Mikroenjeksiyon ile 3Boyutlu Doku Kaynaklı İnsan Organoid Kültür Sistemlerinde Cryptosporidium Enfeksiyonunun İncelanması

Özet

Biz cryptosporidium parvum tarafından insan bağırsak ve hava yolu organoidleri enfeksiyonu incelemek için ookistler hazırlamak ve sporozoitler arındırmak için protokoller açıklar. Parazitlerin bağırsak organoid lümenine mikroenjeksiyon ve organoidlerin immünboyamı ile ilgili prosedürleri gösteriyoruz. Son olarak, organoidlerden üretilen ookistlerin izolasyonu tarif.

Özet

Cryptosporidium parvum insan ishal hastalığının başlıca nedenlerinden biridir. Parazitin patolojisini anlamak ve etkili ilaçlar geliştirmek için konaktaki koşulları özetleyen bir in vitro kültür sistemine ihtiyaç vardır. Kökenleri dokulara yakından benzeyen organoidler, konak-parazit etkileşimlerini incelemek için idealdir. Organoidler, erişkin kök hücrelerden elde edilen ve herhangi bir genetik sapma veya dönüşüme maruz kalmadan uzun süre kültürde yetişen üç boyutlu (3D) doku kaynaklı yapılardır. Hem apikal hem de bazolateral yüzeylerde polariteyi iyi tanımlamıştır. Organoidler ilaç testi, biyo bankacılık ve hastalık modelleme ve konak-mikrop etkileşim çalışmalarında çeşitli uygulamalara sahiptir. Burada insan bağırsak ve hava yolu organoidleri enfekte cryptosporidium oocysts ve sporozoitler hazırlamak için nasıl bir adım-adım protokol sıyoruz. