сокращения мышц должны были начаться. Трахеи становятся хорошо видны, когда они заполнены воздухом, который может служить маркером для стадии 17.
3. Поместите яблочный сок агар плиты на стеклянную горку и тщательно перенести эмбрионы из PBS в плиту. Выстраивайте эмбрионы с их брюшной стороной вверх.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дорсальные и брюшные стороны эмбрионов можно отличить по положению придатков на яичной скорлупе.
4. Сделайте прямоугольную границу воска на другом стеклянном слайде с помощью восковой ручки (см. ТаблицуМатериалов).
5. Поместите двустороннюю липкую ленту в пределах этой границы и осторожно подберите эмбрионы, опустив этот слайд на агарную плиту. Применить мягкое давление, чтобы убедиться, что эмбрионы придерживаться ленты хорошо, с их доза вверх. При необходимости эмбрионы можно свернуть на ленту, чтобы скорректировать свою ориентацию. Делайте все манипуляции при наблюдении за эмбрионами под микроскопом вскрытия.
6. Обложка эмбрионов с 1x PBS для живой визуализации мышечных сокращений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые процедуры, описанные выше, связаны с основными методами дрозофилы, используемыми во многих исследованиях. Более подробное описание общих методов Drosophila можно найти в другом месте¹⁴.

3. Запись эмбрионов

1. Выполните живую визуализацию смонтированных эмбрионов на микроскопе эпифлюесценции с функцией замедленного действия и цифровой камерой с подходящими фильтрами для выбросов (см. Таблица Материалов) с помощью объектива объективного объектива 10-кратного погружения воды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы использовали эмбрионы, выражающие GFP в мышцах. Другие флуоресцентные маркеры с подходящими наборами ламп возбуждения и наборов фильтров выбросов также могут быть использованы (например, для обнаружения tdTomato, можно использовать фильтр Chroma ET-561 для возбуждения и выбросов около оптимальных 554 нм и 581 нм, соответственно).
2. Выполните живую видеозапись эмбрионов с помощью подходящего программного обеспечения (см. Таблица Материалов) около 1-2 ч с частотой приобретения 4 кадров/с.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа прокатки развивающегося эмбриона в его оболочке можно использовать эмбрионы без выражения флуоресцентных маркеров. С этой целью для визуализации движения эмбриона в оболочке применяется регулярное передаваемое световое освещение без спектральных фильтров (см. Фильм2).

