JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מתארים את ההרכבה של RNA פולימראז II (Pol II) מתחמי התארכות הדורשים רק די-אן-איי סינתטי ו-RNA olig, ומטוהרים פול II. מתחמי אלה שימושיים עבור מנגנוני לימוד בבסיס עיבוד שכונתיות של התעתיקים הקשורים למכלול התארכות פול השני.

Abstract

הסינתזה של eukaryotic הוא תהליך ביוכימיים מורכב המחייב תמלול של תבנית DNA לתוך RNA מקודמת על ידי אנזים רב subunit RNA פולימראז II ו-co-transcript השילוב של RNA הקודמן כדי ליצור את mRNA בוגרת. במהלך סינתזה mRNA, מתחם התארכות RNA פולימראז II הוא יעד לרגולציה על ידי אוסף גדול של גורמי שעתוק השולטים בפעילות הקטליטית שלה, כמו גם הסגירה, השילוב, ו 3 '-עיבוד אנזימים היוצרים את mRNA בוגרת. בגלל המורכבות הטבועה של סינתזה של mRNA, מערכות ניסוי פשוטות יותר המאפשרות בידוד וחקירה של שלבי ההמרה השונים שלה יש תועלת רבה.

במאמר זה, אנו מתארים אחד מערכת ניסיונית פשוטה כזו המתאימה לחקירת הסגירה שיתוף RNA. מערכת זו מסתמכת על הגדרת RNA פולימראז II מתחמי התארכות התאספו מ פולימראז מטוהרים ובועות תעתיק מלאכותי. כאשר מקיבוע באמצעות ה-DNA biotinylated, אלה מתחמי התארכות RNA פולימו II מספקים כלי manipulable בקלות לניתוח מנגנוני הסגירה של RNA ומנגנונים שבהם מורכבות התארכות המגוייסים ומווסת את האנזים הסגירה במהלך שיתוף עם הסגירה של RNA. אנו מצפים מערכת זו יכול להיות מותאם ללימוד גיוס ו/או הרכבה של חלבונים או מתחמי חלבונים עם תפקידים בשלבים אחרים של התבגרות mRNA בשילוב למכלול התארכות RNA פולימראז II.

Introduction

Eukaryotic RNA (mRNA) סינתזה היא תהליך ביוכימיים מורכבים המערבת סינתזה של רנ א מעובד מעובד על ידי RNA פולימראז II ועיבוד של RNA הקודמן להניב mRNA בוגרת. פעולות עיבוד ה-RNA של הסגירה, החבור והפוליאדלציה מתבצעות במידה רבה באופן משותף. מתחם התארכות פול השני משמש כפיגום שמגוייסים ומתזמונים את פעילותם של רבים מאנזימי העיבוד של RNA. כתוצאה מכך, ההבנה האולטימטיבית של הדרך בה מופקים מערכת mrnas בוגרת, תסתמך במידה רבה על פיתוח מערכות נסיוניות כדי לאפשר ניתוח של המנגנונים הביוכימיים המשמשים לגיוס למכלול התארכות ו התקנה של אנזימים האחראים לסגירה משותפת, שחבור ופוליאדלציה.

לא באופן מפתיע, פיתוח מערכות נסיוניות כאלה היה קשה. מכשול גדול כבר המורכבות המדהימה של שעתוק פול השני עצמו היכן פשוט מחדש את התמלול בסיס על ידי פול השני בפריפרייה דורש קבוצה מינימלית של חמישה גורמים כלליים ליזום שעתוק: TFIIB יברות, TFIIB, TFIIB, TFIIB, ו TFIIB 1. יתר על כן, מחדש כל סוג של שעתוק פול II מוסדר בתוך מבחנה דורש קבוצה גדולה עוד יותר של מרכיבי שעתוק ומתאמים. כך, המטרה העיקרית הייתה לפתח מערכות ניסיוני פשוט המאפשר החוקה של מתחמי התארכות פעיל פול השני מתאים לחקירות של הזיווג הפונקציונלי של שעתוק פול השני ו-RNA עיבוד.

אחת שיטה פשוטה כזאת לחידוש מתחמי התארכות החדש של פול השני הוכיחה שימושי עבור מחקרים מבניים וביוכימיים של להאריך Pol II ו, לאחרונה, עבור חקירת שיתוף RNA עיבוד2,3 ,4,5. במאמר זה, אנו מראים כיצד פול התארכות מתחמים הכין מטוהרים פול II ובועות תמלול סינתטי ניתן להשתמש ביעילות כדי לחקור את המנגנונים הבסיסיים שיתוף החוצה של התעתיקים המתהווה פול השני.

הסגירה מתייחסת התוספת הקוולנטי של 5 '-guanosine "כובע" כדי 5 '-triphosphate לסיים את התעתיקים פול השני המתהווה. הכובע חשוב עבור השלבים הבאים של mrna התבגרות, תחבורה, תרגום, ותהליכים אחרים6,7. הכובע מתווסף בשיתוף פעולה לתעתיקים של פול השני על ידי אנזים המכונה אנזים סגירה. בתאי היונקים, אתרים פעילים האחראים RNA 5 '-triphosphatase ו guanylyl טרנספראז פעילויות של אנזים הסגירה כלולים בתוך פוליפטידים אחד8. האנזים הסגירה מגויס למכלול התארכות פול השני באמצעות אינטראקציות עם זאת כדי להיות משטחים מוגדרים על הגוף Pol II והתחום Rpb1 xy-מסוף (CTD) זרחניות על Ser5 הפטניות שלה חוזר על5. במתחם התארכות, האנזים הסגירה מזרז תוספת של 5 '-guanosine כובע פעם התעתיק המתהווה מגיע לאורך של לפחות 18 נוקלאוטידים והגיח מערוץ היציאה של RNA פולימראז. בשלב הראשון של תגובת הסגירה, triphosphatase הידרו RNA 5 '-triפוספט כדי להניב 5 '-diphosphate. בשלב השני, gtp הוא ידרוליזה ל-GMP על ידי guanylyl transferase, ויוצרים ביניים אנזים הסגירה של gmp. לבסוף, guanylyl טרנספראז העברת GMP לקצה 5 '-diphosphate של התעתיק המתהווה לייצר את הכובע.

תכונה יוצאת דופן של תגובת הסגירה היא שיתוף הסגירה המשותף (כלומר, הסגירה של התעתיקים הקשורים עם מכלולי התארכות פול 2 של פונקציונלי) הוא הרבה יותר יעיל מאשר הסגירה של RNA חינם5,9. לפיכך, השאלה העיקרית בתחום הייתה כיצד הפעלה דרמטית זו של הסגירה מושגת באמצעות אינטראקציות של אנזים הסגירה עם קומפלקס התארכות פול השני. בפרוטוקול זה אנו מתארים את ההרכבה של פעיל RNA פולימראז II מתחמי התארכות באמצעות מטוהרים רק RNA פולימראז II ובועות תעתיק מלאכותי. שיטות אלה לאפשר יצירה של RNA פולימראז II מתחמי התארכות עם תעתיקים של אורך ורצף מוגדר. במחקר שנערך לאחרונה, השתמשנו אלה מוגדרים RNA פולימראז II מתחמי התארכות כמודל לחקירת היבטים של מנגנוני הסגירה של RNA5. בפרט, הראנו כי (אני) הסגירה של RNA הקשורים עם מתחמי התארכות אלה היה יותר מ 100-קיפול יעיל יותר מאשר הסגירה של RNA חינם ו (ii) היה מגורה על ידי TFIIH תלוי זרחון של השני של הפול CTD. הגישה המתוארת כאן יכולה עקרונית להיות מותאם כדי ליצור מצעים עבור לימוד אחרים שיתוף ההמרה לעיבוד RNA תגובות הקשורות למכלול התארכות פול II.

בסעיף 1 של פרוטוקול זה, מכלולי התארכות מלאכותיים נוצרים על-ידי חישול תבנית סינתטי גדיל ה-DNA olig, הגאות ל-RNA olig, משלימה ב 3 '-end שלה כ 9 נוקלאוטידים של ה-DNA תבנית סטרנד. פול II נטען לאחר מכן על ה-DNA: רנ א דופלקס. מתחם התארכות מושלם לאחר מכן על-ידי תוספת של משלימה באופן חלקי, DNA שאינו תבנית של החיבור האלחוטי, אשר מתויג עם ביוטין ב 3 '-end (איור 1 ואיור 2a). ה-RNA olig, הגאות והשפל מורחב על ידי פול השני במערכות התארכות אלה כדי להפוך את התעתיקים המוגדרים של האורך והרצף בתוספת של שילובים הולמים של הנוקלאוטידים. בנוסף, שימוש בשילוב של שוטף כדי להסיר נוקלאוטידים משולבים ותוספת נוספת של צירופים שונים של נוקלאוטידים, אחד יכול "ללכת" פול II למיקומים שונים לאורך תבנית ה-DNA ולסנתז RNA של אורכי מוגדר. RNA הוא לאחר מכן מטוהר ונתון לאלקטרופורזה בדאתהיכה שתנן-דף ג ' לים. בסעיף 2 לפרוטוקול, מערכות התארכות מלאכותיות משמשות לניתוח הסגירה של RNA שכונתיות. הדוגמה המוצגת מודדת את ההשפעה של זרחון התלוי ב-TFIIH של ה-CTD של הפול השני בנוגע לסגירה משותפת של RNA. בניסוי זה, אנו מודדים את היקף הסגירה של שיתוף הפעולה כפונקציה של הגבלת ריכוז האנזים (5, 15 ו 45 ng לכל תגובה) וזמן (1, 2 ו 4 דקות).

Protocol

1. הרכבת של מכלולי התארכות מלאכותיים ופול השני הליכה

  1. השתק 1 nmol של שאינם תבנית DNA oligo המכיל 3 ' ביוטין מולקולה על חרוזים מגנטיים.
    הערה:     ניתן לבצע את השלבים הבאים מראש כדי להתכונן לניסויים עתידיים. כל רצפי oligo המשמשים בפרוטוקול זה מסופקים בטבלה 1. ה-RNA oligos מסונתז עם 5 '-triphosphate שינויים.
    1. הוסף 200 μL של חרוזים מגנטיים (10 מ"ג/mL) לתוך כריכת חלבון נמוך 1.5 mL שפופרת, ולאחר מכן מניחים על מדף מגנטי עבור 2 דקות.
    2. בעוד הצינור הוא על המדף המגנטי, להסיר את הנוזל מהצינור מבלי להפריע את החרוזים. כדי לשטוף את החרוזים, להסיר את הצינור מארון התקשורת, להוסיף 1 מ ל 5 mM טריס-HCl pH 7.5, 0.5 mM EDTA, 1 M הנאגל, להחזיר את הצינור לארון התקשורת, ולהסיר את הפתרון לשטוף לאחר 2 דקות.
    3. חזור על שוטף 2 פעמים נוספות באמצעות 200 μL של אותו מאגר.
    4. השעיה מחדש חרוזים מגנטיים ב 400 μL של 10 מ"מ מילימטר טריס-HCl pH 7.5, 1 מ"מ EDTA, 2 M הנאל, מאגר. לאחר מכן לערבב עם 380 μL של H2O ו 20 μl של 10 μm לא תבנית ביולוגית DNA oligo. מניחים את הצינור על הצינורית והדגירה עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. לשטוף ללא קיבוע תבנית DNA oligo 3 פעמים עם 200 μL של 5 mM טריס-HCl pH 7.5, 0.5 mM EDTA, 1 M הנאל, ולאחר מכן 3 פעמים עם 200 μL של 20 מ"מ HEPES-NaOH pH 7.9, 20% גליצרול, 100 mM KCl, 1 מ"מ EDTA, 0.5 mg/mL סרום הפרה.
    6. השאירו שפופרת לילה ב 4 ° צ' כדי לסיים את החרוזים עם BSA.
    7. למחרת, מניחים את הצינור בארון המגנטי, להסיר ולמחוק את הנוזל, ו מחדש מחרוזות ב 200 μL של 20 מ"מ HEPES-NaOH pH 7.9, 20% גליצרול, 100 mM KCl, 1 מ"מ EDTA, 0.5 mg/mL סרום הפרה אלבומין ולהעביר לצינור חדש. עבור תבנית זו של DNA, ריכוז סופי הוא כ 5 μM.
      הערה: דגירה הזמן הריכוז oligo צריך להיות מקובע עבור כל דנ א biotinylated. תבנית זו צריכה לספק מספיק עבור 200 תגובות, והאחרונה לפחות 6 חודשים כאשר מאוחסנות ב -4 ° c.
  2. אנאל RNA ותבנית ה-DNA מגדיל את הזרם באמצעות היחס הטוחנת 2:1 (20 ו-10 pmol, בהתאמה) כדי להשיג את ה-DNA: רנ א דופלקס.
    1. הגדרת שילוב ריפוי של 10 μL כפי שמתואר בטבלה 2.
      הערה: 10 μl של חישול ערבוב מספיקים עבור 10 תגובות. את ערבוב הריפוי ניתן לשנות בהתאם לצורך, אם יש לבצע מספר רב יותר.
    2. בצעו את תגובות הריפוי בציקלנר תרמי באמצעות התוכנית הבאה: 5 דקות ב 45 ° c, ואחריו 12 מחזורים של 2 דקות כל אחד, החל ב 43 ° c והפחתת הטמפרטורה 2 ° c לכל מחזור. לא פעיל ב -4 ° c.
      הערה: זוהי נקודת זמן גמישה. הריפוי מסתיים בתוך ~ 30 דקות, אך ניתן להשאיר אותו ב -4 ° c לתקופה ארוכה יותר. במעבדה, תערובות ריפוי נשארו לשבת עד 4 שעות מבלי לצפות בירידה ביעילות התגובה.
    3. בעוד הריפוי RNA ל-DNA סטרנד תבנית, להכין מאגרים לשלבים מאוחרים יותר של הפרוטוקול. החומרים הדרושים כדי להכין כל מאגר עבור תגובה אחת עם כל מאגר מפורטים בטבלאות 2 עד 8. קנה מידה של מתכונים בפקטור של [Y (X + 1) + 1] עבור כביסה ו-(X + 1) עבור כל המאגרים האחרים. X = מספר התגובות שיש להכין; Y = מספר צעדי כביסה הדרושים (מינימום 3).
      הערה: הכינו את כל המאגרים רעננים ביום הניסוי. אין למקם צינורות על הקרח לאחר PVA נוספה למאגרים. הוסף את Pol II או נוקלאוטידים למאגרים בדיוק לפני השימוש.
  3. טען מטוהרים RNA פולימראז II אל ה-DNA: RNA היברידי.
    1. מערבבים 1 pmol (1 μL) של ה-DNA: רנ א דופלקס עם 13 μL של מאגר פול II ( מלוח 3).
    2. להוסיף ~ 0.02 יחידות של RNA מטוהרים פול II (1 μL) לתערובת משלב 1.3.1 ולערבב על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה וזע עם טיפ פיפט, מבלי להציג בועות. מודקון עבור 10 דקות ב 30 ° c.
      הערה: כמויות שניתנו מכאן והלאה הן לתגובה אחת; לעלות בקנה מידה לפי הצורך במספר התגובות בניסוי. RNA פול II מטוהר מכבד חולדה כמתואר10 משמש בדוגמה זו; עם זאת, RNA Pol II מטוהרים ממקורות אחרים, כולל תאים מהיונקים התרבותי או שמרים יכול לשמש גם3,4,5,11,12,13.
  4. השלם את מכלול התארכות על-ידי הוספת דנ א של תבנית ביולוגית ללא תבניות.
    1. הוסף 5 ליטר (1 μL) של מקיבוע DNA שאינו תבנית העיצוב ל -14 μL של מאגר DNA ללא תבנית ( מטבלה 4), להוסיף צינור משלב 1.3.2, ו דגירה עבור 10 דקות ב 37 ° c.
    2. מניחים את המדגם בארון תקשורת מגנטית עבור 2 דקות. לשטוף 1x עם 30 μL של מאגר לשטוף ( מטבלה 7) כדי להסיר את משולב פול השני ו oligos.
  5. הפקת מכלולי התארכות המכילים רדיויניום בעלי מערכות RNA 23mers.
    1. בצע את כל הincubations הנוספות ב -30 ° c. להוסיף 1 μL של 15 μM ATP ו 10 μCi (1 μL) של [α-32P] utp (3,000 ci/ממול) עד 23 μl של מאגר הדופק ולהשתמש בו כדי להשהות מחדש את החרוזים מגנטי שטף.
      זהירות: . חומר רדיואקטיבי הוא מסוכן הקפידו ללבוש ציוד הגנה מתאים ולעקוב אחר כל הנחיות המעבדה לשימוש בטוח ולסילוק חומרים רדיואקטיביים.
      הערה: החלף את UTP עם 15 μM UTP כאשר רנ א הוא לא נחוץ, כגון ניסויים כתמי המערבי.
    2. מקרינה את התגובה עבור 10 דקות כדי לאפשר סינתזה של הרדיו 23mers מרס.
    3. הוסף 1.5 μL של פתרון המכיל 100 μM ATP ו-100 μM UTP ערבוב כדי 3.5 μL של מאגר מרדף, להוסיף צינור המכיל מתחמי התארכות מראש, ו דגירה עבור 5 דקות כדי לרדוף אחר כל התעתיקים המתהווה לתוך 23mers.
    4. מניחים את המדגם בארון תקשורת מגנטית עבור 2 דקות, להסיר את supernatant, לשטוף פעם אחת עם 30 μL של מאגר לשטוף כדי להסיר נוקלאוטידים משולבים, ולהשעות מחדש 30 μL של מאגר לשטוף.
    5. או להוסיף 94 μL של להפסיק לערבב עם הפרוטאינאז K ו הגליקוגן (שולחן 9) כדי לסיים את התגובות או להמשיך בסעיף 1.6 כדי ליצור מתחמי התארכות עם תעתיקים יותר או סעיף 2 לבצע סגירה assays.
  6. אופציונלי ללכת פול II כדי להפוך 23, 25, ו 29 נוקלאוטיד התעתיקים
    1. בצע את ההליך המתואר בשלבים 1.2.1 באמצעות 1.5.4 כדי להכין מכלולי התארכות המכילים מרכזי לאורך 23 מרס. קנה מידה 4-קיפול להפקת 120 μL של מכלולי התארכות שנשטפו, אשר מתחמים מספיק עבור 4 תגובות.
    2. תווית 3 צינורות חדשים "23mer", "25mer" ו-"29mer". העברה 30 μL של שטף מכלולי התארכות כדי "23mer" הצינור ולהוסיף 94 μL של להפסיק לערבב עם והגליקוגן.
    3. מניחים את הצינור המכיל את הנותרים 90 μL של שטוף מתחמי התארכות בארון תקשורת מגנטית עבור 2 דקות, להסיר את supernatant, ו מחדש חרוזים ב 90 μL של BTB בתוספת 1.2 μL כל אחד 1.5 mM ATP ו 1.5 mM CTP. מודקון עבור 10 דקות ב 30 ° c.
    4. לאחר שטיפת פעם אחת עם 90 μL של לשטוף את המאגר ואת השעיית מחדש ב 90 μL של מאגר לשטוף כמתואר בשלב 1.5.4, העברה 30 μL של מכלולי התארכות ל "25mer" צינור ולהוסיף 94 μL של להפסיק לערבב עם הגליקוגן ומוספים.
    5. מניחים את הצינור המכיל את הנותרים 60 μL של מתחמי התארכות במדף המגנטי עבור 2 דקות, להסיר את supernatant, ו מחדש חרוזים ב 60 μL של BTB בתוספת 0.8 μL כל אחד מ-ATP 1.5 מילימטר ו-1.5 mM CTP.
    6. דגירה עבור 10 דקות ב 30 ° צ', לשטוף פעם אחת עם 60 μL של מאגר לשטוף כמו בסעיף 1.5.5, ולהשעות מחדש ב 60 μL של מאגר לשטוף.
    7. העברה 30 μL ממדגם 2x כדי "29mer" צינור ולהוסיף 94 μL של להפסיק לערבב עם פרוטטינואז K ו הגליקוגן או להמשיך לסעיף 2 לבצע הסגירה assays.
    8. המשך לטיהור וניתוח RNA (סעיף 3).

