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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ici, nous décrivons l'assemblage des complexes d'allongement de polymérase II d'ARN II (Pol II) exigeant seulement l'ADN synthétique court et les oligonucléotides synthétiques et pol II purifié. Ces complexes sont utiles pour étudier les mécanismes sous-jacents au traitement co-transcriptionnel des transcriptions associées au complexe d'allongement de Pol II.

Résumé

La synthèse eucaryote d'ARNm est un processus biochimique complexe exigeant la transcription d'un modèle d'ADN dans un ARN précurseur par la polymérase D'ARN II d'enzyme multi-subunit et le plafonnement et l'épissage co-transcriptionnels de l'ARN précurseur pour former l'ARNm mûr. Pendant la synthèse de l'ARNm, le complexe d'allongement de la polymérase DE l'ARN II est une cible de régulation par une vaste collection de facteurs de transcription qui contrôlent son activité catalytique, ainsi que les enzymes de plafonnement, d'épissage et de traitement de 3' qui créent l'ARNm mature. En raison de la complexité inhérente de la synthèse de l'ARNm, des systèmes expérimentaux plus simples permettant l'isolement et l'étude de ses différentes étapes de cotranscription ont une grande utilité.

Dans cet article, nous décrivons un tel système expérimental simple approprié pour étudier le plafonnement co-transcriptionnel d'ARN. Ce système repose sur des complexes d'allongement de la polymérase II à ARN défini assemblés à partir de polymérase purifiée et de bulles de transcription artificielles. Lorsqu'ils sont immobilisés par l'ADN biotinylated, ces complexes d'allongement de polymérase II d'ARN fournissent un outil facilement manipulable pour disséquer le plafonnement et les mécanismes co-transcriptionnels d'ARN par lesquels le complexe d'élongation recrute et régule l'enzyme de plafonnement pendant co-transcriptionnel RNA plafonnement. Nous prévoyons que ce système pourrait être adapté pour étudier le recrutement et/ou l'assemblage de protéines ou de complexes protéiques avec des rôles à d'autres étapes de maturation de l'ARNm couplés au complexe d'allongement de la polymérase DE l'ARN II.

Introduction

La synthèse de l'ARN de messager eucaryotique (ARNm) est un processus biochimique élaboré qui implique la synthèse d'un ARN précurseur non traité par la polymérase II d'ARN et le traitement de l'ARN précurseur pour produire l'ARNm mûr. Les étapes de traitement de l'ARN du plafonnement, de l'épissage et de la polyadenylation sont effectuées en grande partie de façon cotranscription. Le complexe d'allongement Pol II sert d'échafaudage qui recrute et orchestre les activités de nombreuses enzymes de traitement de l'ARN. Par conséquent, notre compréhension ultime de la façon dont les ARNm eucaryotes matures sont générées dépendra fortement du développement de systèmes expérimentaux pour permettre la dissection des mécanismes biochimiques sous-jacents au recrutement au complexe d'allongement et la régulation des enzymes responsables du plafonnement, de l'épissage et de la polyadenylation cotranscriptionnel.

Comme on pouvait s'y attendre, le développement de tels systèmes expérimentaux a été difficile. Un obstacle majeur a été la complexité remarquable de la transcription Pol II elle-même où la simple reconstitution de la transcription basale par Pol II in vitro nécessite un ensemble minimum de cinq facteurs d'initiation à la transcription générale: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, et TFIIH 1. En outre, la reconstitution de toute forme de transcription réglementée de Pol II in vitro nécessite un ensemble encore plus grand de facteurs de transcription et de corégulateurs. Ainsi, un objectif majeur a été de développer des systèmes expérimentaux plus simples permettant la reconstitution de complexes d'allongement actifs Pol II adaptés aux investigations du couplage fonctionnel de la transcription de Pol II et du traitement de l'ARN.

Une telle méthode plus simple pour reconstituer les complexes actifs d'allongement de Pol II s'est avérée utile pour des études structurales et biochimiques de pol II allongée et, plus récemment, pour étudier le traitement co-transcriptionnel d'ARN2,3 ,4,5. Dans cet article, nous montrons comment les complexes d'allongement Pol II préparés à partir de Pol II purifiéet et bulles de transcription synthétiques peuvent être utilisés efficacement pour étudier les mécanismes sous-jacents co-transcriptionnel plafonnement des transcriptions naissantes Pol II.

Le plafonnement fait référence à l'ajout covalent d'un « bouchon » de 5'-guanosine à l'extrémité de 5'-triphosphate des transcriptions naissantes de Pol II. Le plafond est important pour les étapes ultérieures de maturation de l'ARNm, le transport, la traduction et d'autres processus6,7. Le bouchon est ajouté co-transcriptionnellement aux transcriptions de Pol II par une enzyme appelée enzyme de plafonnement. Dans les cellules de mammifères, les sites actifs responsables de l'ARN 5'-triphosphatase et guanylyl transferase activités de l'enzyme de plafonnement sont contenus dans un polypeptide unique8. L'enzyme de plafonnement est recrutée au complexe d'allongement Pol II par des interactions avec des surfaces encore à définir sur le corps Pol II et le domaine de carboxy-terminal Rpb1 (CTD) phosphorylé sur Ser5 de son heptapeptide répète5. Dans le complexe d'allongement, l'enzyme de plafonnement catalyse l'ajout d'un bouchon de 5'-guanosine une fois que la transcription naissante atteint une longueur d'au moins 18 nucléotides et a émergé du canal de sortie de l'ARN polymérase. Dans la première étape de la réaction de plafonnement, la triphosphatase hydrolyse l'ARN 5'-triphosphate pour produire un 5'-diphosphate. Dans la deuxième étape, GTP est hydrolysé à GMP par le transfert de guanylyl, formant une enzyme GMP-capping intermédiaire. Enfin, le transfert de guanylyl transfère GMP à l'extrémité 5'-diphosphate de la transcription naissante pour produire le bouchon.

Une caractéristique remarquable de la réaction de plafonnement est que le plafonnement co-transcriptionnel (c.-à-d., plafonnement des transcriptions associées aux complexes fonctionnels d'allongement de Pol II) est beaucoup plus efficace que le plafonnement de l'ARN libre5,9. Ainsi, une question majeure dans le domaine a été de savoir comment cette activation spectaculaire du plafonnement est réalisée par des interactions de l'enzyme de plafonnement avec le complexe d'allongement Pol II. Dans ce protocole nous décrivons l'assemblage des complexes actifs d'allongement de polymérase d'ARN II utilisant seulement la polymérase II purifiée d'ARN et les bulles artificielles de transcription. Ces méthodes permettent la création de complexes d'allongement de la polymérase D'ARN II avec des transcriptions de longueur et de séquence définies. Dans une étude récente, nous avons utilisé ces complexes d'allongement de la polymérase II à ARN défini comme modèle pour étudier les aspects des mécanismes de l'ARN plafonnant5. En particulier, nous avons montré que (i) le plafonnement de l'ARN associé à ces complexes d'allongement était plus de 100 fois plus efficace que le plafonnement de l'ARN libre et (ii) a été stimulé par la phosphorylation TFIIH-dépendante du CTD Pol II. L'approche décrite ici pourrait en principe être adaptée pour générer des substrats pour étudier d'autres réactions de traitement de l'ARN co-transcriptionnel liées au complexe d'allongement de Pol II.

Dans la section 1 de ce protocole, les complexes artificiels d'allongement sont créés en annealing un oligonucléotide synthétique de brin de modèle à un oligonucléotide d'ARN qui est complémentaire à son 3'-extrémité à approximativement 9 nucléotides de l'ADN de brin de modèle. Pol II est ensuite chargé sur le duplex DNA:RNA. Le complexe d'allongement est ensuite complété par l'ajout d'un oligonucléotide d'ADN brin partiellement complémentaire et non-modèle qui est étiqueté avec de la biotine à son 3'-extrémité (figure1 et figure 2A). L'oligonucléotide d'ARN est étendu par Pol II dans ces complexes d'allongement pour faire des transcriptions radiolabeled de longueur et de séquence définies sur l'addition des combinaisons appropriées des nucléotides radiolabeled. En outre, en utilisant une combinaison de lavages pour enlever les nucléotides non incorporés et l'ajout de différentes combinaisons de nucléotides, on peut "marcher" Pol II à différentes positions le long du modèle d'ADN et synthétiser l'ARN de longueurs définies. L'ARN est ensuite purifié et soumis à l'électrophorèse dans la dénaturation des gels urée-PAGE. Dans la section 2 du protocole, des complexes artificiels d'allongement sont utilisés pour analyser le plafonnement de l'ARN cotranscriptionnel. L'exemple présenté mesure l'effet de la phosphorylation TFIIH-dépendante du CTD de Pol II sur le plafonnement co-transcriptionnel d'ARN. Dans cette expérience, nous mesurons l'étendue du plafonnement co-transcriptionnel en fonction du plafonnement de la concentration enzymatique (5, 15 et 45 ng par réaction) et du temps (1, 2 et 4 min).

Protocole

1. Assemblage de complexes d'allongement artificiel et de marche Pol II

  1. Immobiliser 1 nmol d'oligo d'ADN non-modèle contenant une molécule de biotine de 3' sur des perles magnétiques.
    REMARQUE :     Les étapes suivantes peuvent être effectuées à l'avance pour préparer de futures expériences. Toutes les séquences d'oligo utilisées dans ce protocole sont fournies dans le tableau 1. Les oligos d'ARN sont synthétisés avec des modifications de 5'-triphosphate.
    1. Ajouter 200 l de perles magnétiques (10 mg/ml) dans un tube de 1,5 ml de liaison à faible teneur en protéines, puis placer sur un support magnétique pendant 2 min.
    2. Pendant que le tube est sur le support magnétique, retirez le liquide du tube sans déranger les perles. Pour laver les perles, retirer le tube de la grille, ajouter 1 ml de 5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, remettre le tube à la grille, et retirer la solution de lavage après 2 min.
    3. Répéter les lavages 2 fois de plus à l'aide de 200 l d'un même tampon.
    4. Resuspendre les perles magnétiques dans 400 'L de 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, tampon. Ensuite, mélangez avec 380 OL de H2O et 20 'L de 10 'M oligo d'ADN biotinylated non-modèle. Placer le tube sur un écrou et couver pendant 30 min à température ambiante.
    5. Laver l'oligo d'ADN non-modèle immobilisé 3 fois avec 200 l de 5 mM Tris-HCl pH 7.5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, puis 3 fois avec 200 oL de 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glycérol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL d'albumine de sérum bovin.
    6. Laisser le tube pendant la nuit à 4 oC pour finir de bloquer les perles avec bSA.
    7. Le lendemain, placez le tube dans le support magnétique, retirez et jetez le liquide, et resuspendez les perles dans 200 'L de 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glycérol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0.5 mg/mL d'albumine de sérum bovin et transférer dans un nouveau tube. Pour ce modèle d'ADN, la concentration finale est d'environ 5 M.
      REMARQUE: Le temps d'incubation et la concentration d'oligo doivent être déterminés empiriquement pour chaque oligo d'ADN biotinylated. Ce modèle devrait fournir suffisamment pour 200 réactions, et durer au moins 6 mois lorsqu'il est stocké à 4 oC.
  2. Oligos d'oligonucléotide d'ARN anneal et de modèle d'ADN dans un rapport molaire de 2:1 (20 et 10 pmol, respectivement) pour obtenir le duplex d'ADN:ARN.
    1. Mettre en place un mélange d'annealing de 10 l tel que décrit dans le tableau 2.
      REMARQUE : 10 ll de mélange d'annealing sont suffisants pour 10 réactions. Le mélange d'annealing peut être mis à l'échelle au besoin si d'autres essais doivent être effectués.
    2. Effectuer les réactions d'annealing dans un cycleur thermique en utilisant le programme suivant : 5 min à 45 oC, suivi de 12 cycles de 2 min chacun, à partir de 43 oC et diminuant la température de 2 oC par cycle. Indile au 4 oC.
      REMARQUE: Il s'agit d'un point de temps flexible. L'annealing est terminé à moins de 30 minutes, mais peut être laissé à 4 oC pendant une plus longue période. En laboratoire, les mélanges d'annealing ont été laissés assis pendant jusqu'à 4 h sans observer aucune diminution de l'efficacité de réaction.
    3. Pendant l'annexion de l'ARN à l'ADN du brin de modèle, préparez des tampons pour les étapes ultérieures du protocole. Les ingrédients nécessaires pour préparer chaque tampon pour une seule réaction avec chaque tampon sont énumérés dans les tableaux 2 à 8. Échelle des recettes par un facteur de [Y(X 1) 1] pour le lavage et (X-1) pour tous les autres tampons. X - nombre de réactions à préparer; Y - nombre d'étapes de lavage nécessaires (minimum 3).
      REMARQUE : Préparez tous les tampons frais le jour de l'expérience. Ne placez pas de tubes sur la glace après l'ajout de PVA aux tampons. Ajouter Pol II ou nucléotides dans des tampons juste avant de l'utiliser.
  3. Chargez la polymérase d'ARN purifiée II sur l'hybride ADN:ARN.
    1. Mélanger 1 pmol (1 L) de duplex d'ADN:ARN avec 13 l de tampon Pol II (à partir du tableau 3).
    2. Ajouter 0,02 unité d'ARN purifié Pol II (1 l) au mélange à partir de l'étape 1.3.1 et mélanger en pipetting doucement de haut en bas et en remuant avec la pointe de pipet, sans introduire de bulles. Incuber pendant 10 min à 30 oC.
      REMARQUE: Les volumes donnés à partir de maintenant sont pour une seule réaction; d'accroître le nombre de réactions dans l'expérience. L'ARN Pol II purifié du foie de rat tel que décrit10 est utilisé dans cet exemple ; cependant, l'ARN Pol II purifié à partir d'autres sources, y compris les cellules de mammifères cultivés ou de levure peut également être utilisé3,4,5,11,12,13.
  4. Complétez le complexe d'allongement par l'ajout de l'ADN non-modèle biotinylated.
    1. Ajouter 5 pmol (1 L) d'oligo d'ADN non-modèle immobilisé à 14 l de tampon d'ADN non-modèle (à partir du tableau4), ajouter au tube à partir de l'étape 1.3.2, et couver pendant 10 min à 37 oC.
    2. Placer l'échantillon dans un support magnétique pendant 2 min. Laver 1x avec 30 l de tampon de lavage (à partir du tableau 7) pour enlever les Pol II et les oligos non incorporés.
  5. Générer des complexes d'allongement contenant de l'ARN radio-étiqueté 23mers.
    1. Effectuer toutes les autres incubations à 30 oC. Ajouter 1 'L'ATP de 15 'M et 10 'Ci (1 'L) de [-32P] UTP (3 000 Ci/mmol) à 23 'L de tampon pulse et l'utiliser pour resuspendre les perles magnétiques lavées.
      MISE EN GARDE: Les matières radioactives sont dangereuses. Assurez-vous de porter l'équipement de protection approprié et de suivre toutes les directives du laboratoire pour une utilisation et une élimination sécuritaires des matières radioactives.
      REMARQUE: Remplacer l'UTP radiolabeled par 15 UTP de M quand l'ARN radiolabeled n'est pas nécessaire, comme pour des expériences occidentales de tache.
    2. Incuber la réaction pendant 10 min pour permettre la synthèse des 23mers radio-étiquetés.
    3. Ajouter 1,5 L de solution contenant 100 M ATP et 100 M de mélange UTP à 3,5 l de tampon de chasse, ajouter au tube contenant des complexes d'allongement préassemblés, et incuber pendant 5 minutes pour chasser toutes les transcriptions naissantes en 23mers.
    4. Placer l'échantillon dans une grille magnétique pendant 2 min, retirer le supernatant, laver une fois avec 30 l de tampon de lavage pour enlever les nucléotides non incorporés, et resuspendre dans 30 l de tampon de lavage.
    5. Ajoutez 94 ll de mélange d'arrêt avec la protéase K et le glycogène (tableau 9) pour mettre fin aux réactions ou passez à la section 1.6 pour générer des complexes d'allongement avec des transcriptions plus longues ou la section 2 pour effectuer des essais de plafonnement.
  6. (Facultatif) Walk Pol II pour faire 23, 25 et 29 transcriptions de nucléotides
    1. Suivez la procédure décrite dans les étapes 1.2.1 à 1.5.4 pour préparer des complexes d'allongement contenant des 23mers radio-étiquetés. Échelle jusqu'à 4 fois pour générer 120 L de complexes d'allongement lavés, ce qui est assez complexes pour 4 réactions.
    2. Étiquette 3 nouveaux tubes "23mer", "25mer" et "29mer". Transférer 30 l de complexes d'allongement lavés dans le tube « 23mer » et ajouter 94 l de mélange d'arrêt avec la protéinase K et le glycogène.
    3. Placez le tube contenant les 90 l restants de complexes d'allongement lavés dans le support magnétique pendant 2 min, retirez le supernatant et suspendez les perles dans 90 L de BTB complétées par 1,2 L chacune de 1,5 mM ATP et 1,5 mM CTP. Incuber pendant 10 min à 30 oC.
    4. Après avoir lavé une fois avec 90 l de tampon de lavage et de suspension dans 90 l de tampon de lavage comme décrit à l'étape 1.5.4, transférer 30 'L de complexes d'allongement à "25mer" tube et ajouter 94 'L de mélange d'arrêt avec proteinase K et glycogène.
    5. Placez le tube contenant les 60 l restants de complexes d'allongement dans le support magnétique pendant 2 min, retirez le supernatant et suspendez les perles dans 60 L de BTB complétées de 0,8 L chacune de 1,5 mM ATP et 1,5 mM de CTP.
    6. Incuber pendant 10 min à 30 oC, laver une fois avec 60 l de tampon de lavage comme dans la section 1.5.5, et resuspendre dans 60 'L de tampon de lavage.
    7. Transférer 30 l de l'échantillon 2x au tube "29mer" et ajouter 94 'L de mélange d'arrêt avec la protéase K et le glycogène ou passer à la section 2 pour effectuer des essais de plafonnement.
    8. Procéder à la purification et à l'analyse de l'ARN (section 3).

2. Utilisation de complexes d'allongement artificiel pour mettre en œ9 cotranscription

  1. Générer des complexes d'allongement lavés contenant 23mers en augmentant la procédure décrite dans les étapes 1.2.1 à 1.5.5 13 fois. C'est suffisant pour 12 réactions et 1 de plus.
  2. Phosphorylation CTD Pol II
    1. Placez le tube contenant des complexes d'allongement lavés dans le support magnétique pendant 2 min, retirez le supernatant et suspendez les perles dans 377 L de BTB complétées par 13 L de 1,5 mM ATP.
    2. Préparer deux nouveaux tubes, étiquetés respectivement H et -H. Pour le tube étiqueté H ajouter 3 'L de 300 ng/L TFIIH, et à la tube étiquetée -H ajouter 9 'L de 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glycérol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0.5 mg/mL d'albumine de sérum bovin.
      REMARQUE: Nous utilisons généralement TFIIH purifié à partir du foie de rat, mais nous avons obtenu des résultats similaires en utilisant 0,6 g / réaction de la recombinante commercialement disponible Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK, qui est le module kinase de TFIIH). Voir Tableau des matériaux pour plus d'informations.
    3. Ajouter 87 l des complexes d'allongement lavés de l'étape 2.2.1 au tube étiqueté H et 270 oL de complexes d'allongement lavés au tube étiqueté -H. Incubate 10 min à 30 oC.
    4. Placer l'échantillon dans un support magnétique pendant 2 min. Pour éliminer l'excès de nucléotides et de protéines non liées, lavez les complexes d'allongement dans les réactions H et -H avec 90 l ou 270 l de tampon de lavage, respectivement.
  3. Plafonnement de l'ARN
    1. Resuspendre les complexes d'allongement dans le tube étiqueté H en 87 'L de mélange de plafonnement (BTB complété par 50 GTP M (tableau 10). Resuspendre les complexes d'allongement dans le tube étiqueté -H en 261 'L de mélange de plafonnement.
    2. Préparer 4 nouveaux tubes étiquetés 5 ng CE-H, 5 ng CE, 15 ng CE, 45 ng CE. Diluer l'enzyme de plafonnement (CE) en 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20 % de glycérol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL d'albumine de sérum bovin pour préparer des solutions contenant 5 ng CE/L, 15 ng CE/L, ou 45 ng CE/L et distribuer 3 l de la solution appropriée dans chacun des 4 tubes.
    3. Préparer 12 nouveaux tubes avec 94 ll de mémoire tampon d'arrêt (2.1.1) ajoutéà à chacun.
    4. Commencez chaque réaction de plafonnement en ajoutant 87 L de complexe d'allongement traité avec TFIIH ou non à des tubes étiquetés contenant de l'enzyme de plafonnement. Incuber à 30 oC dans un bloc de chaleur.
    5. Après 1, 2 ou 4 min, arrêtez les réactions en transférant 30 ll de chaque mélange de réaction vers des tubes contenant 94 ll de mémoire tampon d'arrêt. Purifie et analysez les produits de réaction tels que décrits à la section 3.

3. Purification et analyse de l'ARN

  1. Purifier l'ARN
    1. Incuber les produits de réaction dans un tampon d'arrêt pendant 20 min à température ambiante.
      REMARQUE: Point de pause. Les échantillons dans ce tampon ont été maintenus jusqu'à 4 h sans perte ou dégradation de l'ARN.
    2. Extraire une fois avec 124 ll de phénol:chloroform:isoamyl alcool (25:24:1) et une fois avec chloroform:isoamyl alcool (24:1).
      MISE EN GARDE: Le phénol est extrêmement toxique et est rapidement absorbé par la peau. Portez un équipement de protection approprié.
      REMARQUE: Pour maximiser la récupération de l'ARN pendant l'extraction, utilisez des tubes disponibles dans le commerce contenant un gel à haute densité, qui constitue une barrière stable entre les phases aqueuses et organiques. Voir Discussion et Tableau des matériaux.
    3. Transférer la phase aqueuse (couche supérieure) dans de nouveaux tubes contenant 12,4 L de 3 M d'acétate de sodium pH 5,2.
  2. Précipitations d'éthanol
    1. Ajouter 350 l d'éthanol à 100 % et bien mélanger par inversion.
    2. Incuber au moins 10 min sur de la glace sèche.
      REMARQUE: Point de pause. Pour plus de commodité, on peut s'arrêter ici et terminer la procédure le lendemain; cependant, il est possible de procéder directement à l'étape 3.3 et d'exécuter le gel le même jour. L'ARN peut être maintenu à -80 oC pendant quelques jours avant la poursuite du traitement, mais ne partez pas plus longtemps.
  3. Préparation d'échantillons d'ARN pour l'électrophoresis de gel
    1. Laisser les échantillons décongeler, mélanger en inversant 2-3 fois, et centrifuger pendant 15 min à 21 000 x g, 4 oC, dans une centrifugeuse de table. Pendant ce temps, configurez le mélange de gel dénaturant (section 3.4.1).
    2. Retirez soigneusement l'éthanol des échantillons sans déranger les granulés.
    3. Ajouter 500 l à l'éthanol à 70 %, inverser le tube une couple de fois pour laver les granulés, puis centrifuger à nouveau à 21 000 x g pendant 5 min à température ambiante ou à 4 oC.
    4. Retirer autant d'éthanol que possible et faire une rotation rapide (5-10 s) des tubes dans une centrifugeuse de table. Ensuite, à l'aide d'une pointe de chargement de gel, retirez le dernier volume d'éthanol restant.
    5. Granulés secs à l'air pendant 3 min à température ambiante.
    6. Dissoudre l'ARN en ajoutant 4 oL de H2O au sommet de chaque granule. Incuber 5 min à température ambiante.
    7. Ajouter 4 ll de colorant à ARN 2x (Voir tableau des matériaux)au mélange, puis vortex chaque tube pendant quelques secondes pour resuspendre complètement l'ARN.
      REMARQUE: Le colorant d'ARN qui contient le formamide au lieu de l'urée est recommandé, puisque ce dernier précipite à basse température.
    8. Faites tourner rapidement les tubes, puis incuber les tubes à 70 oC pendant 10 min dans un bloc de chaleur.
    9. Conserver les tubes sur la glace sèche jusqu'à ce qu'ils soient prêts à charger sur du gel.
      REMARQUE :       Garder l'ARN sur la glace sèche permet la flexibilité de travailler sur d'autres expériences pendant que le gel est polymérisant. Les échantillons n'ont pas besoin d'être réchauffés après la décongélation. Cependant, l'ARN peut être chargé directement après le chauffage si le gel est prêt à fonctionner.
  4. Préparation du gel Urea-PAGE
    1. Pour un mélange de gel de 40 ml, mélanger dans un tube conique de 50 ml : 16,7 g d'urée, 15 ml de 40 % de solution bis:acrylamide (19:1 ratio), 4 mL de 10x TBE (1 M Tris-HCl, 1 M de borate de sodium, 20 mM EDTA) et 8 mL de H2O. Ce volume est suffisant pour un gel de taille standard (18 cm de hauteur x 16 cm de largeur) avec des espaceurs de 1,0 mm.
      MISE EN GARDE: L'acrylamide est extrêmement toxique. Bien qu'il n'y ait aucun risque d'inhalation lorsqu'il est en solution, portez toujours une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de sécurité pendant la manipulation.
      REMARQUE: Ce mélange est pour la coulée d'un gel dénaturant 15% de polyacrylamide, qui résout facilement l'ARN entre 15-50 nt. Changer la concentration de bis/acrylamide au besoin pour résoudre différentes transcriptions d'ARN de différentes longueurs.
    2. Placer le tube fermé contenant le mélange de gel sur un nutator jusqu'à ce que l'urée soit complètement dissoute.
    3. Installez une station de coulée de gel avec des plaques de verre, des minuteries de 1 mm et un peigne de 15 puits.
    4. En travaillant rapidement, ajoutez 40 L de TEMED et 400 L de solution persulfate d'ammonium de 10 % pour geler la solution et bien mélanger. À l'aide d'une couchette de 25 ml, verser la solution de gel entre les plaques, insérer le peigne et laisser le gel polymériser pendant au moins 2 h.
      REMARQUE: Si le gel est versé plus de 2 h avant utilisation, une fois qu'il a polymérisé le couvrir avec un essuie-tout humide (laissant le peigne en place) et envelopper avec une pellicule plastique pour l'empêcher de sécher.
  5. Électrophorésis d'ARN de gel dénaturant
    1. Après la polymérisation, transférer le gel au réservoir de fonctionnement et le pré-exécuter à 20 mA en 1x TBE pendant 15-30 min.
    2. Pendant ce temps, décongeler les échantillons (s'ils sont congelés), les vortex et les faire tourner pendant 4 min à 2 000 x g,4 oC.
    3. Une fois prêt, éteignez l'alimentation et rincez soigneusement chaque puits à l'aide de 1x TBE à l'aide d'une seringue.
    4. Utilisez des pointes de chargement de gel pour charger des échantillons sur le gel.
    5. Exécuter le gel à une constante de 20-30 mA pendant environ 2 h ou jusqu'à ce que le colorant inférieur (xylène cyanol FF) atteigne le fond du gel.
  6. Retirer le gel, le placer sur un morceau de papier absorbant et l'envelopper d'une pellicule plastique.
  7. Exposer le gel radiolabeled à un écran de phosphore.
  8. Scanner l'écran phosphore à l'aide d'un phosphorimager et analyser l'image.

