Studium der Cryptosporidium-Infektion in 3D-Gewebe-abgeleiteten Human Organoid Culture Systems durch Mikroinjektion

Zusammenfassung

Wir beschreiben Protokolle zur Vorbereitung von Oozysten und zur Reinigung von Sporozoiten zur Untersuchung der Infektion von menschlichen Darm- und Atemwegsorganoiden durch Cryptosporidium parvum. Wir zeigen die Verfahren für die Mikroinjektion von Parasiten in das Darmorganoidlumen und die Immunfärbung von Organoiden. Schließlich beschreiben wir die Isolierung der erzeugten Oozysten von den Organoiden.

Zusammenfassung

Cryptosporidium parvum ist eine der Hauptursachen für menschliche Durchfallerkrankungen. Um die Pathologie des Parasiten zu verstehen und effiziente Medikamente zu entwickeln, ist ein In-vitro-Kultursystem erforderlich, das die Bedingungen im Wirt rekapituliert. Organoide, die den Geweben ihrer Herkunft sehr ähnlich sind, sind ideal für die Untersuchung von Wirtsparasiten-Wechselwirkungen. Organoide sind dreidimensionale (3D) Gewebe-abgeleitete Strukturen, die aus adulten Stammzellen abgeleitet werden und über einen längeren Zeitraum in kulturgemäß wachsen, ohne eine genetische Aberration oder Transformation zu durchlaufen. Sie haben eine gut definierte Polarität mit apikalen und basolateralen Oberflächen. Organoide haben verschiedene Anwendungen in Medikamententests, Bio-Banking, und Krankheitsmodellierung und Wirt-Mikroben-Interaktionsstudien. Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll vor, wie man die Oozysten und Sporozoiten von Cryptosporidium für die Infektion menschlicher Darm- und Atemwegsorganoide vorbereitet. Wir zeigen dann, wie Mikroinjektion verwendet werden kann, um die Mikroben in das Organoidlumen zu injizieren. Es gibt drei Hauptmethoden, mit denen Organoide für Wirt-Mikroben-Interaktionsstudien verwendet werden können: Mikroinjektion, mechanisches Scheren und Plattieren und durch die Herstellung von Monolayern. Die Mikroinjektion ermöglicht die Erhaltung der 3D-Struktur und ermöglicht eine präzise Kontrolle der Parasitenvolumina und den direkten apikalen Seitenkontakt für die Mikroben. Wir liefern Details für ein optimales Wachstum von Organoiden für die Bildgebung oder Oozystenproduktion. Schließlich zeigen wir auch, wie die neu erzeugten Oozysten aus dem Organoid für die weitere Weiterverarbeitung und Analyse isoliert werden können.

Einleitung

Die Entwicklung von Medikamenten oder Impfstoffen zur Behandlung und Vorbeugung von Cryptosporidium-Infektionen wurde durch das Fehlen von In-vitro-Systemen behindert, die die In-vivo-Situation beim Menschen genau nachahmen^1,2. Viele der derzeit verfügbaren Systeme erlauben entweder nur eine kurzfristige Infektion (<5 Tage) oder unterstützen nicht den gesamten Lebenszyklus des Parasiten^3,4. Andere Systeme, die die vollständige Entwicklung des Parasiten ermöglichen, basieren auf verewigten Zelllinien oder Krebszelllinien, die die physiologische Situation beim Menschen nicht getreu rekapitulieren^5,6,7 . Organoide oder "Mini-Organe" sind 3D-Gewebe abgeleitete Strukturen, die in einer extrazellulären Matrix mit verschiedenen gewebespezifischen Wachstumsfaktoren ergänzt angebaut werden. Organoide wurden aus verschiedenen Organen und Geweben entwickelt. Sie sind genetisch stabil und rekapitulieren die meisten Funktionen der Organe ihrer Herkunft und können in der Kultur für längere Zeit erhalten werden. Wir haben eine Methode zur Infizierung menschlicher Darm- und Lungenorganoide mit Cryptosporidium entwickelt, die ein genaues In-vitro-Modell für die Untersuchung von Wirtsparasiten-Wechselwirkungen bietet, die für die Darm- und Atemkryptosporidiose relevant sind^{8 ,9,10,11,12,13}. Im Gegensatz zu anderen veröffentlichten Kulturmodellen ist das Organoidsystem repräsentativ für reale Wirtparasiten-Wechselwirkungen, ermöglicht die Vollendung des Lebenszyklus, so dass alle Stadien des Parasiten-Lebenszyklus untersucht werden können, und hält die Parasitenausbreitung aufrecht. für bis zu 28 Tage¹⁰.