2. שימוש במערכות התארכות מלאכותיות לגבי שיטת שמיפות

  1. צור מכלולי התארכות שנשטפו המכילים 23mers על ידי שינוי קנה המידה של ההליך המתואר בשלבים 1.2.1 באמצעות 1.5.5 13-קיפול. זה מספיק 12 תגובות + 1 תוספת.
  2. פול השני CTD זירחון
    1. מניחים את הצינור המכיל שטף התארכות מתחמי במדף המגנטי עבור 2 דקות, להסיר את supernatant, ו מחדש חרוזים 377 μL של BTB בתוספת עם 13 μL של 1.5 mM ATP.
    2. הכינו שתי שפופרות חדשות, המסומנות כ-H ו-H, בהתאמה. לצינור המסומן + H להוסיף 3 μL של ~ 300 ng/μL TFIIH, ועל הצינור המסומן-H להוסיף 9 μL של 20 מ"מ HEPES-NaOH pH 7.9, 20% גליצרול, 100 mM KCl, 1 מ"מ EDTA, 0.5 mg/mL סרום של שור.
      הערה: אנו בדרך כלל משתמשים TFIIH מטוהרים מכבד חולדה, אבל יש לנו השיגו תוצאות דומות באמצעות ~ 0.6 μg/התגובה של מסחרית-רקומביננטי Cdk7/ציקלונים H/MAT1 (עוגה, שהוא מודול קינאז מ TFIIH). ראה טבלת חומרים למידע.
    3. הוסף 87 μL של מכלולי התארכות שטף משלב 2.2.1 לצינור המסומן + H ו 270 μL של מכלולי התארכות שנשטפו אל הצינור המסומן-H. דגירה 10 דקות ב 30 ° c.
    4. מניחים דגימה בארון תקשורת מגנטי עבור 2 דקות. כדי להסיר העודפים נוקלאוטידים וחלבון לא מאוגד, לשטוף מכלולי התארכות ב + H ו-H תגובות עם 90 μL או 270 μL של מאגר לשטוף, בהתאמה.
  3. הסגירה של RNA
    1. מחדש מכלולי התארכות בצינור המסומן + H ב 87 μL של שילוב הסגירה (BTB בתוספת 50 μM GTP (שולחן 10). השעיית מכלולי התארכות מחדש בצינור המסומן-H ב 261 μL של ערבוב הסגירה.
    2. הכינו 4 צינורות חדשים המסומנים 5 ng CE + H, 5 ng לסה נ, 15 ng לסה נ, 45 ng CE. לדלל את האנזים הסגירה (לסה נ) לתוך 20 מ"מ HEPES-NaOH pH 7.9, 20% גליצרול, 100 mM KCl, 1 מ"מ EDTA, 0.5 mg/mL סרום הפרה אלבומין להכין פתרונות המכילים 5 ng CE/μL, 15 ng לסה נ/μL, או 45 ng לסה נ/μl ומחלק 3 μL של הפתרון המתאים לתוך כל אחד 4 צינורות.
    3. להכין 12 צינורות חדשים עם 94 μL של מאגר העצירה (2.1.1) נוסף לכל.
    4. התחל כל תגובת הסגירה על ידי הוספת 87 μL של מורכבות התארכות שטופלו TFIIH או לא לתייג צינורות המכילים אנזים הסגירה. מודטה ב -30 ° c בבלוק חום.
    5. אחרי 1, 2, או 4 דקות, להפסיק את התגובות על ידי העברת 30 μL של כל תערובת התגובה צינורות המכילים 94 μL של מאגר לעצור. לטהר ולנתח מוצרי תגובה כמתואר בסעיף 3.