Résultats

Les figures 2 et 3 montrent des réactions représentatives des résultats utilisées pour générer des complexes d'allongement artificielcontenant contenant des transcriptions de différentes longueurs en étendant ou Pol II de différentes sources. La figure 4 montre comment ces complexes d'allongement peuvent être utilisés pour déterminer le plafonnement de l'ARN dépendant de la phosphorylation CTLation cotranscriptio...

Discussion

Les études qui cherchent à disséquer les événements couplés au complexe d'allongement de Pol II tels que le traitement de l'ARN et la régulation de l'allongement de transcription lui-même peuvent être grandement facilitées par l'utilisation d'un système enzymatique fortement purifié. La mise en place de tels systèmes enzymatiques peut être difficile. La transcription dépendante du promoteur par Pol II nécessite au moins cinq facteurs de transcription généraux. La préparation et le stockage de ces facte...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Nous remercions S. Shuman d'avoir fourni l'adncadapage de l'enzyme de plafonnement des mammifères. Ce travail a été soutenu en partie par une subvention au Stowers Institute for Medical Research du Helen Nelson Medical Research Fund de la Greater Kansas City Community Foundation.  Les données originales sous-jacentes à ce manuscrit peuvent être consultées à partir du dépôt de données d'origine Stowers à http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
[α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCiPerkin ElmerNEG007H001MCFor radiolabeling RNA
2x RNA loading dyeNew England BiolabsB0363SHighly recommended. For preparing RNA during gel loading
40% Bis:Acrylamide solutionBiorad1610144
Bovine Serum Albumin (20 mg/mL)New England BiolabsB9000S
Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µgMillipore Sigma14-476Used to phosphorylate Pol II CTD
DNA oligonucleotidesIDTSee Table 8 for purity specifications
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Life Technologies Invitrogen65001We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL)Life Technologies InvitrogenAM9516Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle
Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well combHoeferSE600-15-1.5
MaXtract high density tubes (1.5 mL)Qiagen129046Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions
Proteinase K solution (20 mg/mL)Life Technologies Invitrogen25530049
RNA oligonucleotidesTrilinkSee Table 8 for more details
Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/mL)New England BiolabsNEBM2403SRequired only during capping reactions

Références

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