Cryptosporidium parvum ist ein apicomplexan Parasit, der das Epithel der Atemwege und Darmtrakt infiziert, verursacht längere Durchfallerkrankungen. Die resistente Umweltstufe ist die Oozyste, die in kontaminierten Lebensmitteln und Wasser gefunden wird¹⁴. Nach der Ein- oder Einatmung exzyst die Oozyste und setzt vier Sporozoiten frei, die sich an Epithelzellen anheften. Sporozoiten gleiten auf Wirtszellen und greifen Wirtszellrezeptoren an, aber der Parasit dringt nicht vollständig in die Zelle ein und scheint die Wirtszelle dazu zu bringen, sie zu verschlingen¹⁵. Der Parasit, der in einem intrazellulären, aber extrazytoplasmatischen Fach verinnerlicht wird, verbleibt an der apikalen Oberfläche der Zelle und replizieren sich innerhalb eines parasitophorischen Vakuols. Es durchläuft zwei Runden asexueller Fortpflanzung – ein Prozess, der Merogonie genannt wird. Während der Merogonie entwickeln typ I Meronts, die acht Merozoiten enthalten, die freigesetzt werden, um in neue Zellen einzudringen. Diese Merozoiten dringen in neue Zellen ein, um sich zu Typ-II-Meronten zu entwickeln, die vier Merozoiten enthalten. Diese Merozoiten infizieren bei ihrer Freigabe Zellen und entwickeln sich zu Makrogamonts und Mikrogamonen. Mikrogamete werden freigesetzt und befruchten die Makrogameten, die Zygoten produzieren, die zu Oozysten reifen. Reife Oozysten werden anschließend in das Lumen freigesetzt. Oozysten sind entweder dünnwandige, die sofort exzyst, um das Epithel neu zu infizieren, oder dick wandgebunden, die in die Umwelt freigesetzt werden, um den nächsten Wirt¹⁴zu infizieren. Alle Stadien des Cryptosporidium-Lebenszyklus wurden in dem zuvor von unserer Gruppe¹⁰entwickelten Organoid-Kultursystem identifiziert.

Da menschliche Organoide das menschliche Gewebe^9,11,13originalgetreu replizieren und alle replizierenden Stadien von Cryptosporidium¹⁰unterstützen, sind sie das ideale Gewebekultursystem zum Studium Cryptosporidium Biologie und Wirt-Parasiten-Wechselwirkungen. Hier beschreiben wir die Verfahren zur Infizierung von Organoiden mit Cryptosporidium-Oozysten und exzysierten Sporozoiten und zur Isolierung der neuen Oozysten, die in diesem Gewebekultursystem produziert werden.

Protokoll

Die gesamte Gewebebehandlung und -resektion wurde im Rahmen der vom Institutional Review Board (IRB) zugelassenen Protokolle mit Zustimmung des Patienten durchgeführt.

1. Herstellung von C. parvum Oozysten zur Injektion

HINWEIS: Cryptosporidium Oozysten wurden aus einer kommerziellen Quelle gekauft (siehe Tabelle der Materialien). Diese Oozysten werden in Kälbern produziert und in phosphatgepufferter Salin (PBS) mit Antibiotika gelagert. Sie können ca. 3 Monate bei 4 °C gelagert werden und sollten niemals eingefroren werden. Normalerweise verwenden wir Oozysten innerhalb eines Monats. Organoide können entweder mit intakten Oozysten infiziert werden, oder Sporozoiten können aus exzysierten Oozysten isoliert und verwendet werden, um Organoide zu infizieren, wenn es wichtig ist, keine Oozysten vom ursprünglichen Inokulum übertragen zu lassen.

