Künstliche RNA-Polymerase II-Dehnungskomplexe zur Sezieren von co-transkriptionellen RNA-Verarbeitungsereignissen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Montage von RNA-Polymerase II (Pol II) Dehnungskomplexen, die nur kurze synthetische DNA- und RNA-Oligonukleotide und gereinigte Pol II erfordern. Diese Komplexe sind nützlich für die Untersuchung von Mechanismen, die der kotranskriptiellen Verarbeitung von Transkripten im Zusammenhang mit dem Pol-II-Dehnungskomplex zugrunde liegen.

Zusammenfassung

Die eukaryotische mRNA-Synthese ist ein komplexer biochemischer Prozess, der die Transkription einer DNA-Vorlage in eine Vorläufer-RNA durch das Multi-Subunit-Enzym RNA-Polymerase II und die kotranskriptionale Verkabelung und Spleißung der Vorläufer-RNA zur Bildung der reifen mRNA erfordert. Während der mRNA-Synthese ist der RNA-Polymerase-II-Dehnungskomplex ein Ziel für die Regulierung durch eine große Sammlung von Transkriptionsfaktoren, die seine katalytische Aktivität steuern, sowie die Verschluss-, Spleiß- und 3'-Verarbeitungsenzyme, die die ausgereifte mRNA erzeugen. Aufgrund der inhärenten Komplexität der mRNA-Synthese haben einfachere experimentelle Systeme, die die Isolierung und Untersuchung ihrer verschiedenen kotranskriptionsbasierten Stadien ermöglichen, einen großen Nutzen.

In diesem Artikel beschreiben wir ein solches einfaches experimentelles System, das für die Untersuchung der co-transkriptionellen RNA-Verkappung geeignet ist. Dieses System stützt sich auf definierte RNA-Polymerase-II-Dehnungskomplexe, die aus gereinigten Polymerase- und künstlichen Transkriptionsblasen zusammengesetzt sind. Bei immobilisierter DNA-Deaktivierung bieten diese RNA-Polymerase-II-Dehnungskomplexe ein leicht zu manipulierbares Werkzeug zur Sezieren von co-transkriptioniellen RNA-Verschließungen und Mechanismen, mit denen der Dehnungskomplex das Verschlussenzym während der co-transkriptionelle RNA-Verkappung. Wir gehen davon aus, dass dieses System für die Untersuchung der Rekrutierung und/oder Montage von Proteinen oder Proteinkomplexen mit Rollen in anderen Stadien der mRNA-Reifung angepasst werden könnte, die an den Dehnungskomplex der RNA-Polymerase II gekoppelt sind.

Einleitung

Die eukaryotische Boten-RNA-Synthese (mRNA) ist ein ausgeklügelter biochemischer Prozess, der die Synthese einer unverarbeiteten Vorläufer-RNA durch RNA-Polymerase II und die Verarbeitung der Vorläufer-RNA umfasst, um die ausgereifte mRNA zu erhalten. Die RNA-Verarbeitungsschritte der Verkappung, Spleißung und Polyadenylierung werden weitgehend ko-transkriptional durchgeführt. Der Dehnungskomplex Pol II dient als Gerüst, das die Aktivitäten vieler RNA-Verarbeitungsenzyme rekrutiert und orchestriert. Folglich wird unser endgültiges Verständnis, wie ausgereifte eukaryotische mRNAs erzeugt werden, in hohem Maße von der Entwicklung experimenteller Systeme abhängen, um die Zerlegung der biochemischen Mechanismen, die der Rekrutierung zugrunde liegen, an den Dehnungskomplex und Regulierung von Enzymen, die für die kotranskriptionelle Verkappung, Spleißung und Polyadenylierung verantwortlich sind.

Es überrascht nicht, dass die Entwicklung solcher experimentellen Systeme schwierig war. Ein großes Hindernis war die bemerkenswerte Komplexität der Pol-II-Transkription selbst, bei der die einfache Rekonstituierung der Basaltranskription durch Pol II in vitro einen Mindestsatz von fünf allgemeinen Transkriptionsinitiationsfaktoren erfordert: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF und TFIIH ¹. Darüber hinaus erfordert die Wiederherstellung jeglicher Art von regulierter Pol-II-Transkription in vitro einen noch größeren Satz von Transkriptionsfaktoren und Koregulierungen. Ein wichtiges Ziel war es daher, einfachere experimentelle Systeme zu entwickeln, die die Rekonstitution aktiver Pol-II-Dehnungskomplexe ermöglichen, die für Untersuchungen der funktionellen Kopplung von Pol II Transkription und RNA-Verarbeitung geeignet sind.