4. Анализ записей

1. Экспорт записанное видео непосредственно в Image J для дальнейшего анализа (например, в виде файлов AVI).
2. В ImageJ, обрезать видеозаписи до размера отдельных эмбрионов, рисуя коробку вокруг каждого эмбриона, а затем нажав на изображение Это значительно уменьшает размер видеофайлов, не влияя на их разрешение и облегчает их анализ.
3. Поверните обрезанные изображения для достижения вертикального положения эмбриона средней линии по отношению к экрану, нажав на изображение
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор Preview в ходе этого процесса обеспечит руководство для вращения, показывая сетки для обеспечения вертикального положения средней линии.
4. Количественный анализ подвижного состава эмбрионов :
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа расстояния сначала подтвердите, что ваши изображения содержат информацию о масштабах. Масштаб изображения может быть добавлен, выбрав Анализ (Rugt; SetScale), а затем введя преобразование пикселей на расстояния, например, микрометры
   1. Отметьте положение одной или обеих трахеей в первом кадре видео в точке на полпути между задними и передними концами. Нажмите на Анализ ,gt; Инструменты и рентабельность инвестиций менеджер и записать эту позицию, как срез числа-у координат-х координат, нарисовав коробку примерно 7 мкм на 7 мкм вокруг него и набрав т на клавиатуре. Убедитесь, что при вводе tна видео выбирается интересующий регион. Кроме того, выберите вкладку Добавить (т) на менеджере ROI для записи положения трахеи вместо ввода команды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Область интереса может варьироваться в форме или размере в зависимости от эмбриональной области или развития события изучается.
   2. Отметьте положение одной и той же области трахеи после каждого перистальтального сокращения. Измерьте расстояние от положения предварительного сокращения до положения после сокращения, нарисовав линию, соединяющую центры каждой коробки и набрав м на клавиатуре. Преобразуйте расстояние до мкм, используя известный масштаб изображений. Кроме того, измерьте расстояние в мкм в один шаг, нажав на анализную шкалу и введите известный пиксель-микрон коэффициент преобразования, чтобы дать отчет в микронах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Расстояние в пикселях можно ввести вместе с соответствующим расстоянием в мкм.
   3. Соотнесите расстояние и направление каждого подвижного события с направлением распространения мышечного сокращения по крайней мере 8 эмбрионов для статистически значимых различий.
5. Количественный анализ эмбриональных мышечных сокращений:
   1. Используйте эмбрионы, выражающие флуоресцентные маркеры в мышцах (например, мы использовали трансгенные мухи, выражающие конструкцию синтеза Myosin Heavy Chain promoter и GFP под названием MHC-GFP⁵) для анализа параметров сокращения мышц, таких как амплитуда сжатия.
   2. Используйте запись флуоресцентного считывания и нарисуйте интересуемый регион (например, коробка от 15 мкм до 45 мкм (HXW) по центру на мышцах (которые хорошо видны из-за присутствия флуоресцентного маркера) определенного сегмента тела, и выберите вкладку Add (t) на th e roI менеджер для записи позиции рентабельности инвестиций. Нажмите на менеджер roI (RUI) и измерьте среднюю интенсивность флуоресцентных материалов каждого региона, который подбирается для каждого кадра видео.
   3. Переместите коробку в центры других сегментов тела, представляющих интерес, и нажмите на Add (t) в менеджере roI, чтобы записать свои позиции. Это даст регионам, представляющим интерес идентичный размер во всех сегментах тела, которые будут проанализированы. Выберите по крайней мере один задний, один медиаленный и один передний сегмент, например, A7, A4 и T2, соответственно.
   4. В roI менеджер, выберите все регионы, представляющие интерес, записанные как срез числа-у координат-x координат (например, выбрав при проведении Ctrl) и нажмите на Подробнее интенсивность каждого региона, представляющих интерес для всех кадров видео, и сообщить о каждом измерении в таблице. Каждая область интереса представляет собой столбец таблицы, и каждый кадр является строкой. Перенесите таблицу в программу электронной таблицы для дальнейшего анализа.
   5. Участок график с номером кадра на оси X и означает флуоресцентную интенсивность на y-оси. Номер кадра может быть преобразован во времени, используя частоту кадров (4 кадра/с) видео(рисунок 1А).
   6. Определите амплитуда сокращения мышц, оценив увеличение интенсивности флуоресценции GFP по отношению к базовому уровню. Мышечные сокращения увеличивают интенсивность GFP, поскольку они приносят больше GFP в непосредственной близости от координационного района, как больше мышц получить вытащил во время этих сокращений (Фильм 1)⁷. Установить базовую флуоресценцию как среднюю интенсивность между волнами сокращения. Нормализовать интенсивность GFP до базового, разделив каждое значение интенсивности окупаемое инвестиций на базовую интенсивность.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый профиль имеет различные базовые флуоресценции, так как могут быть различные уровни экспрессии в различных сегментах мышц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одним из потенциальных осложнений является то, что флуоресценция GFP может меняться с течением времени из-за отбеливания фотографий. Это может быть решена путем мониторинга изменений в базовой флуоресценции и с использованием достаточного размера выборки для анализа волн (мы обычно используем наборы из 10 флуоресцентных волн и подтверждаем, что базовый уклад примерно постоян, принимая в среднем только те пик минима как базовый уровень, который снизился в флуоресценции на 10% или менее по отношению к первоначальному пику минимы). Импульсно-светодиодное освещение может быть также применено для смягчения этой проблемы^16.
   7. Сравните мышечные сокращения на левой и правой сторонах эмбриона, проанализировав пиковую интенсивность по обе стороны эмбриона для одних и тех же сегментов. Используйте амплитуду сокращения и время пиковой интенсивности для изучения различий в степени и сроках перистальтических волн сокращения мышц, распространяющихся по обе стороны эмбриона.
   8. Сравните нормализованную интенсивность GFP в различных сегментах (например, в передних, медианных и задних областях) во время распространения волны сокращения мышц для изучения изменений в сокращении по мере распространения волны. Этот анализ также определяет направление волны (т.е., распространяется ли она на передние или задние области эмбриона).

Результаты

Нормальные перистальтические сокращения мышц показаны в WT (дикий тип, Кантон-S) эмбриона в фильме 1. Средняя частота перистальтических волн мышечных сокращений в нашем анализе составила 47 сокращений в час, а средняя амплитуда была на 60% выше базового уровня для эмбрион...

Обсуждение

Наш метод обеспечивает количественный способ анализа важных поведения эмбрионов во время развития, таких как перистальтические волны сокращения мышц, включая периодичность волн, амплитуду и рисунок, а также волновое воздействие на подвижность эмбриона и осанку. Это может быть полезн?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital camera	Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0	C13440-20CU	With different emission filters
Forceps	FST Dumont	11254-20	Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm
LED	X-cite BDX (Excelitas)	XLED1
Microscope	Carl Ziess Examiner D1	491405-0005-000	Epiflourescence with time lapse
Needle	BD	305767	25 G x 1-1/2 inch
Paintbrush	Contemporary crafts		Any paintbrush will work
Petri dishes	VWR	25384-164	60 mm x 15 mm
Software	HCImage Live
Thread Zap Wax pen	Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon)	TZ1300	Burner Tool
Tricorner plastic beaker	VWR	25384-152	100 mL