1. Bereiten Sie Cryptosporidium-Oozysten für die Infektion von Zellen vor (Abbildung 1A).
   1. Halten Sie Oozysten auf Eis während aller Manipulationen, bis sie zu den Organoiden hinzugefügt werden.
   2. Berechnen Sie die Anzahl der Oozysten, die für eine vollständige Sechs-Well-Platte von Organoiden benötigt werden (in der Regel etwa 5 x 10⁵–2,5 x 10⁵ für die Platte). Zählen Sie die Anzahl der Oozysten in einem Hämozytometer, um die Menge zu überprüfen und in ein Zentrifugenrohr zu übertragen.
      HINWEIS: Zur Visualisierung können Oozysten 1:1 mit einem oozysspezifischen fluoreszierenden Antikörper (siehe Materialtabelle)gemischt werden, bevor sie auf das Hämozytometer geladen werden. Die fluorophor-markierten Oozysten können dann einfach visualisiert und mit einem Fluoreszenzmikroskop aufgezählt werden. Wir empfehlen, etwa 100–1.000 Oozysten/Organoid zu injizieren. Im Allgemeinen können 1.000–2.000 Organoide in einer Sechs-Brunnen-Platte angebaut werden.
   3. Bringen Sie das Volumen der Oozysten Suspension bis zu 900 l mit PBS. 100 l Natriumhypochlorit (z. B. Clorox) Bleichmittel (bei 4 °C) hinzufügen. 10 min auf Eis bebrüten.
   4. Zentrifuge für 3 min in einer Mikrozentrifuge bei 8.000 x g bei 4 °C. Richten Sie die Rohre in der Zentrifuge mit der Kappenöffnung nach innen. Das Pellet kann schwer zu sehen sein, so zu wissen, wo die Parasiten in der Röhre pelletiert haben, ist wichtig.
   5. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette, die darauf achtet, das Pellet zu vermeiden. Fügen Sie 1 ml von Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) und Wirbel zum Mischen hinzu.
   6. Zentrifuge für 3 min in einer Mikrozentrifuge bei 8.000 x g bei 4 °C.
   7. Wiederholte Sendezeiten mit DMEM zwei weitere Male.
   8. Vorbereiten des Expansionsmediums (OME) oder des Differenzierungsorganoidmediums (OMD), dem Taurocholat zu einer Endkonzentration von 0,5% (w/v) hinzugefügt wurde (siehe Materialtabelle). Taurocholate sollte immer frisch zubereitet und hinzugefügt werden.
      HINWEIS: Wir haben erfolgreich 0,5% Taurocholat in unseren Infektionstests verwendet, bei denen das Inokulum intakte Oozysten ist, und verbesserte Infektionsraten ohne schädliche Auswirkungen auf die Wirtszellen gesehen. Jedoch, Taurocholat kann unerwartete Auswirkungen auf Zellen haben, und niedrigere Konzentrationen wurden erfolgreich in Infektionstests¹⁶verwendet.
   9. Resuspend Oozysten in 100 l Organoid-Kulturmedium ergänzt mit 0,5% (w/v) Natriumtaurocholat. Zählen Sie wieder Oozysten, wie in Schritt 1.1.2 beschrieben.
   10. Fügen Sie Fast Green Farbstoff auf die Suspension, um Injektion zu visualisieren.
   11. Füllen Sie Mikroladerspitzen (siehe Materialtabelle)mit der Oozystensuspension und füllen Sie gezogene Kapillaren.
       ACHTUNG: Das gesamte Verfahren sollte in einer Gewebekulturhaube mit Sicherheitsprotokollen der Stufe 2 durchgeführt werden. Die Verwendung von Masken wird empfohlen, da Cryptosporidium Oozysten auch infektiös sein können, wenn sie in der Luft sind.

2. In Vitro Reinigung von Sporozoiten aus C. parvum Oozysten

1. Reinigen Sie Sporozoite aus C. parvum Oozysten nach dem Bleichen und Auswaschen der Bleiche, wie oben beschrieben.
   1. Übertragen Sie die Oozysten in ein 15 ml Rohr. Oozysten im Raumtemperatur-Excystationsmedium (0,75% w/v Natriumtaurocholat in DMEM) wieder aufsetzen, um 1 x 10⁷ Oozysten/ml zu erhalten. Die Zugabe von Taurochoat verbessert die Excystationsrate der Oozysten und verbessert die Sporozoitausbeute.
   2. Oozystensuspension bei 37 °C für 1–1,5 h inkubieren.
   3. Überprüfen Sie die Probe mikroskopisch auf das Ausmaß der Excystation; 60–80% Excystation ist für eine gute Rückgewinnung von Sporozoiten sinnvoll. Wenn der Excystation-Gehalt niedrig ist, länger inkubieren (weitere 30 min bis 1 h).
   4. Bestimmen Sie die prozentuale Excystation relativ zur Anzahl der beginnenden Oozysten. Die Excystation wird wie folgt berechnet:
      % Excystation = [1 – (Anzahl der intakten Oozysten/Anzahl der Oozysten zu Beginn)] x 100
   5. Waschen Sie Zellen, um Excystationsreagenzien zu entfernen, indem Sie 14 ml PBS oder Medium hinzufügen, Zellen (intakte Oozysten, Oozysten und Sporozoiten) durch Zentrifugation bei 3.400 x g für 20 min zur Rückgewinnung von Sporozoiten mischen. Aspirieren Sie sorgfältig, um Zellverluste zu vermeiden.
   6. Setzen Sie das Sporozoitpellet in 1–2 ml DMEM wieder aus, um 3 x 10⁷ Oozysten/ml zu erhalten (basierend auf der Anzahl der beginnenden Oozysten).
   7. Um die verbleibenden Oozysten und Schalen zu entfernen, filtern Sie die Suspension durch einen 3-m-Filter(Abbildung 1B). Verwenden Sie ein 47-mm-Filterhaltergerät, das mit Polycarbonatfilter (3 m Porengröße) ausgestattet ist, der an einem 10 ml Spritzenlauf befestigt ist. Stellen Sie das Filterhaltergerät auf ein 15 ml-Rohr. Legen Sie die Montage in einen Eiskübel oder in einen kalten Raum.
   8. 7,5 ml der Sporozoitsuspension in die Filterbaugruppe geben und nach Schwerkraft durchfiltern lassen. Mit weiteren 7,5 ml DMEM durchwaschen.
      HINWEIS: Um den Erfolg in der Sporozoit-Isolierung zu gewährleisten, sind frische Oozysten und eine gute Excystation entscheidend. Wenn es zu viele ungezystische Oozysten gibt, fließt die Suspension nicht durch die Schwerkraft durch. Durch Druck auf die Spritze können ungezysierte Oozysten durchkraften. Die Mikroinjektion von Sporozoiten ist schwieriger als die von Oozysten, da Sporozoiten die Kapillare verklumpen und blockieren können. Um dies zu vermeiden, empfehlen wir, eine breitere Kapillarspitze zu machen, wenn Organoide mit Sporozoiten injiziert werden. Um ein ausreichendes Infektionsniveau zu erreichen, muss die 2-4-fache Anzahl der Sporozoiten in jedes Organoid injiziert werden, im Vergleich zu Organoiden, die mit Oozysten infiziert sind.
   9. Zentrifugieren Sie die gefilterte Sporozoitsuspension bei 3.400 x g mit einem schwingenden Schaufelrotor für 20 min zu Pelletsporozoiten.
   10. Resuspend in 50–100 l OME oder OMD Organoid-Kulturmedium (siehe Materialtabelle) ergänzt durch 0,05% (w/v) Fast Green Farbstoff und L-Glutathion, Betain, L-Cystein, Linolsäure und Taurin-haltigen Reduktionspuffer⁵ (siehe Materialtabelle).
       HINWEIS: Die zu lange Inkubation von Oozysten kann zu einer Lyse von Sporozoiten und einer schlechten Erholung führen und sollte daher vermieden werden.

3. In Vitro Kultur des menschlichen Darms und Lung Organoide für Mikroinjektion

1. Kultur-Darm-Organoide unter Expansions- und Differenzierungsmedienbedingungen.
   notiz:Die Einzelheiten der Darm- und Lungenorganoidvermehrung wurden zuvor in anderen Artikeln beschrieben.^8,13(sieheMaterialtabellefür Medienrezepte). Hier beschreiben wir kurz die organoide Kulturmethode mit spezifischem Bezug zur Optimierung fürCryptosporidiumInjektion und Wachstum. Wir haben herausgefunden, dass für die Abbildung von Parasiten in Organoiden, Organoide in Expansionsmedium gewachsen sind besser als diejenigen in gewachsenen Differenzierung Medien als es weniger Schutt Ansammlung als bei Organoiden in Differenzierung simiert Medium gesehen. Wenn das Ziel jedoch darin besteht, Oozysten zu isolieren, produzieren Inzellen, die in Differenzierungsmedien angebaut werden, eine weithöhere Anzahl von Oozysten.
   1. Halten Sie Organoide in 3D-Kulturen in extrazellulärer Matrix (siehe Materialtabelle) bei 37 °C. Fügen Sie OME (Erweiterungsmedien) oben hinzu und aktualisieren Sie jeden Tag.
      HINWEIS: Für Lungenorganoide haben wir keine separaten Expansions- und Differenzierungsmedien.
   2. Um Organoide für die Mikroinjektion zu spalten und zu verplatten, entfernen Sie Medien von der 6-Well-Platte, die menschliche Organoide enthält, und fügen Sie F12+++ (Siehe Materialtabelle)in den Brunnen ein und brechen Sie die Matrix durch Pipettieren mit einer 1 ml Pipettenspitze mehrmals auf. Sammeln Sie Zellen in einem 15 ml Rohr (2 ml F12+++ pro Rohr reicht für weitere Verfahren).
   3. Fügen Sie 10–12 ml F12+++ in ein weiteres 15 ml-Rohr und legen Sie eine feuerpolierte Glaspipette in das Medium, Pipette auf und ab 3 Mal, um die menschlichen Darm- und Lungenorganoide aufzubrechen.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine lange Glaspipette (20–30 cm) und feuern Sie sie kurz ab. Machen Sie die Öffnung (1 mm Durchmesser) nicht sehr klein, da Organoide beschädigt werden können. Machen Sie die Spitze der Pipette glatt, indem Sie sie kurz zum Absäugen bringen. Brechen Sie Organoide in kleinere Stücke von 50 m. Lungenorganoide haben eine dickere äußere Membran und erfordern daher ein stärkeres Scheren mit der Glaspipette im Vergleich zu Darmorganoiden. Darüber hinaus haben sie eine langsamere Wachstumsrate als Darmorganoide (bis zu 14 Tage zwischen jedem Passaging).
   4. Fügen Sie F12+++ bis zu 5–7 ml und Zentrifuge bei 350 x g für 5 min hinzu.
      HINWEIS: Die Zentrifugationsgeschwindigkeit in diesem Schritt ist höher als normal, um ein gutes Zellpellet zu machen, das gut von der extrazellulären Matrix getrennt ist (siehe Tabelle der Materialien). Wir haben beobachtet, dass im Vergleich zu Maus Dünndarm-Organoide, menschliche Dünndarm-Organoide sind schwieriger zu stören.
   5. Entfernen Sie so viel Medium wie möglich, ohne die Zellen zu stören, dann setzen Sie das Pellet mit Matrix bei 4 °C beibehalten; 200–300 l Matrix pro Bohrung einer Sechs-Bohr-Platte sind erforderlich. Organoide sollten eins zu drei geteilt werden, um eine ziemlich hohe Zelldichte zu erhalten.
   6. Die Organoide in Matrixtröpfchen von jeweils etwa 5 bis 10 l in den Brunnen einer Sechs-Well-Platte geben. 20–30 min bei 37 °C inkubieren und dann das Expansionsmedium (OME) oben hinzufügen.
   7. Ändern Sie das Medium alle 2-3 Tage.
      HINWEIS: In etwa 5–7 Tagen erreichen die in EM wachsenden Organoide eine Größe von 100–200 m und sind zur Injektion bereit.
   8. Um die Organoide zu unterscheiden, nach 5-6 Tagen in EM, ändern Sie die Medien auf Differenzierungsmedien (DM) Bedingungen und halten Sie für 5-6 zusätzliche Tage vor der Injektion der Parasiten.
      HINWEIS: Für die Erweiterung der Organoide wird empfohlen, die Organoide dicht zu bedecken. Für die Mikroinjektion wird die Verwendung einer Sechs-Well-Platte mit Organoiden empfohlen, die mit einer geringeren Dichte plattiert sind. Zum Beispiel, Platte Organoide aus drei Brunnen einer Sechs-Well-Platte in eine volle Sechs-Well-Platte für Mikroinjektionen. Die Matrix sollte bei -20 °C für die Langzeitlagerung gehalten und vor Gebrauch bei 4 °C oder auf Eis aufgetaut werden. Die Erweiterung der Lungenorganoide ist ähnlich, aber mit Lungenorganoid spezifischen Medienkomponenten (Tabelle 1)⁸ .

4. Mikroinjektion von Oozysten/Sporozoiten in das Organoid Lumen

1. Mikroinjizieren Sie Parasiten in die apikale Seite des 3D-Organoids (Abbildung 2).
   1. Bereiten Sie Glaskapillaren mit 1 mm Durchmesser mit einem Mikropipette-Zieher vor.
      HINWEIS: Die einstellungen für den Micropipette-Puller (siehe Materialtabelle) lauten: Hitze = 663, Pull = 100, Geschwindigkeit = 200, Zeit = 40 ms. Einstellungen müssen entsprechend den Gebrauchsanweisungen für eine bestimmte Maschine angepasst werden.
   2. Schneiden Sie die Spitze der Kapillare mit Zangen. Die Größe/der Durchmesser des Kapillarenenenbeträgtes beträgt ca. 9–12 m; dies ermöglicht einen einfachen Fluss von Oozysten (4–5 m Größe).
   3. Füllen Sie Kapillaren mit Oozysten- oder Sporozoitsuspension enden mit Mikroladerspitzen.
   4. Laden Sie die mit Oozysten gefüllte Kapillare auf einen Mikroinjektor.
   5. Mikroinjizieren Sie 100–200 nL Suspension in jedes Organoid unter einem invertierten Mikroskop bei 5-facher Vergrößerung, wodurch der Druck konstant bleibt. Nach der Mikroinjektion täglich mit OME oder OMD auffrischen und die Platte bei 37 °C halten.
      HINWEIS: Wir verwenden keinen Mikromanipulator für die Mikroinjektion. Die Verwendung der gleichen Kapillare wird für das gesamte Experiment empfohlen, um eine gleichmäßige Injektion in jede Probe zu gewährleisten.

5. Immunfluoreszenz Färbung von Organoiden

1. Organoide (1–2 x 24 Brunnen) mit einer P1000 Pipette in ein 15 ml-Rohr mit kaltem F12+++ zu sammeln.
2. Pellet-Organoide bei 300 x g für 2 min, entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und pfeifen Sie das Pellet sanft lose in das restliche Volumen.
3. 5 ml mit 2% Paraformaldehyd in PBS hinzufügen. Um zu verhindern, dass die Organoide an der Wand kleben, kehren Sie das Rohr nicht um. Lassen Sie die Organoide an der Unterseite des Rohres absetzen und bei 4 °C über Nacht oder 1 h bei Raumtemperatur fixieren.
4. Entfernen Sie das Fixierungsmittel und fügen Sie 10 ml Permeabilisationspuffer (0,2% Triton in PBS) hinzu.
5. Drehen Sie das Rohr bei Raumtemperatur für 20 min (dies stellt sicher, dass alle Organoide in Suspension bleiben).
6. Pellet die Organoide bei 300 x g für 2 min, und dann den Überstand entsorgen.
7. Die Organoide in 500 l Blockierlösung sanft aussetzen (siehe Materialtabelle) und in ein 2 ml Mikrozentrifugenrohr übertragen.
8. 20 min bei Raumtemperatur auf einem Shaker inkubieren. Organoide durch Schwerkraft an den Boden des Rohres ansetzen lassen. Ersetzen Sie die Blockierlösung durch eine primäre Antikörperlösung (siehe Materialtabelle) und brüten Sie bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C 1–2 h inkubieren.
9. Waschen Sie 3x mit PBS mit 0,1% Tween. Lassen Sie die Organoide jedes Mal absetzen und entfernen Sie den Überstand.
10. Fügen Sie eine sekundäre Antikörperlösung hinzu (siehe Materialtabelle) und brüten Sie 2 h bei Raumtemperatur.
11. Waschen Sie 3x mit PBS mit 0,1% Tween. Lassen Sie 50 l PBS nach der dritten Wäsche.
12. Montieren Sie die Organoide, die in 50 l PBS auf der Folie hängen, auf der Rutsche, indem Sie sie pipetieren. Entfernen Sie überschüssige PBS, fügen Sie einen Tropfen Montagemittel hinzu (siehe Materialtabelle) und fügen Sie den Deckzettel oben hinzu. Versiegeln Sie die Seiten mit Nagellack und lassen Sie es trocknen.

6. Isolierung von Oozysten von Organoiden

1. Isolieren Sie neu gebildete Oozysten aus dem organoiden Lumen.
   notiz:Oozysten werden durch immunmagnetische Trennung mittels eines Oozysten-Isolationskits von den Organoiden isoliert (sieheMaterialtabelle) mit den unten beschriebenen Änderungen. Die isolierten Oozysten können dann durch Immunfluoreszenz und Elektronenmikroskopie analysiert werden.
   1. Beginnen Sie mit differenzierten Organoiden, die in OMD für 5-7 Tage gepflegt wurden und die nicht infiziert sind, für 1 Tag infiziert und für 5 Tage infiziert. Verwenden Sie die ersten beiden als Negative-Steuerelemente.
      HINWEIS: Wir haben herausgefunden, dass differenzierte Organoide mehr Oozysten produzieren als Lungen- oder expandierende Darmorganoide¹⁰.
   2. Organoide in 15 ml Zentrifugenröhren sammeln. Zentrifugieren Sie die Organoide für 20 min bei 3.000 x g und 10 °C.
      HINWEIS: Diese hohe Geschwindigkeit wird benötigt, um sicherzustellen, dass keine Oozysten aus organoiden verloren gehen, die gebrochen werden können.
   3. Entfernen Sie die organoiden Medien und ersetzen Sie es durch 5 ml Wasser.
   4. Stören Sie die Organoide durch wiederholtes kräftiges Pipettieren mit einer feuerpolierten Glas Pasteur Pipette.
   5. Wenn Klumpen sichtbar sind, übertragen Sie die organoide Suspension auf einen Glas-Dounce-Homogenisator und homogenisieren, bis Organoide gut gestört sind. Der Dounce Homogenisator wirkt sich nicht auf die Oozysten aus.
   6. Sobald keine sichtbaren Klumpen vorhanden sind, fügen Sie 5 ml Puffer A aus dem Oozysten-Isolationskit hinzu. Mischen sie und fügen Sie dann 120 l der magnetischen Perlen mit Anti-Oozyste IgM beschichtet.
   7. Inkubieren Sie die Zellsuspension und magnetische Perlen für 2 h bei Raumtemperatur mit kontinuierlichem Mischen auf einer Rockerplattform.
   8. Legen Sie am Ende der Inkubation die Rohre, die Zellen und Perlen enthalten, auf ein magnetisches Trenngestell für 15 ml-Rohre.
   9. Drehen Sie die Rohre im magnetischen Trennträger manuell für 3 min. Die Perlen haften an der Seite des Rohres neben dem Magneten.
   10. Mit einer 10 ml Pipette den Überstand vorsichtig von den Perlen entfernen. Die Perlen in 450 l Puffer B wieder aufhängen und in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr übertragen.
       HINWEIS: Halten Sie den Überstand, bis die Isolierung der Oozysten bestätigt ist.
   11. Um die verbleibenden Perlen und Oozysten zu sammeln, waschen Sie das 15 ml-Rohr mit 450 l Puffer B und fügen Sie diese Wäsche zu den magnetischen Perlen im Mikrozentrifugenrohr hinzu.
   12. Wiederholen Sie Schritt 6.1.11 noch einmal. Alle Perlen und erfassten Oozysten sollten nun in das Mikrozentrifugenrohr übertragen werden.
   13. Legen Sie das Mikrozentrifugenrohr auf ein magnetisches Trenngestell, das für die Aufnahme von Mikrozentrifugenrohren ausgelegt ist.
   14. Drehen Sie das Rohr im magnetischen Trennträger von Hand für 3 min.
   15. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette in ein neues Rohr.
       HINWEIS: Halten Sie den Überstand, bis die Isolierung der Oozysten bestätigt ist.
   16. Entfernen Sie das Mikrozentrifugenrohr, das magnetische Perlen und Oozysten enthält, aus dem magnetischen Trenngestell.
   17. Fügen Sie 100 l 0,1 N HCl zu magnetischen Perlen hinzu, um die Oozysten von den Perlen zu entkernen. Wirbel für 30 s.
       HINWEIS: Vortexer sollte auf etwas weniger als die maximale Geschwindigkeit eingestellt werden.
   18. Inkubieren Sie die Perlen in 0,1 N HCl für 10 min bei Raumtemperatur.
   19. Wieder Wirbel. Legen Sie das Rohr dann wieder auf das magnetische Trenngestell. Warten Sie, bis die Perlen an der Seite des Rohres haften und übertragen Sie den Überstand dann in ein neues Mikrozentrifugenrohr.
   20. Wiederholen Sie die Schritte 6.1.17 bis 6.1.19 und kombinieren Sie das zweite Eluat mit der ersten Elution.
   21. Neutralisieren Sie das Eluat mit 20 l von 1 N NaOH oder einem anderen Neutralisationspuffer wie 1 M Tris, pH 8.
   22. Um Oozysten zu zählen, nehmen Sie 10 l des Eluats, kombinieren Sie es mit 10 l oozysspezifischen Antikörpern (siehe Tabelle der Materialien) und zählen Sie fluoreszierende Oozysten auf einem Hämozytometer.
       HINWEIS: Isolierte Oozysten können bei 4 °C gelagert oder sofort für die Immunfluoreszenz oder Elektronenmikroskopie-Bildgebung verwendet werden.

Ergebnisse

Die hier vorgestellten Protokolle führen zur effizienten Reinigung von Oozysten und Sporozoiten (Abbildung 1A) bereit für die Mikroinjektion. Das Excystationsprotokoll führt zur Freisetzung von Sporozoiten von ca. 70–80% der Oozysten, daher ist es wichtig, die verbleibenden Oozysten und Schalen durch einen 3-m-Filter herauszufiltern. Die Filtration führt zu einer fast 100% Sporozoitreinigung (Abbildung 1B). Darüber hinaus trägt die Zugabe eines grünen F...

Diskussion

Kultur von Cryptosporidium Parasiten in Darm- und Atemwegsorganoiden bietet ein genaues Modell, um Wirt-Parasiten-Wechselwirkungen zu studieren^10, hat aber auch viele andere Anwendungen. Zum Beispiel erfordern die aktuellen Methoden zur Auswahl und Verbreitung genetisch veränderter Cryptosporidium-Parasiten die Durchfahrt in Mäuse^19, die keine Isolierung von Parasiten zulässt, die für eine In-vivo-Infektion wesentliche Modifikationen aufweisen. Organoi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Basement membrane extract (extracellular matrix)	amsbio	3533-010-02
Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody)	Waterborne, Inc	A400FLR-1X	Final Concentration = Use 2-3 drops/slide
Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads	Waterborne, Inc	IMS400-20
Dynamag 15 rack	Thermofisher Scientific	12301D
Dynamag 2 rack	Thermofisher Scientific	12321D
EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µm	EMD-Millipore	TSTP02500
Fast green dye	SIGMA	F7252-5G
Femtojet 4i Microinjector	Eppendorf	5252000013
Glass capillaries of 1 mm diameter	WPI	TW100F-4
Matrigel (extracellular matrix)	Corning	356237
Microfuge tube 1.5 mL	Eppendorf	T9661-1000EA
Micro-loader tips	Eppendorf	612-7933
Micropipette puller P-97	Shutter instrument	P-97
Normal donkey Serum	Bio-Rad	C06SB
Penstrep	Gibco	15140-122
Sodium hypoclorite (use 5%)	Clorox	50371478
Super stick slides	Waterborne, Inc	S100-3
Swinnex-25 47 mm Polycarbonate filter holder	EMD-Millipore	SX0002500
Taurocholic acid sodium salt hydrate	SIGMA	T4009-5G
Tween-20	Merck	8221840500
Vectashield mounting agent	Vector Labs	H-1000
Vortex Genie 2	Scientific industries, Inc	SI0236
Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)			Final amount
DMEM	Invitrogen	12634-010	500 mL
Penstrep	Gibco	15140-122	5 mL of stock in 500 mL DMEM
Glutamax	Gibco	35050038	5 mL of stock in 500 mL DMEM
Hepes	Gibco	15630056	5 mL of stock in 500 mL DMEM
INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media)			Final concentration
A83-01	Tocris	2939-50mg	0.5 µM
Adv+++			make up to 100 mL
B27	Invitrogen	17504044	1x
EGF	Peprotech	AF-100-15	50 ng/mL
Gastrin	Tocris	3006-1mg	10 nM
NAC	Sigma	A9125-25G	1.25 mM
NIC	Sigma	N0636-100G	10 mM
Noggin CM	In house*		10%
P38 inhibitor (SB202190)	Sigma	S7076-25 mg	10 µM
PGE2	Tocris	2296/10	10 nM
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1	1 mL/500 mL media
RSpoI CM	In house*		20%
Wnt3a CM	In house*		50%
In house* - cell lines will be provided upon request
INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media)			To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME)
LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media)			Final concentration
Adv+++			make up to 100 mL
ALK-I A83-01	Tocris	2939-50mg	500 nM
B27	Invitrogen	17504044	0.0763888889
FGF-10	Peprotech	100-26	100 ng/mL
FGF-7	Peprotech	100-19	25 ng/mL
N-Acetylcysteine	Sigma	A9125-25G	1.25 mM
Nicotinamide	Sigma	N0636-100G	5 mM
Noggin UPE	U-Protein Express	Contact company directly	10%
p38 MAPK-I	Sigma	S7076-25 mg	1 µM
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1	1:500
RhoKI Y-27632	Abmole Bioscience	M1817_100 mg	2.5 µm
Rspo UPE	U-Protein Express	Contact company directly	10%
Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection)			Final concentration
L-Glutathione reduced	Sigma	G4251-10MG	0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM
Betaine	Sigma	61962	0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM
L-Cysteine	Sigma	168149-2.5G	0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM
Linoleic acid	Sigma	L1376-10MG	6.8 μg/mL of OME/OMD /LOM
Taurine	Sigma	T0625-10MG	0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM
Blocking buffer (for immunoflourescence staining)			Final concentration
Donkey/Goat serum	Bio-Rad	C06SB	2%
PBS	Thermo-Fisher	70011044	Make up to 100 mL
Tween 20	Merck	P1379	0.1%
List of Antibodies used
Alexa 568 goat anti-rabbit	Invitrogen	A-11011	Dilution-1:500; RRID: AB_143157
Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo	Waterborne, Inc	A400FLK	Dilution- 1:200
Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive	Waterborne, Inc	IMS400-20	Dilution-1:500
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306	Dilution-1:1,000; RRID : AB_2629482
Phalloidin-Alexa 674	Invitrogen	A22287	Dilution-1:1,000; RRID: AB_2620155
Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O’Connor (co-author).	Upon request	Upon request	Dilution-1:500
Sporo-Glo	Waterborne, Inc	A600FLR-1X	Dilution- 1:200