Eine derart einfachere Methode zur Rekonstituierung aktiver Pol-II-Dehnungskomplexe hat sich für strukturelle und biochemische Studien zur Dehnung von Pol II und in jüngerer Zeit für die Untersuchung der kotranskriptionellen RNA-Verarbeitung als nützlich erwiesen^{2,3 ,4,5}. In diesem Artikel zeigen wir, wie Pol II Dehnungskomplexe, die aus gereinigten Pol II und synthetischen Transkriptionsblasen hergestellt wurden, effektiv genutzt werden können, um die Mechanismen zu untersuchen, die der kotranskriptionsbasierten Deckelung von aufkeimenden Pol II-Transkripten zugrunde liegen.

Die Deckelung bezieht sich auf die kovalente Zugabe einer 5'-Guanosin-"Kappe" zum 5'-Triphosphat-Ende der entstehenden Pol-II-Transkripte. Die Kappe ist wichtig für nachfolgende Schritte der mRNA Reifung, Transport, Translation und andere Prozesse^6,7. Die Kappe wird von einem Enzym, das als Verschlussenzym bezeichnet wird, kotranskriptional zu Pol II-Transkripten hinzugefügt. In Säugetierzellen sind aktive Stellen, die für die RNA 5'-Triphosphatase und guanylyl transferase Aktivitäten des Verschlussenzyms verantwortlich sind, in einem einzigen Polypeptid⁸enthalten. Das Verschlussenzym wird durch Wechselwirkungen mit noch zu definierten Oberflächen auf dem Pol II-Körper und der Rpb1-Carboxy-Terminal-Domäne (CTD) phosphoryliert auf Ser5 seiner Heptapeptid-Wiederholungen⁵an den Pol-II-Dehnungskomplex rekrutiert. Im Dehnungskomplex katalysiert das Verschlussenzym die Zugabe einer 5'-Guanosin-Kappe, sobald das entstehende Transkript eine Länge von mindestens 18 Nukleotiden erreicht und aus dem Polymerase-RNA-Ausgangskanal hervorgegangen ist. Im ersten Schritt der Verschlussreaktion hydrolysiert die Triphosphatase die RNA 5'-Triphosphat zu einem 5'-Diphosphat. Im zweiten Schritt wird GTP durch die Guanylyltransferase zu GMP hydrolysiert und bildet ein GMP-Verschlussenzym-Zwischenprodukt. Schließlich überträgt die guanylyl transferase GMP an das 5'-Diphosphat-Ende des entstehenden Transkripts, um die Obergrenze zu erzeugen.

Ein bemerkenswertes Merkmal der Verschlussreaktion ist, dass die kotranskriptionsbezogene Deckelung (d.h. die Deckelung von Transkripten im Zusammenhang mit funktionellen Pol II Dehnungskomplexen) viel effizienter ist als die Deckelung der freien RNA^5,9. Eine wichtige Frage auf diesem Gebiet war daher, wie diese dramatische Aktivierung der Deckelung durch Wechselwirkungen des Verschlussenzyms mit dem Pol-II-Dehnungskomplex erreicht wird. In diesem Protokoll beschreiben wir die Montage aktiver RNA-Polymerase-II-Dehnungskomplexe unter Verwendung nur gereinigter RNA-Polymerase II und künstlicher Transkriptionsblasen. Diese Methoden ermöglichen die Erstellung von RNA-Polymerase-II-Dehnungskomplexen mit Transkripten definierter Länge und Sequenz. In einer aktuellen Studie haben wir diese definierten RNA-Polymerase-II-Dehnungskomplexe als Modell zur Untersuchung von Aspekten der Mechanismen der RNA-Verkappung⁵verwendet. Insbesondere zeigten wir, dass (i) die Verkappung von RNA im Zusammenhang mit diesen Dehnungskomplexen mehr als 100-fach effizienter war als die Deckelung freier RNA und (ii) durch TFIIH-abhängige Phosphorylierung der Pol II CTD stimuliert wurde. Der hier beschriebene Ansatz könnte grundsätzlich angepasst werden, um Substrate für die Untersuchung anderer kotranskriptionaler RNA-Verarbeitungsreaktionen im Zusammenhang mit dem Pol-II-Dehnungskomplex zu erzeugen.

In Abschnitt 1 dieses Protokolls entstehen künstliche Dehnungskomplexe, indem ein synthetisches Schablonen-DNA-Oligonukleotid zu einem RNA-Oligonukleotid glüht, das sich an seinem 3'-Ende zu etwa 9 Nukleotiden der Schablonenstrang-DNA ergänzt. Pol II wird dann auf das DNA:RNA-Duplex geladen. Der Dehnungskomplex wird dann durch Zugabe eines teilweise komplementären, nicht-schablonenfreien DNA-Oligonukleotids ergänzt, das an seinem 3'-Ende mit Biotin beschriftet ist (Abbildung 1 und Abbildung 2A). Das RNA-Oligonukleotid wird durch Pol II in diesen Dehnungskomplexen erweitert, um radioaktiv markierte Transkripte von definierter Länge und Sequenz nach Zugabe geeigneter Kombinationen von radioaktiv markierten Nukleotiden zu erstellen. Darüber hinaus kann man mit einer Kombination von Wässen, um nicht inkorporierte Nukleotide zu entfernen und die weitere Zugabe verschiedener Kombinationen von Nukleotiden, Pol II zu verschiedenen Positionen entlang der DNA-Vorlage "laufen" und RNA von definierten Längen synthetisieren. RNA wird dann gereinigt und in denaturierenden Harnstoff-PAGE-Gelen einer Elektrophorese unterzogen. In Abschnitt 2 des Protokolls werden künstliche Dehnungskomplexe verwendet, um die kotranskriptionelle RNA-Verkappung zu analysieren. Das vorgestellte Beispiel misst die Wirkung der TFIIH-abhängigen Phosphorylierung der Pol II CTD auf die co-transkriptionelle RNA-Verkappung. In diesem Experiment messen wir das Ausmaß der Co-Transkriptionsverkappung in Abhängigkeit von der Verschluss-Enzymkonzentration (5, 15 und 45 ng pro Reaktion) und der Zeit (1, 2 und 4 min).

Protokoll

1. Montage von Künstlichen Dehnungskomplexen und Pol II Walking

1. Immobilisieren Sie 1 nmol nicht-template DNA Oligo enthält ein 3' BiotinMolekül auf magnetischen Perlen.
   HINWEIS: Die folgenden Schritte können im Voraus durchgeführt werden, um sich auf zukünftige Experimente vorzubereiten. Alle in diesem Protokoll verwendeten Oligosequenzen sind in Tabelle 1aufgeführt. RNA-Oligos werden mit 5'-Triphosphat-Modifikationen synthetisiert.
   1. Fügen Sie 200 l magnetisch (10 mg/ml) zu einem proteinarmen, proteinarmen 1,5 ml-Rohr hinzu und legen Sie es dann 2 min auf ein magnetisches Rack.
   2. Während sich das Rohr auf dem magnetischen Rack befindet, entfernen Sie die Flüssigkeit aus dem Rohr, ohne die Perlen zu stören. Um die Perlen zu waschen, entfernen Sie das Rohr aus dem Rack, fügen Sie 1 ml von 5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, geben Sie das Rohr an das Rack, und entfernen Sie die Waschlösung nach 2 min.
   3. Wiederholt wird 2 mal mit 200 L desselben Puffers.
   4. Magnetische Perlen in 400 l von 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, Puffer wieder aufhängen. Dann mischen Sie mit 380 l H₂O und 20 l von 10 'M nicht-Template biotinylierteDNA Oligo. Legen Sie das Rohr auf einen Nutator und inkubieren Sie für 30 min bei Raumtemperatur.
   5. Immobilisiertes DNA-Oligo 3 mal mit 200 l von 5 mM Tris-HCl pH 7.5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl und dann 3 mal mit 200 l von 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% Glycerin, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin.
   6. Lassen Sie das Rohr über Nacht bei 4 °C, um die Blockierung von Perlen mit BSA zu beenden.
   7. Legen Sie die Röhre in das Magnetgestell, entfernen und entsorgen Sie die Flüssigkeit, und setzen Sie die Perlen in 200 l von 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% Glycerin, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin auf und übertragen sie in ein neues Rohr. Für diese DNA-Vorlage beträgt die Endkonzentration ca. 5 m.
      HINWEIS: Inkubationszeit und Oligokonzentration müssen für jedes biotinylierte DNA-Oligo empirisch bestimmt werden. Diese Vorlage sollte genug für 200 Reaktionen bieten und mindestens 6 Monate dauern, wenn sie bei 4 °C gespeichert werden.
2. Anneale RNA und DNA-Schablonenstrangoligotoligos in einem 2:1-Molarenverhältnis (20 bzw. 10 pmol), um die DNA:RNA-Duplex zu erhalten.
   1. Richten Sie eine 10-L-Glühmischung ein, wie in Tabelle 2beschrieben.
      HINWEIS: 10 l Glühmischung sind ausreichend für 10 Reaktionen. Die Glühmischung kann bei Bedarf skaliert werden, wenn weitere Assays durchgeführt werden sollen.
   2. Führen Sie die Glühreaktionen in einem thermischen Cycler mit dem folgenden Programm durch: 5 min bei 45 °C, gefolgt von 12 Zyklen zu je 2 min, beginnend bei 43 °C und Abnehmen der Temperatur 2 °C pro Zyklus. Leerlauf bei 4 °C.
      HINWEIS: Dies ist ein flexibler Zeitpunkt. Das Glühen ist innerhalb von 30 min beendet, kann aber bei 4 °C für einen längeren Zeitraum gelassen werden. Im Labor wurden Glühmischungen bis zu 4 h sitzen gelassen, ohne eine Abnahme der Reaktionseffizienz zu beobachten.
   3. Während Sie RNA an die DNA des Schablonenstrangs glühen, bereiten Sie Puffer für spätere Schritte des Protokolls vor. Die Zutaten, die benötigt werden, um jeden Puffer für eine einzelne Reaktion mit jedem Puffer vorzubereiten, sind in den Tabellen 2 bis 8aufgeführt. Skalieren Sie Rezepte für Wash und (X+1) für alle anderen Puffer um den Faktor [Y(X+1) + 1]. X = Anzahl der zu präparierten Reaktionen; Y = Anzahl der erforderlichen Waschschritte (mindestens 3).
      HINWEIS: Bereiten Sie alle Puffer am Tag des Experiments frisch vor. Legen Sie Rohre nicht auf Eis, nachdem PVA zu Puffern hinzugefügt wurde. Fügen Sie Pol II oder Nukleotide direkt vor der Verwendung zu Puffern hinzu.
3. Laden Sie gereinigte RNA-Polymerase II auf den DNA:RNA-Hybrid.
   1. Mischen Sie 1 pmol (1 l) DNA:RNA-Duplex mit 13 l Pol II Puffer (aus Tabelle 3).
   2. Fügen Sie der Mischung aus Schritt 1.3.1 0,02 Einheiten gereinigter RNA Pol II (1 l) hinzu und mischen Sie sie, indem Sie sanft nach oben und unten pfeifen und mit Pipettenspitze rühren, ohne Blasen einzuschleusen. 10 min bei 30 °C inkubieren.
      HINWEIS: Die von nun an gegebenen Mengen sind für eine einzige Reaktion; für die Anzahl der Reaktionen im Experiment nach Bedarf zu skalieren. IN diesem Beispiel wird RNA Pol II, gereinigt aus Rattenleber, wie^{beschrieben 10,} verwendet; jedoch kann RNA Pol II, gereinigt aus anderen Quellen, einschließlich kultivierter Säugetierzellen oder Hefe, auch^{3,4,5,11,12,13}verwendet werden.
4. Vervollständigen Sie den Dehnungskomplex durch Zugabe von biotinylierter Nicht-Template-DNA.
   1. 5 pmol (1 l) immobilisiertes DNA-Oligo hinzufügen, um 14 L nicht-template DNA-Puffer (aus Tabelle 4), zu Tube aus Schritt 1.3.2 hinzufügen und für 10 min bei 37 °C brüten.
   2. Legen Sie die Probe in magnetische Rack für 2 min. Waschen Sie 1x mit 30 l Waschpuffer (aus Tabelle 7), um nicht inkorporierte Pol II und Oligos zu entfernen.
5. Generieren Sie Dehnungskomplexe, die radioaktiv markierte RNA 23mer enthalten.
   1. Führen Sie alle weiteren Inkubationen bei 30 °C durch. Fügen Sie 1 l von 15 'M ATP und 10 'Ci (1 'L) von^[-32P] UTP (3.000 Ci/mmol) zu 23 'L des Pulspuffers hinzu und verwenden Sie diese, um gewaschene magnetische Perlen wieder aufzuhängen.
      ACHTUNG: Radioaktives Material ist gefährlich. Achten Sie darauf, geeignete Schutzausrüstung zu tragen und alle Laborrichtlinien für die sichere Verwendung und Entsorgung von radioaktivem Material zu befolgen.
      HINWEIS: Ersetzen Sie radioaktiv markierte UTP durch 15 M UTP, wenn keine radioaktiv markierte RNA benötigt wird, z. B. für Westliche Blotexperimente.
   2. Inkubieren Sie die Reaktion für 10 min, um die Synthese von radioaktiv markierten 23mers zu ermöglichen.
   3. Fügen Sie 1,5 L der Lösung, die 100 'M ATP und 100 'M UTP-Mischung enthält, zu 3,5 'L Chase-Puffer hinzu, fügen Sie zu Tuben hinzu, die vormontierte Dehnungskomplexe enthalten, und inkubieren Sie für 5 min, um alle aufkeimenden Transkripte in 23mers zu jagen.
   4. Legen Sie die Probe für 2 min in das Magnetische Rack, entfernen Sie den Überstand, waschen Sie sie einmal mit 30 l Waschpuffer, um nicht inkorporierte Nukleotide zu entfernen, und setzen Sie sie in 30 l Waschpuffer wieder auf.
   5. Fügen Sie entweder 94 L Stop-Mix mit Proteinase K und Glykogen (Tabelle9) hinzu, um Reaktionen zu beenden, oder fahren Sie mit Abschnitt 1.6 fort, um Dehnungskomplexe mit längeren Transkripten zu erzeugen, oder Abschnitt 2, um Verschlusstests durchzuführen.
6. (Optional) Gehen Sie Pol II, um 23, 25 und 29 Nukleotid-Transkripte zu erstellen
   1. Befolgen Sie das in den Schritten 1.2.1 bis 1.5.4 beschriebene Verfahren, um Dehnungskomplexe mit radioaktiv markierten 23Mern vorzubereiten. Skalieren Sie 4-fach, um 120 L gewaschene Dehnungskomplexe zu erzeugen, was genug Komplexe für 4 Reaktionen ist.
   2. Etikettieren Sie 3 neue Röhren "23mer", "25mer" und "29mer". Übertragen Sie 30 l gewaschene Dehnungskomplexe auf das "23mer"-Rohr und fügen Sie 94 l Stop-Mix mit Proteinase K und Glykogen hinzu.
   3. Legen Sie das Rohr mit den restlichen 90 l gewaschenen Dehnungskomplexen 2 min in das magnetische Rack, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Perlen in 90 l BTB, ergänzt mit 1,2 l je 1,5 mM ATP und 1,5 mM CTP, wieder auf. 10 min bei 30 °C inkubieren.
   4. Nach dem Einmalwaschen mit 90 l Waschpuffer und Wiederaufhängen in 90 l Waschpuffer, wie in Schritt 1.5.4 beschrieben, 30 l Dehnungskomplexe in das "25mer"-Rohr übertragen und 94 l Stop-Mix mit Proteinase K und Glykogen hinzufügen.
   5. Legen Sie das Rohr mit den restlichen 60 l Dehnungskomplexen 2 min in das magnetische Rack, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Perlen in 60 l BTB, ergänzt mit 0,8 l je 1,5 mM ATP und 1,5 mM CTP, wieder auf.
   6. 10 min bei 30 °C inkubieren, einmal mit 60 l Waschpuffer wie abschnitt 1.5.5 waschen und in 60 l Waschpuffer wieder aufhängen.
   7. Übertragen Sie 30 l von der 2x-Probe auf die "29mer"-Röhre und fügen Sie entweder 94 L Stop-Mix mit Proteinase K und Glykogen hinzu oder fahren Sie mit Abschnitt 2 fort, um Verschlusstests durchzuführen.
   8. Fahren Sie mit der RNA-Reinigung und -Analyse fort (Abschnitt 3).

2. Verwendung von künstlichen Dehnungskomplexen zum Assay Cotranscriptional Capping

1. Generieren Sie gewaschene Dehnungskomplexe mit 23Mers, indem Sie das in den Schritten 1.2.1 bis 1.5.5 13-fache beschriebene Verfahren skalieren. Das reicht für 12 Reaktionen + 1 Extra.
2. Pol II CTD-Phosphorylierung
   1. Legen Sie das Rohr mit gewaschenen Dehnungskomplexen für 2 min in das magnetische Rack, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Perlen in 377 l BTB, ergänzt mit 13 l von 1,5 mM ATP, wieder auf.
   2. Bereiten Sie zwei neue Rohre mit der Bezeichnung +H bzw. -H vor. Zum Rohr mit der Bezeichnung +H 3 l von 300 ng/l TFIIH hinzufügen und auf das Rohr mit der Bezeichnung -H 9 l von 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% Glycerin, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL Rinderserumalbumin hinzufügen.
      HINWEIS: Wir verwenden in der Regel TFIIH gereinigt von Rattenleber, aber wir haben ähnliche Ergebnisse mit 0,6 g/Reaktion von kommerziell erhältlichen rekombinanten Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK, das ist das Kinase-Modul von TFIIH). Weitere Informationen finden Sie unter Tabelle der Materialien.
   3. Fügen Sie dem mit -H beschrifteten Rohr 87 l der gewaschenen Dehnungskomplexe ab Schritt 2.2.1 in das Mitrohr mit der Bezeichnung +H und 270 l gewaschener Dehnungskomplexe ein.
   4. Probe 2 min in magnetisches Rack geben. Um überschüssige Nukleotide und ungebundenes Protein zu entfernen, waschen Sie Dehnungskomplexe in +H- und -H-Reaktionen mit 90 l bzw. 270 l Waschpuffer.
3. RNA-Verkappung
   1. Dehnungskomplexe in der Mitschrift +H in 87 l Verschlussmischung (BTB ergänzt durch 50 M GTP (Tabelle 10) wieder aufsetzen Dehnungskomplexe in der Mitschrift -H beschrifteten Röhre in 261 l Verschlussmischung wieder aufhängen.
   2. Bereiten Sie 4 neue Röhren mit der Bezeichnung 5 ng CE+H, 5 ng CE, 15 ng CE, 45 ng CE vor. Verdünnt es in 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% Glycerin, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin zur Herstellung von Lösungen, die 5 ng CE/L, 15 ng CE/L oder 45 ng CE/L enthalten und 3 l der entsprechenden Lösung in jede der 4 Tuben verteilen.
   3. Bereiten Sie 12 neue Röhren mit jeweils 94 L Stopppuffer (2.1.1) vor.
   4. Beginnen Sie jede Verschließreaktion, indem Sie 87 L Dehnungskomplex hinzufügen, der mit TFIIH behandelt wird, oder nicht zu beschrifteten Röhrchen, die ein Verschlussenzym enthalten. Bei 30 °C in einem Wärmeblock inkubieren.
   5. Nach 1, 2 oder 4 min beenden Sie die Reaktionen, indem Sie 30 l jedes Reaktionsgemisches auf Röhren übertragen, die 94 l Stop-Puffer enthalten. Reinigen und analysieren Sie Reaktionsprodukte, wie in Abschnitt 3 beschrieben.

3. RNA-Reinigung und -Analyse

1. REINIGEN Sie RNA
   1. Inkubieren Sie Reaktionsprodukte im Stop-Puffer für 20 min bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Pausieren. Proben in diesem Puffer wurden bis zu 4 h ohne Verlust oder Abbau der RNA gepflegt.
   2. Extrakt einmal mit 124 l Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) und einmal mit Chloroform:Isoamylalkohol (24:1).
      ACHTUNG: Phenol ist extrem giftig und wird schnell von der Haut absorbiert. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung.
      HINWEIS: Um die Rückgewinnung von RNA während der Extraktion zu maximieren, verwenden Sie handelsübliche Röhren, die ein Gel mit hoher Dichte enthalten, das eine stabile Barriere zwischen wässrigen und organischen Phasen bildet. Siehe Diskussion und Tabelle der Materialien.
   3. Die wässrige Phase (obere Schicht) in neue Röhrchen mit 12,4 l von 3 M Natriumacetat pH 5,2 übertragen.
2. Ethanol-Fällung
   1. Fügen Sie 350 l 100% Ethanol hinzu und mischen Sie sie gründlich durch Inversion.
   2. Mindestens 10 min auf Trockeneis inkubieren.
      HINWEIS: Pausieren. Der Einfachheit halber kann man hier anhalten und das Verfahren am nächsten Tag abschließen; Es ist jedoch möglich, direkt mit Schritt 3.3 fortzufahren und das Gel am selben Tag auszuführen. Rna kann vor der Weiterverarbeitung einige Tage bei -80 °C aufbewahrt werden, lässt sie aber nicht länger.
3. Vorbereitung von RNA-Proben für die Gelelektrophorese
   1. Proben auftauen lassen, durch Invertieren 2-3-mal mischen und zentrifugieren 15 min bei 21.000 x g, 4 °C, in einer Tischzentrifuge. In der Zwischenzeit denaturierende Gelmischung einrichten (Abschnitt 3.4.1).
   2. Entfernen Sie Ethanol vorsichtig aus Proben, ohne Pellet zu stören.
   3. Fügen Sie 500 l 70% Ethanol hinzu, invertieren Sie das Rohr ein paar Mal, um Pellet zu waschen, und zentrieren Sie dann wieder bei 21.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur oder 4 °C.
   4. Entfernen Sie so viel Ethanol wie möglich und machen Sie eine schnelle Drehung (5-10 s) der Rohre in einer Tischzentrifuge. Entfernen Sie dann mit einer Gel-Ladespitze das letzte verbleibende Ethanolvolumen.
   5. Lufttrockenes Pellet für 3 min bei Raumtemperatur.
   6. Lösen Sie die RNA auf, indem Sie 4 L_H2O an die Oberseite jedes Pellets hinzufügen. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   7. Fügen Sie dem Mix 4 L 2x RNA-Farbstoff (siehe Tabelle derMaterialien) hinzu und wirbeln Sie dann jede Röhre für ein paar Sekunden aus, um die RNA vollständig wieder aufzusetzen.
      HINWEIS: Es wird ein RNA-Farbstoff empfohlen, der Formamid anstelle von Harnstoff enthält, da dieser bei niedrigen Temperaturen ausfällt.
   8. Drehen Sie die Rohre schnell und inkubieren Sie sie dann bei 70 °C für 10 min in einem Wärmeblock.
   9. Rohre auf Trockeneis lagern, bis sie bereit sind, auf Gel zu laden.
      HINWEIS: Das Halten von RNA auf Trockeneis ermöglicht die Flexibilität, an anderen Experimenten zu arbeiten, während das Gel polymerisiert. Proben müssen nach dem Auftauen nicht wieder erhitzt werden. Die RNA kann jedoch direkt nach dem Erhitzen geladen werden, wenn das Gel betriebsbereit ist.
4. Zubereitung von Harnstoff-PAGE-Gel
   1. Für 40 ml Gelmischung in einem 50 ml konischen Rohr kombinieren: 16,7 g Harnstoff, 15 ml 40% bis:Acrylamidlösung (19:1 Verhältnis), 4 ml 10x TBE (1 M Tris-HCl, 1 M Natriumborat, 20 ml EDTA) und 8 ml H₂O. Dieses Volumen reicht für ein Standard-Gel (18 cm Höhe x 16 cm Breite) mit 1,0 mm Abstandshaltern.
      ACHTUNG: Acrylamid ist extrem giftig. Während es kein Inhalationsrisiko gibt, wenn es in lösungsweise ist, tragen Sie immer Labormantel, Handschuhe und Schutzbrille während der Handhabung.
      HINWEIS: Diese Mischung ist für das Gießen eines denaturierenden 15% Polyacrylamid-Gels, das RNA leicht zwischen 15-50 nt auflöst. Ändern Sie die Konzentration von Bis/Acrylamid bei Bedarf, um verschiedene RNA-Transkripte unterschiedlicher Länge aufzulösen.
   2. Geschlossene Röhre mit Gelmischung auf einen Nutator legen, bis Harnstoff vollständig gelöst ist.
   3. Einrichtung einer Gelgießstation mit Glasplatten, 1 mm Abstandshaltern und einem 15-Well-Kamm.
   4. Wenn Sie schnell arbeiten, fügen Sie 40 L TEMED und 400 L 10% Ammoniumpersulfatlösung hinzu, um die Lösung zu gelen und gut zu mischen. Mit einer 25 ml Pipette, gießen Gel-Lösung zwischen den Platten, fügen Sie Kamm, und lassen Sie das Gel für mindestens 2 h polymerisieren.
      HINWEIS: Wenn das Gel vor Gebrauch mehr als 2 h gegossen wird, nachdem es polymerisiert hat, bedecken Sie es mit feuchtem Papiertuch (den Kamm an Ort und Stelle lassen) und wickeln Sie es mit Plastikfolie, um zu verhindern, dass es austrocknet.
5. Denaturing Gel RNA Elektrophorese
   1. Nach der Polymerisation das Gel in den laufenden Tank geben und bei 20 mA in 1x TBE für 15-30 min vorführen.
   2. In der Zwischenzeit Proben (falls gefroren), Wirbel, auftauen und 4 min bei 2.000 x g, 4 °C drehen.
   3. Wenn Sie bereit sind, schalten Sie das Netzteil aus und spülen Sie jeden Brunnen vorsichtig mit 1x TBE mit einer Spritze ab.
   4. Verwenden Sie Gel-Ladespitzen, um Proben auf das Gel zu laden.
   5. Führen Sie Gel bei einer konstanten 20-30 mA für ca. 2 h oder bis niedriger Farbstoff (Xylol cyanol FF) den Boden des Gels erreicht.
6. Entfernen Sie das Gel, legen Sie es auf ein Stück saugfähiges Papier und wickeln Sie es mit Plastikfolie.
7. Setzen Sie das radioaktiv markierte Gel einem Phosphorscreen aus.
8. Scannen Sie phosphorscreen mit einem Phosphorimager und analysieren Sie das Bild.

Ergebnisse

Die Abbildungen 2 und 3 zeigen repräsentative Ergebnisreaktionen, die zur Erzeugung künstlicher Dehnungskomplexe verwendet werden, die Transkripte unterschiedlicher Länge enthalten, indem sie sich erweitern oder Pol II aus verschiedenen Quellen beziehen. Abbildung 4 zeigt, wie diese Dehnungskomplexe verwendet werden können, um die co-transkriptionelle CTD-Phosphorylierungsabhängige RNA-Verkappung zu assay.

Diskussion

Studien, die Ereignisse, die mit dem Pol II-Dehnungskomplex gekoppelt sind, wie die RNA-Verarbeitung und die Regulation der Transkriptdehnung selbst, sezieren sollen, können durch den Einsatz eines hochgereinigten Enzymsystems erheblich erleichtert werden. Der Aufbau solcher Enzymsysteme kann eine Herausforderung sein. Die durch den Veranstalter abhängige Transkription durch Pol II erfordert mindestens fünf allgemeine Transkriptionsfaktoren. Die Vorbereitung und Lagerung dieser Faktoren kann Monate dauern; Daher ist d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
[α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi	Perkin Elmer	NEG007H001MC	For radiolabeling RNA
2x RNA loading dye	New England Biolabs	B0363S	Highly recommended. For preparing RNA during gel loading
40% Bis:Acrylamide solution	Biorad	1610144
Bovine Serum Albumin (20 mg/mL)	New England Biolabs	B9000S
Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg	Millipore Sigma	14-476	Used to phosphorylate Pol II CTD
DNA oligonucleotides	IDT		See Table 8 for purity specifications
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	Life Technologies Invitrogen	65001	We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL)	Life Technologies Invitrogen	AM9516	Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle
Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb	Hoefer	SE600-15-1.5
MaXtract high density tubes (1.5 mL)	Qiagen	129046	Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions
Proteinase K solution (20 mg/mL)	Life Technologies Invitrogen	25530049
RNA oligonucleotides	Trilink		See Table 8 for more details
Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/mL)	New England Biolabs	NEBM2403S	Required only during capping reactions