3. רנ א טיהור וניתוח

  1. לטהר את ה-RNA
    1. מוצרים התגובה מודטה במאגר לעצור עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: . נקודת השהיה דגימות במאגר זה נשמר עד 4 שעות ללא אובדן או השפלה של RNA.
    2. לחלץ פעם אחת עם 124 μL של פנול: כלורופורם: isoamyl אלכוהול (25:24:1) ופעם עם כלורופורם: isoamyl אלכוהול (24:1).
      זהירות: פנול הוא רעיל מאוד והוא נספג במהירות על ידי העור. . תלבש ציוד הגנה מתאים
      הערה: כדי למקסם את ההתאוששות של RNA במהלך החילוץ, השתמש בצינורות הזמינים מסחרית המכילה ג'ל בצפיפות גבוהה, המהווה מחסום יציב בין שלבים מימית ואורגניים. ראה דיון ורשימת חומרים.
    3. להעביר את השלב מימית (השכבה העליונה) לצינורות חדשים המכילים 12.4 μL של 3 M סודיום אצטט pH 5.2.
  2. משקעים באתנול
    1. הוסף 350 μL של 100% אתנול ולערבב ביסודיות על ידי היפוך.
    2. דגירה לפחות 10 דקות על קרח יבש.
      הערה: . נקודת השהיה לנוחיותכם, ניתן לעצור כאן ולהשלים את ההליך ביום שלמחרת; עם זאת, ניתן להמשיך ישירות לשלב 3.3 ולהפעיל את הג באותו יום. RNA ניתן לשמור ב-80 ° c לכמה ימים לפני העיבוד הנוסף, אבל לא לעזוב במשך זמן רב יותר.
  3. הכנת דגימות RNA עבור אלקטרופורזה בג
    1. אפשר דגימות להפשיר, לערבב על ידי היפוך 2-3 פעמים, ו צנטריפוגה עבור 15 דקות ב 21,000 x g, 4 ° c, ב צנטריפוגה שולחן. בינתיים, להגדיר מיקס ג'ל הרפתקאות (סעיף 3.4.1).
    2. להסיר בזהירות אתנול מדגימות ללא גלולה מטרידה.
    3. הוסף 500 μL של 70% אתנול, היפוך צינור כמה פעמים כדי לשטוף את הגלולה, ולאחר מכן צנטריפוגה שוב ב 21,000 x g עבור 5 דקות או בטמפרטורת החדר או 4 ° c.
    4. הסר כמו אתנול הרבה ככל האפשר ולעשות ספין מהיר (5-10 s) של צינורות בצנטריפוגה השולחן העליון. לאחר מכן, עם טיפ העמסה ג'ל, להסיר את הנפח האחרון שנותר של אתנול.
    5. כיפת האוויר יבש 3 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. לפזר RNA על ידי הוספת 4 μL של H2O לחלק העליון של כל גלולה. משטח הטמפרטורה 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    7. הוסף 4 μL של צבען 2x RNA (ראה טבלת חומרים) לתערובת, ולאחר מכן מערבולת כל צינור במשך כמה שניות כדי להשהות מחדש את RNA.
      הערה: לצבוע RNA המכיל כיוון במקום אוריאה מומלץ, שכן האחרון מזרז בטמפרטורות נמוכות.
    8. מהיר לסובב את הצינורות, ולאחר מכן הדגירה אותם ב 70 ° c עבור 10 דקות בבלוק חום.
    9. לאחסן צינורות על קרח יבש עד מוכן לטעון על ג'ל.
      הערה:       שמירת רנ א על קרח יבש מאפשרת את הגמישות לעבוד על ניסויים אחרים בעוד הג הוא פולימניזציה. אין צורך לחמם מחדש דגימות לאחר הפשרה. עם זאת, RNA יכול להיות טעון ישירות לאחר החימום אם ג'ל מוכן לרוץ.
  4. הכנת ג'ל לעמוד אוריאה
    1. עבור 40 mL ג'ל לערבב, לשלב 50 מ ל שפופרת חרוטי: 16.7 g של אוריאה, 15 מ ל של 40% bis: הפתרון אקרילאמיד (19:1 יחס), 4 מ ל של 10x TBE (1 M טריס-HCl, 1 M נתרן borate, 20 מ"מ EDTA), ו 8 מ ' של H2O. כרך זה מספיק עבור ג'ל אחד גודל סטנדרטי (18 ס"מ גובה x 16 ס"מ רוחב) עם 1.0 mm מרווחים.
      זהירות: אקרילאמיד הוא רעיל מאוד. למרות שאין סיכון באינהלציה כאשר הוא בפתרון, יש לענוד תמיד מעיל מעבדה, כפפות ומשקפי בטיחות בזמן הטיפול.
      הערה: תערובת זו היא עבור השלכת הרפתקאות 15% פוליאקרילמיד ג'ל, אשר פותר בקלות RNA בין 15-50 nt. לשנות את הריכוז של bis/אקרילאמיד לפי הצורך כדי לפתור תעתיקים שונים של RNA באורכים שונים.
    2. מניחים צינורית סגורה המכילה ג'ל לערבב על הנטור עד אוריאה הוא התפרקה לחלוטין.
    3. כוונן את התחנה ליציקת ג'ל עם צלחות זכוכית, מרווח של 1 מ"מ ומסרק של 15 היטב.
    4. עבודה במהירות, להוסיף 40 μL של TEMED ו 400 μL של 10% אמוניום מפרסולפט הפתרון ג'ל ומערבבים היטב. באמצעות 25 מ ל pipet, למזוג את התמיסה ג'ל בין צלחות, להוסיף מסרק, ולאפשר ג'ל לפולימו עבור לפחות 2 h.
      הערה: אם הג נשפך יותר מ 2 לפני השימוש, ברגע שהוא מכסה את המכסה עם מגבת נייר לח (משאירים את המסרק במקום) ועוטפים עם ניילון נצמד כדי למנוע את התייבשות.
  5. ג'ל לייצור מ, אלקטרופורזה ב-RNA
    1. לאחר פולימוניזציה, ג'ל העברה לטנק ריצה מראש להפעיל אותו ב 20 mA ב 1x TBE עבור 15-30 דקות.
    2. בינתיים, דגימות הפשרה (אם קפואים), מערבולת, ו לסובב אותם 4 דקות ב 2,000 x g, 4 ° c.
    3. כאשר מוכנים, לכבות את אספקת החשמל, ובזהירות לשטוף כל טוב עם 1x באמצעות מזרק.
    4. השתמש בטיפים לטעינת ג'ל כדי לטעון דגימות על ג'ל.
    5. הפעל ג'ל באופן קבוע 20-30 mA עבור 2 h או עד הצבע התחתון (xylene FF) מגיע לתחתית של ג'ל.
  6. מסירים את הג, מניחים אותו על נייר סופג, ועוטפים עם עטיפת ניילון.
  7. לחשוף את ג'ל הקרינה למסך זרחי.
  8. סרוק את הזצג באמצעות פוספרוורידים ונתח את התמונה.

תוצאות

דמויות 2 ו- 3 להראות התגובה הייצוגית משמש ליצירת מתחמי הארכה מלאכותית המכילה תעתיקים של אורכים שונים על ידי הרחבת או פול השני ממקורות שונים. איור 4 מתאר כיצד אלה מתחמי התארכות ניתן להשתמש כדי לחשב שכונתיות ctd מותנית בסגירה של RNA.

Discussion

מחקרים שמבקשים לבתר את האירועים ביחד למכלול התארכות פול השני כגון עיבוד רנ א ורגולציה של ההתארכות עצמה ניתן להקל מאוד על ידי שימוש במערכת אנזימים מאוד מטוהרים. הגדרת מערכות אנזימים כאלה יכולה להיות מאתגרת. התעתיק התלוי של היזם על ידי פול השני דורש לפחות חמישה גורמי שעתוק כלליים. הכנת הגור?...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

אנו מודים לס' שומאן על אספקת האנזים להגבלת היונקים. עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי מענק למכון הסטורים למחקר רפואי מקרן הלן נלסון לחקר הרפואה בקרן הקהילה רבתי בקנזס סיטי.  ניתן לגשת לנתונים המקוריים שבבסיס כתב יד זה ממאגר הנתונים המקורי של סטורס ב-http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
[α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCiPerkin ElmerNEG007H001MCFor radiolabeling RNA
2x RNA loading dyeNew England BiolabsB0363SHighly recommended. For preparing RNA during gel loading
40% Bis:Acrylamide solutionBiorad1610144
Bovine Serum Albumin (20 mg/mL)New England BiolabsB9000S
Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µgMillipore Sigma14-476Used to phosphorylate Pol II CTD
DNA oligonucleotidesIDTSee Table 8 for purity specifications
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Life Technologies Invitrogen65001We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL)Life Technologies InvitrogenAM9516Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle
Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well combHoeferSE600-15-1.5
MaXtract high density tubes (1.5 mL)Qiagen129046Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions
Proteinase K solution (20 mg/mL)Life Technologies Invitrogen25530049
RNA oligonucleotidesTrilinkSee Table 8 for more details
Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/mL)New England BiolabsNEBM2403SRequired only during capping reactions

References

  1. Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).
  2. Daube, S. S., von Hippel, P. H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Science. 258, 1320-1324 (1992).
  3. Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex. Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).
  4. Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).
  5. Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts. Nature Communications. 9 (1), 3392 (2018).
  6. Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).
  7. Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).
  8. Ghosh, A., Lima, C. D. Enzymology of RNA cap synthesis. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 1 (1), 152-172 (2010).
  9. Moteki, S., Price, D. Functional coupling of capping and transcription of mRNA. Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).
  10. Conaway, J. W., Conaway, R. C. An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70. Science. 248, 1550-1553 (1990).
  11. Wang, D., et al. Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution. Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).
  12. Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).
  13. Martinez-Rucobo, F. W., et al. Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping. Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).
  14. Mandal, S. S., et al. Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).
  15. Chiu, Y. L., et al. Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA. Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).
  16. Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF. Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).
  17. Vos, S. M., et al. Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6. Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).
  18. Kujirai, T., et al. Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage. Science. 362 (6414), 595-598 (2018).
  19. Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

147mRNARNA IICTDTFIIHCo RNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved