JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים פרוטוקולים כדי להכין זיהומים ולטהר את הנבגים עבור לימוד זיהום של המעי האנושי ואורגאואידים על ידי הקריפטוספורידיום parvum. אנו מדגימים את ההליכים למיקרו הזרקה של טפילים לתוך מעיים אורגנואיד וכתמים של אורגנואידים. לבסוף, אנו מתארים את הבידוד. של ציסטות שנוצרו מהאורגנואידים

Abstract

קריפטוספורידיום parvum הוא אחד הגורמים העיקריים של מחלת diarrheal אנושי. כדי להבין את הפתולוגיה של הטפיל ולפתח תרופות יעילות, מערכת תרבות מבחנה המהווה את התנאים במארח יש צורך. אורגנואידים, הדומה מאוד לרקמות המוצא שלהם, הם אידיאליים ללימוד אינטראקציות מארחים-פרזיאליות. אורגנואידים הם תלת-ממדיים (3D) מבנים מבוססי רקמה הנגזרים מתאי גזע בוגרים וגדלים בתרבות לפרקי זמן ארוכים מבלי לעבור סטייה גנטית או טרנספורמציה. יש להם קוטביות מוגדרת היטב עם משטחי פסגה וגם בזלת צלעות. אורגנואידים יש יישומים שונים בדיקות סמים, ביו בנקאות, ומידול מחלות ומארח-חיידק אינטראקציה לימודים. כאן אנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד של איך להכין את הנבגים ואת הספוראוזוטים של קריפטוספורידיום לזיהום המעי האנושי אורגנואידים. אנו לאחר מכן להדגים כיצד מיקרוהזרקה ניתן להשתמש כדי להזריק את החיידקים לתוך אורגאיד לומן. ישנן שלוש שיטות עיקריות שבהן ניתן להשתמש באורגנואידים למחקרים מארחים-חיידק-מיקרוהזרקה, הטיה מכנית וציפוי, ועל ידי ביצוע monolayers. מיקרוהזרקה מאפשרת תחזוקה של המבנה התלת-ממדי ומאפשרת שליטה מדויקת באמצעי הטפיל והמגע הישיר הרשמי של החיידקים. אנו מספקים פרטים עבור צמיחה אופטימלית של אורגנואידים עבור הדמיה או הייצור הoocyst. בסופו של דבר, אנו גם להדגים כיצד אאוציסטות שנוצר לאחרונה ניתן מבודד אורגאיד עבור המשך עיבוד וניתוח במורד הזרם.

Introduction

התפתחות של תרופות או חיסונים לטיפול ומניעה של הדבקת הצפנה היתה מעכבת היעדר מערכות מבחנה אשר לחקות בדיוק את המצב vivo בבני אדם1,2. רבים מהמערכות הזמינות כעת רק לאפשר זיהום לטווח קצר (< 5 ימים) או לא לתמוך במחזור החיים המלא של הטפיל3,4. מערכות אחרות המאפשרות התפתחות מלאה של הטפיל מבוססים על קווי תאים מונצח או תאים סרטניים שאינם בנאמנות המצב הפיזיולוגי של בני אדם5,6,7 . אורגנואידים או ' מיני איברי ' הם 3D רקמות נגזרות מבנים אשר גדלים במטריצה מתוך החילוץ שנוספו עם רקמות שונות מסוימים הצמיחה גורמים. אורגנואידים פותחו מאיברים שונים ורקמות. הם יציבים מבחינה גנטית ומוארכים את רוב התפקודים של אברי המוצא שלהם, ויכולים להישמר בתרבות לפרקי זמן ארוכים. פיתחנו שיטה לזיהום המעי האנושי והריאות אורגנואידים עם Cryptosporidium המספקת מודל מדויק של מבחנה למחקר של אינטראקציות מארח טפיל רלוונטי מעיים והצפנת הנשימה8 ,9,10,11,12,13. בניגוד לדגמים אחרים של תרבות שפורסמו, מערכת האורגנואיד מייצגת אינטראקציות טפיל מארח של החיים האמיתיים, מאפשרת השלמת מחזור החיים כך שכל השלבים של מחזור החיים הטפיל ניתן ללמוד, ושומר על התפשטות הטפיל עד 28 ימים10.

Cryptosporidium parvum הוא טפיל apicom, אשר מדביק את האפיתל של הנשימה ומעיים שדות, גרימת מחלה diarrheal ממושכת. השלב הסביבתי עמיד הוא oocyst, נמצא מזון מזוהם מים14. לאחר שבלע או שאפה, את הריזוטו ומשחרר ארבעה sporozoites כי לצרף לתאי אפיתל. Sporozoites להחליק על תאים מארחים ולעסוק קולטנים תא מארח, אבל הטפיל לא לפלוש באופן מלא לתא, והוא מופיע כדי לגרום לתא המארח להפרץ15. הטפיל, שהופנמו בתוך תא פנימי, אך ממוכך, נשאר על פני השטח הרשמי של התא, ומשכפל בתוך החללים הפרזיטואטיים. הוא עובר שני סיבובים של רבייה לא-מינית – תהליך הנקרא merogony. במהלך המראווני, הסוג שאני מפתח מפתחים אשר מכילים שמונה merozoites המשוחררים לפלוש לתאים חדשים. אלה merozoites לפלוש תאים חדשים כדי להתפתח סוג II meronts המכיל ארבעה merozoites. Merozoites אלה, כאשר הם משתחררים, להדביק תאים ולהתפתח מאקרוגמונטים ומיקרוגמבטים. מיקרוגיים משתחררים ומדשן את המקגיים המייצרים זיטים שבוגרים לתוך ציסטות. בוגרת האוציסטות משתחררים לאחר מכן לתוך לומן. האוציסטות הן דקות-חומה אשר מיד מייבאות להדביק את האפיתל, או מוקף חומה עבה אשר משתחררים לתוך הסביבה כדי להדביק את המארח הבא14. כל שלבי הצפנת מחזור החיים זוהו במערכת התרבות האורגאידית שפותחה בעבר על ידי הקבוצה שלנו10.

מאז בנאמנות האדם אורגנואידים שכפול רקמות האדם9,11,13, ותמיכה בכל השלבים replicative הצפנה10, הם מערכת התרבות האידיאלית רקמה ללמוד קריפטוספטורידיום ביולוגיה ואינטראקציות מארחים-טפיל. כאן אנו מתארים את ההליכים לזיהום אורגנואידים עם שני ציסטות קריפטוגנטים ו-הצפנה , ובידוד החדש אאוציסטות המיוצר במערכת זו תרבות רקמה.

Protocol

כל טיפול ברקמות וכריתה בוצעה תחת הלוח סקירה מוסדית (IRB) מאושר פרוטוקולים עם הסכמת המטופל.

1. הכנה של C. parvum אוציסטות עבור הזרקה

הערה: הצפנת הקריפטוספדיום נרכשו ממקור מסחרי (ראה את הטבלה של חומרים). אלה האוציסטות מיוצרים עגלים מאוחסנים מלוחים באגירה פוספט (PBS) עם אנטיביוטיקה. ניתן לאחסן אותם במשך כ -3 חודשים ב -4 ° c ולעולם לא לקפוא. אנחנו בדרך כלל משתמשים. בציסטות בתוך חודש אחד אורגנואידים יכול להיות נגוע או אאוציסטות שלמות, או sporozoites יכול להיות מבודד מפני מקבל והשתמשו כדי להדביק אורגנואידים אם זה חשוב לא להיות בעלי המחלה המקורית.

  1. הכן את הצפנת הצפנה עבור תאים מדביקים (איור 1a).
    1. לשמור על הקרח על כל המניפולציות עד שהם נוספים לאורגנואידים.
    2. לחשב את מספר הדרוש אאוציסטות עבור צלחת שש-באר מלא של אורגנואידים (בדרך כלל על 5 x 105– 2.5 x 105 עבור הצלחת). הרוזן את מספר האוציסטות בתוך הומוציטוטומטר כדי לאמת את הכמות וההעברה לשפופרת צנטריפוגה.
      הערה: כדי לסייע ויזואליזציה, אאוציסטות עשוי להיות מעורב 1:1 עם נוגדן פלורסנט ספציפי לציסטה (לראות את הטבלה של חומרים) לפני הטעינה על המכשיר הומוציטוטומטר. Fluorophore-התווית אאוציסטות ניתן לאחר מכן בקלות דמיינו וממוספרים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית. אנו ממליצים להזריק כ-100 – 1000 אוציסטות/אורגנואיד. באופן כללי, 1000-2000 אורגנואידים ניתן לגדל בצלחת שש-היטב.
    3. להביא את הנפח של ההשעיה אאוציסטות עד 900 μl עם PBS. הוסף 100 μL של נתרן היפוכלוריט (למשל, Clorox) אקונומיקה (ב -4 ° c). מודקון למשך 10 דקות על הקרח.
    4. צנטריפוגה עבור 3 דקות במיקרוצנטריפוגה ב 8,000 x g ב 4 ° c. כוון את החצוצרות בצנטריפוגה עם פתיחת כובע פונה פנימה. הגלולה יכול להיות קשה לראות כל כך לדעת איפה הטפילים יש מפלטטים בצינור הוא חיוני.
    5. הסר את הסופרנטנט עם הפיפטה שנזהר להמנע מהגלולה. הוסף 1 מ ל של מדיום הנשר של דולבקה שונה (DMEM) ומערבולת לערבב.
    6. צנטריפוגה עבור 3 דקות במיקרוצנטריפוגה ב 8,000 x g ב 4 ° c.
    7. חזור על שוטף עם DMEM פעמיים נוספות.
    8. הכנת בינונית הרחבה (OME) או בידול אורגאיד בינונית (OMD) שאליה התווסף טאורוכוליה לריכוז הסופי של 0.5% (w/v) (ראה טבלת חומרים). טאורוכולאט צריך תמיד להיות מוכן והוסיף טרי.
      הערה: השתמשנו בהצלחה 0.5% טאורוכולאט הדלקת שלנו מספרת היכן האינויותאי שלמות, וראה שיעור שיפור של זיהום בלי השפעות מזיקות על התאים המארחים. עם זאת, הטאורוכולאט עשוי להיות השפעות בלתי צפויות על תאים, וריכוזים נמוכים יותר שימשו בהצלחה זיהום בחני16.
    9. השהה מחדש את אאוציסטות ב-100 μl של בינונית תרבותית ארגונית בתוספת עם 0.5% (w/v) נתרן טאורוכולאט. הרוזן אאוציסטות שוב כפי שמתואר בשלב 1.1.2.
    10. להוסיף צבע ירוק מהיר על ההשעיה כדי להמחיש את ההזרקה.
    11. מילוי מיקרו-מטעין טיפים (לראות את הטבלה של חומרים) עם ההשעיה של האוסטאז ולהשתמש בו כדי למלא נימים משכו.
      זהירות: ההליך כולו צריך להיעשות במכסה של תרבות הרקמה עם פרוטוקולי בטיחות רמה 2. שימוש במסכות מומלץ כציסטות קריפטוספורידיום יכול להיות גם זיהומיות כאשר מוטס.

2. טיהור שפכים של ספוראוזוטים מ -C. parvum אוציסטות

  1. לטהר את הספורטים מ -C. parvum בציסטות לאחר הלבנת ושטיפת אקונומיקה כפי שמתואר לעיל.
    1. העבירו את האוציסטות. לשפופרת של 15 מ ל השהה מחדש את הציסטות בטמפרטורת החדר בינונית (0.75% w/v נתרן טאורוכולט) כדי לקבל 1 x 107 אוציסטות/mL. התוספת של הטאורוקריט משפרת את קצב הצ של האוציסטות, ומשפרת את תפוקת הספוראוזוט.
    2. השעיית הציסטה ב 37 מעלות צלזיוס עבור 1 – 1.5 h.
    3. בדוק את הדגימה המיקרוסקומית בהיקף של תחנת הרכבת; 60 – 80% התחנה הינה סבירה להתאוששות טובה של הספוראוזוענים. אם הרמה של תחנת הרכבת נמוכה, הדגירה ארוכה יותר (עוד 30 דקות עד 1 h).
    4. קבע את תחנת האחוזים ביחס למספר ההתחלה של האוציסטות. : תחנת הרכבת מחושבת
      % התחנה = [1 – (מספר של אאוציסטות שלמות/מספר של אאוציסטות בהתחלה)] x 100
    5. לשטוף את התאים כדי להסיר את החומרים ריאגנטים על ידי הוספת 14 מ ל של PBS או בינונית, ערבוב, ומחלים תאים (oocysts שלמות, הפגזים של oocysts, ו sporozoites ו ספוראוזוטים) על ידי צנטריפוגה ב 3,400 x g עבור 20 דקות כדי לשחזר sporozoites. מנושף בזהירות כדי להימנע מאיבוד תאים.
    6. השהה מחדש את כדורי הספורז ב-1 – 2 מ ל כדי להשיג 3 x 107 oocysts/mL (מבוסס על מספר מתחיל oocysts).
    7. כדי להסיר את השאר אאוציסטות וקונכיות, לסנן את ההשעיה דרך מסנן 3 יקרומטר (איור 1b). השתמש 47 מ"מ מחזיק מכשיר מסנן מצויד עם מסנן פוליקרבונט (3 יקרומטר גודל נקבובית) מחובר לחבית 10 מ"ל מזרק. מניחים את מחזיק הפילטר מעל שפופרת של 15 מ"ל. מניחים את ההרכבה בדלי קרח או בחדר קר.
    8. הוסף 7.5 mL של ההשעיה sporozoite להרכבה מסנן ולאפשר לסנן דרך כוח הכבידה. לשטוף עם עוד 7.5 מ ל של DMEM.
      הערה: כדי להבטיח הצלחה בבידוד sporozoite טרי ציסטות ותחנת המשטרה הטובה הם קריטיים. אם יש יותר מדי ציסטות בלתי מ, ההשעיה לא יזרום דרך כוח הכבידה. הפעלת לחץ על המזרק יכולה לגרום. לביטול הציסטות בדרך הזרקת הספוראוזוטים מאתגרת יותר מזה של האוציסטות, כי הספוראוזוניטים עלול לסבך ולחסום את הנימים. כדי למנוע זאת, אנו ממליצים לעשות טיפ נימי רחב יותר בעת הזרקת אורגנואידים עם הספאוזוענים. כדי להשיג רמות מספיקות של זיהום, 2 – 4 פעמים את מספר sporozoites צריך להיות מוזרק לתוך כל אורגאיד לעומת אורגנואידים נגועים עם oocysts.
    9. צנטריפוגה את ההשעיה sporozoite מסוננים ב 3,400 x g באמצעות רוטור דלי מנופף עבור 20 דקות כדי sporozoite הגלולה.
    10. השהה מחדש 50 – 100 μl של מדיום תרבות אורגאיד בינונית או omd (לראות את הטבלה של חומרים) שיושלם עם 0.05% (w/v) צבע ירוק מהיר והגלוטתיון, בטטין, L-cysteine, חומצה לינולאית ו taurine המכילים הפחתת מאגר5 (ראה ה טבלה של חומרים).
      הערה: דגירה של האוזנים במשך זמן ארוך מדי עלול לגרום לפירוק של sporozoites והתאוששות עניים ולכן יש להימנע.

3. תרבות חוץ גופית של מעיים אדם וריאות אורגנואידים עבור מיקרוהזרקה

  1. מחלות מעיים תרבותיות בתנאי תקשורת מתרחבות ובידול.
    הערה    הפרטים של הפצת המעי והריאות, תוארו בעבר במאמרים אחרים8,13(ראה הוראותרשימת חומריםעבור מתכוני מדיה). כאן, נתאר בקצרה את שיטת התרבות הארגונית עם התייחסות ספציפית למיטובCryptosporidiumזריקה וצמיחה. מצאנו כי עבור הדמיה של טפילים באורגנואידים, אורגנואידים גדל בינוני הרחבה עדיפים על אלה מדיה בידול גדול כמו שיש פחות פסולת הצטברות מאשר לראות אורגנואידים גדל בידול בינוני. עם זאת, אם המטרה היא לבודד oocysts, אורגנואידים גדל בבידול מדיה לייצר מספרים גבוהים הרבה יותר של oocysts.
    1. לשמור על אורגנואידים בתרבויות תלת-ממד במטריצה מלבינה (ראה את שולחן החומרים) ב-37 ° c. הוסף מדיית הרחבה (OME) למעלה ורענן כל יום.
      הערה: עבור אורגנואידים ריאות, אין לנו הרחבה נפרדת ומדיה בידול.
    2. כדי לפצל ולוחית הלוח למיקרו הזרקה, להסיר את המדיה מלוחית 6-באר המכילה אורגנואידים אנושיים ולהוסיף F12 + + + (לראות את הטבלה של חומרים) לבאר ולשבור את המטריצה על ידי ליטוף עם טיפ 1 מ ל פיפטה מספר פעמים. לאסוף תאים לתוך שפופרת 15 mL (2 מ ל F12 + + + + לצינור מספיק עבור הליכים נוספים).
    3. הוסף 10 – 12 מ ל F12 + + + לתוך שפופרת אחר 15 מ ל ומקום אש מלוטשת זכוכית pipet לתוך המדיום, פיפטה למעלה ולמטה 3 פעמים כדי לשבור את המעי האנושי והריאות אורגנואידים.
      הערה: להשתמש בזכוכית הרבה ללטף (20 – 30 ס מ) ולהבריק אש זה לזמן קצר. אל תבצע את הפתיחה (קוטר 1 מ"מ) קטן מאוד, מכיוון שניתן לפגוע באורגנואידים. להפוך את הקצה של העוגה להחליק על ידי לחיצה קצרה להבריק אותו. לשבור את האורגנואידים לחתיכות קטנות יותר של ~ 50 μm. בריאות אורגנואידים יש קרום חיצוני עבה יותר ולכן דורשים הטיה חזקה יותר עם פיפטה זכוכית לעומת אורגנואידים מעיים. יתר על כן, יש להם שיעור צמיחה איטי יותר מאשר מעיים (עד 14 ימים בין כל מעבר).
    4. הוסף F12 + + + עד 5 – 7 mL ו צנטריפוגה ב 350 x g עבור 5 דקות.
      הערה: מהירות צנטריפוגה בשלב זה הוא גבוה יותר מהרגיל על מנת להפוך את הגלולה תא טוב כי הוא מופרד היטב מתוך מטריצה החילוץ (לראות את הטבלה של חומרים). הבחנו כי בהשוואה לעכבר המעי הדק אורגנואידים, המעי הדק אורגנואידים האדם קשה יותר לשבש.
    5. הסר ככל האפשר מדיום מבלי להפריע את התאים, ואז להשעות מחדש את הגלולה עם מטריצה הנשמרת ב 4 ° c; 200 – 300 μL של מטריצה לכל טוב של צלחת שש היטב נדרש. אורגנואידים צריך להתחלק אחד בשלושה כדי לשמור על צפיפות תאים גבוהה למדי.
    6. צלחת האורגנואידים ב מטריקס טיפות של כ 5 – 10 μL כל אחד בבאר של שישה היטב צלחת. דגירה של 20 – 30 דקות ב 37 ° צ' ולאחר מכן להוסיף בינונית הרחבה (OME) על גבי.
    7. לשנות את המדיום כל 2 – 3 ימים.
      הערה: בתוך כ 5 – 7 ימים, אורגנואידים גדל EM להגיע לגודל של 100 – 200 יקרומטר ומוכנים להזרקה.
    8. כדי להבדיל את האורגנואידים, לאחר 5 – 6 ימים ב-EM, לשנות את המדיה לבידול מדיה (מיט) תנאים ולשמור עבור 5 – 6 ימים נוספים לפני הזרקת טפילים.
      הערה: להרחבת האורגנואידים, מומלץ לגלויית האורגנואידים בצפיפות. להזרקה, השימוש בצלחת בעלת שש מיטב מומלץ כאשר מצופה אורגנואידים בצפיפות פחותה. לדוגמה, מארגני צלחות משלוש בארות של צלחת שש-היטב לצלחת שש-היטב מלאה לזריקות מיקרו. יש לשמור על מטריקס ב-20 ° c לאחסון ארוך טווח ולהפשיר ב-4 ° צ' או על קרח לפני השימוש. התרחבות של מארגני הריאות נעשית באופן דומה, אך באמצעות רכיבי מדיה ספציפיים מסוג אורגאיד (טבלה 1)8 .

4. הזרקה של המיקרוציסטות/ספוראוזוטים לתוך האורגאיד לומן

  1. הכנסת טפילים לתוך הצד האפירשמי של האורגאיד התלת-ממדי (איור 2).
    1. הכינו נימים זכוכית של קוטר 1 מ"מ באמצעות פולר מיקרופיפטה.
      הערה: הגדרות המשמשות על פולר מיקרופיפטה (ראה טבלת חומרים) הם: חום = 663, משוך = 100, מהירות = 200, Time = 40 ms. הגדרות יהיה צורך לכוונן בהתאם להוראות המשתמש עבור מחשב מסוים.
    2. חותכים את קצה הקפילר עם מלקחיים. גודל/קוטר של הקצה הנימי צעדים על 9 – 12 μm; זה מאפשר זרימה קלה של אאוציסטות (4 – 5 יקרומטר גודל).
    3. מילוי נימי עם oocyst או השעיה sporozoite באמצעות מיקרו-מטעין טיפים.
    4. העמיסו את הנימי המלא של האוציסטה על מיקרו-מזרק.
    5. מיקרו הזרקת 100 – 200 nL השעיה לתוך כל אורגאיד תחת מיקרוסקופ הפוך בהגדלה 5x, שמירה על קבוע הלחץ. לאחר המיקרו הזרקה, רענן מדיה עם OME או OMD כל יום ולשמור על הצלחת ב 37 ° c.
      הערה: אנחנו לא משתמשים. במיקרומניפולציה להזרקת מיקרו השימוש באותו נימי מומלץ לניסוי כולו כדי להבטיח הזרקה שווה בכל מדגם.

5. כתמים מאימונולואורנציה של אורגנואידים

  1. לאסוף אורגנואידים (1 – 2 x 24 בארות) עם פיפטה P1000 לתוך שפופרת 15 מ"ל המכילים קר F12 + + +.
  2. כדור מאורגנואידים ב 300 x g עבור 2 דקות, להסיר את supernatant מבלי לשבש את הגלולה, ובעדינות ללטף את הגלולה רופף לתוך הנפח שנותר.
  3. הוסף 5 מ ל 2% פאראמפורמלדהיד ב PBS. כדי למנוע מהאורגנואידים לדבוק בקיר לא להפוך את הצינור. אפשר לאורגנואידים להתיישב בתחתית הצינור ולתקן ב -4 ° c ללילה או 1 h בטמפרטורת החדר.
  4. הסר את הקיבעון והוסף 10 מ ל של מאגר חדירות (0.2% טריטון ב-PBS).
  5. סובב את הצינור בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות (זה מבטיח שכל האורגנואידים יישארו בהשעיה).
  6. גלולה האורגנואידים ב 300 x g עבור 2 דקות, ולאחר מכן למחוק את supernatant.
  7. השהה מחדש את האורגנואידים בעדינות ב-500 μL לחסימת פתרון (עיין בטבלת החומרים) והעבר לשפופרת מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל.
  8. דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר. אפשר לאורגנואידים להתיישב. בתחתית הצינור בכוח הכבידה החלף את פתרון חסימת עם פתרון הנוגדן העיקרי (ראה טבלת חומרים) ו דגירה עבור 1-2 h בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° c.
  9. כביסה 3x עם PBS המכיל 0.1% רצף. תן לאורגנואידים להתיישב בכל. פעם ולהסיר את הסופרנטאנט
  10. הוסף פתרון נוגדן משני (לראות את הטבלה של חומרים) ו הדגירה עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
  11. כביסה 3x עם PBS המכיל 0.1% רצף. השאר 50 μL של הערוץ הPBS אחרי השטיפה השלישית.
  12. הר על השקופית על ידי ליטוף האורגנואידים הושעה 50 μL של PBS בשקופית. להסיר את העודפים PBS, להוסיף טיפה של סוכן להרכבה (לראות את הטבלה של חומרים) ולהוסיף את הכיסויים למעלה. סגרו את הצדדים בלק ציפורניים. ותנו לו להתייבש

6. בידוד של אוציסטות מאורגנואידים

  1. לבודד ציסטות שנוצרו מחדש מן הלוומאיד לומן.
    הערה    השימוש בציסטות מבודדות מהאורגנואידים על-ידי הפרדה אימונוגנטית באמצעות ערכת בידוד אוציסטה (ראה הרשימת חומרים) עם השינויים המתוארים להלן. ניתן לנתח את האוציסטות הבודדות באמצעות מיקרוסקופ מיקרוסקופי ואלקטרון.
    1. התחל עם אורגנואידים הבדיל כי כבר נשמר OMD עבור 5 – 7 ימים, כי הם נגועים, נגוע ביום 1 ו נגוע 5 ימים. השתמש בשניים הראשונים כפקדים שליליים.
      הערה: מצאנו כי אורגנואידים הבדיל לייצר יותר באוציסטות מאשר ריאות או הרחבת אורגנואידים מעיים10.
    2. לאסוף אורגנואידים לתוך 15 שפופרות צנטריפוגה mL. צנטריפוגה את האורגנואידים עבור 20 דקות ב 3,000 x g ו-10 ° c.
      הערה: זה מהירות גבוהה נדרשת כדי לוודא שאין אאוציסטות יאבדו מתוך כל אורגנואידים שעלולים להישבר.
    3. הסר את המדיה הארגונית והחלף אותו ב-5 מ ל של מים.
    4. משבשים את האורגנואידים על ידי הפיתיקות הנמרצת עם זכוכית מלוטשת-אש פסטר.
    5. אם הגושים גלויים, העבר את ההשעיה הארגונית לזכוכית הומוגניאיד, והומוטואידים עד שהאורגנואידים מובחים היטב. . ההומוגנידה לא תשפיע על האוציסטות
    6. ברגע שאין גושים גלויים, להוסיף 5 מ ל של מאגר A מתוך ערכת הבידוד oocyst. לערבב ולאחר מכן להוסיף 120 μL של חרוזים מגנטיים מצופה עם אנטי oocyst IgM.
    7. דגירה ההשעיה התא וחרוזים מגנטיים עבור 2 h בטמפרטורת החדר עם ערבוב רציפה על פלטפורמת נדנדה.
    8. בסוף הדגירה, מניחים את הצינורות המכילים תאים וחרוזים על מתלה הפרדה מגנטית מיועד 15 שפופרות mL.
    9. לסובב את הצינורות בארון הפרדה מגנטי ידנית עבור 3 דקות. החרוזים יהיה לדבוק בצד של הצינור ליד המגנט.
    10. בזהירות, עם פיפטה של 10 מ ל, הסירו את הסופרנטאנט מהחרוזים. השהה מחדש את החרוזים ב-450 μL של מאגר B והעבר לשפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL.
      הערה: שמור על הסופרנטאנט עד. שבידוד האוציסטות יאושר
    11. כדי לאסוף את כל החרוזים הנותרים oocysts, לשטוף את 15 מ"ל שפופרת עם 450 μL של מאגר B ולהוסיף את זה לשטוף את החרוזים מגנטי בצינור המיקרוצנטריפוגה.
    12. חזור על השלב 6.1.11 פעם אחת נוספת. כל החרוזים והאוציסטות שנתפסו צריכים עכשיו להיות מועברים לצינור המיקרוצנטריפוגה.
    13. מניחים את צינורית המיקרוצנטריפוגה על ארון הפרדה מגנטי המיועד להחזקת צינורות מיקרו-צנטריפוגה.
    14. סובב את הצינור בארון ההפרדה המגנטי ביד במשך 3 דקות.
    15. הסירו בזהירות את הסופרנטנט. עם הפיפטה לצינור חדש
      הערה: שמור על הסופרנטאנט עד. שבידוד האוציסטות יאושר
    16. הסר את צינורית המיקרוצנטריפוגה המכילה חרוזים מגנטיים ואוציסטות ממדף ההפרדה המגנטי.
    17. הוסף 100 μL של 0.1 N HCl לחרוזים מגנטיים כדי לבטל את החרוזים. . מערבולת ל -30 מנות
      הערה: יש להגדיר את vortexer כמעט פחות ממהירות מקסימלית.
    18. מודטה את החרוזים ב 0.1 N HCl עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    19. . שוב מערבולת ואז מניחים את הצינורית. על מתלה ההפרדה המגנטי המתן לחרוזים לדבוק בצד של הצינור ולאחר מכן להעביר את supernatant צינור מיקרוצנטריפוגה חדש.
    20. חזור על הצעדים 6.1.17 דרך 6.1.19 ולשלב את משחרל השני עם הראשון לאחד.
    21. לנטרל את להתחמק עם 20 μL של 1 N NaOH, או אחר לנטרל מאגר כגון 1 M טריס, pH 8.
    22. כדי לספור אאוציסטות, לקחת 10 μl של להתחמק, לשלב אותו עם 10 μl של נוגדן ספציפי אאוציסטות (ראה טבלת חומרים) ולספור אוציסטות פלורסנט על הומוציטוטומטר.
      הערה: ניתן לאחסן האוציסטות מבודדות ב -4 ° c או בשימוש מיידי לצורך הדמיה של מיקרוסקופ או מיקרוסקופיה אלקטרונים.

תוצאות

הפרוטוקולים המוצגים כאן התוצאה היא טיהור יעיל של האוציסטות והספורזוטים (איור 1A) מוכן הזרקת מיקרו. הפרוטוקול בתחנת המשטרה מביא לשחרורו של הספוראוזוטים מ-70%-80% מהציסטות, ולכן חיוני לסנן את שאר הפגזים והצדפים דרך מסנן של 3 יקרומטר. הסינון מביא כמעט 100% לטיהור הספוראוזוט (

Discussion

תרבות של הצפנת הצפנה טפילים במעי ואורגנואידים הנשימה מספק מודל מדויק ללמוד אינטראקציות מארח טפיל10 אבל יש גם יישומים רבים אחרים. לדוגמה, השיטות הנוכחיות של בחירת והפצת הצפנה מהונדסים גנטית טפילים דורשים מעבר בעכברים19 אשר אינו מאפשר בידוד של טפילים כי י?...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

אנו אסירי תודה לדבורה א. שפר מבית הספר של בעלי חיים ומדעי ביורפואי השוואתי, המכללה לחקלאות ומדעי החיים, אוניברסיטת אריזונה, טוסון, AZ, ארה ב על שסייע לנו עם ייצור וניתוח הoocyst. כמו כן, אנו מודים לגבי מיקרוסקופ ומרכז ההדמיה ו-d. d Mullendore באוניברסיטת וושינגטון לקראת הכנה והדמיה של ציסטות מבודדות של אורגנואיד.

D.D. הוא המקבל של מענק בני מארגון הולנד למחקר מדעי (NWO-ALW, 016.171.015). I.H. הוא המקבל של מענק בני מארגון הולנד למחקר מדעי (NWO-ALW, 863.14.002) ונתמך על ידי מלגות מארי קירי מהוועדה האירופית (הצעה 330571 FP7-אנשים-2012-IIF). המחקר המוביל לתוצאות אלה קיבל מימון ממועצת המחקר האירופית תחת הסכם מתקדם המענק של ERC no. 67013 ו-NIH NIAIH תחת R21 AT009174 כדי RMO. עבודה זו היא חלק ממכון Oncode, אשר ממומן חלקית על ידי האגודה ההולנדית לסרטן ומומן על ידי מענק של האגודה ההולנדית לסרטן.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Basement membrane extract (extracellular matrix)amsbio3533-010-02 
Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody)Waterborne, IncA400FLR-1XFinal Concentration = Use 2-3 drops/slide
Crypto-Grab IgM coated Magnetic beadsWaterborne, IncIMS400-20 
Dynamag 15 rackThermofisher Scientific12301D 
Dynamag 2 rackThermofisher Scientific12321D 
EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µmEMD-MilliporeTSTP02500 
Fast green dyeSIGMAF7252-5G   
Femtojet 4i MicroinjectorEppendorf5252000013 
Glass capillaries of 1 mm diameterWPITW100F-4 
Matrigel (extracellular matrix)Corning356237 
Microfuge tube 1.5 mLEppendorfT9661-1000EA 
Micro-loader tipsEppendorf612-7933 
Micropipette puller P-97Shutter instrumentP-97 
Normal donkey SerumBio-RadC06SB 
PenstrepGibco15140-122 
Sodium hypoclorite (use 5%)Clorox50371478 
Super stick slidesWaterborne, IncS100-3 
Swinnex-25 47 mm Polycarbonate filter holderEMD-MilliporeSX0002500 
Taurocholic acid sodium salt hydrateSIGMAT4009-5G 
Tween-20Merck8221840500 
Vectashield mounting agentVector LabsH-1000 
Vortex Genie 2Scientific industries, IncSI0236 
Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)  Final amount
DMEMInvitrogen12634-010500 mL
PenstrepGibco15140-1225 mL of stock in 500 mL DMEM
GlutamaxGibco350500385 mL of stock in 500 mL DMEM
HepesGibco156300565 mL of stock in 500 mL DMEM
INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media)  Final concentration
A83-01Tocris2939-50mg0.5 µM
Adv+++  make up to 100 mL
B27Invitrogen175040441x
EGFPeprotechAF-100-1550 ng/mL
GastrinTocris3006-1mg10 nM
NACSigmaA9125-25G1.25 mM
NICSigmaN0636-100G10 mM
Noggin CMIn house* 10%
P38 inhibitor (SB202190)SigmaS7076-25 mg10 µM
PGE2Tocris2296/1010 nM
PrimocinInvivoGenant-pm-11 mL/500 mL media
RSpoI CMIn house* 20%
Wnt3a CMIn house* 50%
In house* - cell lines will be provided upon request   
INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media)  To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME)
LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media)  Final concentration
Adv+++  make up to 100 mL
ALK-I A83-01Tocris2939-50mg500 nM
B27Invitrogen175040440.0763888889
FGF-10Peprotech100-26100 ng/mL
FGF-7Peprotech100-1925 ng/mL
N-AcetylcysteineSigmaA9125-25G1.25 mM
NicotinamideSigmaN0636-100G5 mM
Noggin UPEU-Protein ExpressContact company directly10%
p38 MAPK-ISigmaS7076-25 mg1 µM
PrimocinInvivoGenant-pm-11:500
RhoKI Y-27632Abmole BioscienceM1817_100 mg2.5 µm
Rspo UPEU-Protein ExpressContact company directly10%
Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection)  Final concentration
L-Glutathione reducedSigmaG4251-10MG0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM
BetaineSigma619620.5 μg/μL of OME/OMD/LOM
L-CysteineSigma168149-2.5G0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM
Linoleic acidSigmaL1376-10MG6.8 μg/mL of OME/OMD /LOM
TaurineSigmaT0625-10MG0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM
Blocking buffer (for immunoflourescence staining)  Final concentration
Donkey/Goat serumBio-RadC06SB2%
PBSThermo-Fisher70011044Make up to 100 mL
Tween 20MerckP13790.1%
List of Antibodies used    
Alexa 568 goat anti-rabbitInvitrogenA-11011Dilution-1:500; RRID: AB_143157
Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-GloWaterborne, IncA400FLKDilution- 1:200
Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactiveWaterborne, IncIMS400-20Dilution-1:500
DAPIThermo Fisher ScientificD1306Dilution-1:1,000; RRID : AB_2629482
Phalloidin-Alexa 674InvitrogenA22287Dilution-1:1,000; RRID: AB_2620155
Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O’Connor (co-author).Upon requestUpon requestDilution-1:500
Sporo-GloWaterborne, IncA600FLR-1XDilution- 1:200

References

  1. Checkley, W., et al. A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium. The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).
  2. Bones, A. J., et al. Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research. Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).
  3. Muller, J., Hemphill, A. In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals. International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).
  4. Karanis, P., Aldeyarbi, H. M. Evolution of Cryptosporidium in vitro culture. International Journal for Parasitology. 41 (12), 1231-1242 (2011).
  5. Morada, M., et al. Continuous culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber technology. International Journal for Parasitology. 46 (1), 21-29 (2016).
  6. DeCicco RePass, M. A., et al. Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum. Infection and Immunity. 85 (3), (2017).
  7. Miller, C. N., et al. A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology. International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).
  8. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modelling. bioRxiv. , (2018).
  9. Dutta, D., Clevers, H. Organoid culture systems to study host-pathogen interactions. Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).
  10. Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
  11. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  12. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  13. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  14. O'Hara, S. P., Chen, X. M. The cell biology of Cryptosporidium infection. Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).
  15. Lendner, M., Daugschies, A. Cryptosporidium infections: molecular advances. Parasitology. 141 (11), 1511-1532 (2014).
  16. Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells. Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).
  17. O'Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens. Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).
  18. Wilke, G., et al. Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro. mSphere. 3 (3), (2018).
  19. Vinayak, S., et al. Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum. Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).
  20. Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

151sporidiosissporozoites

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved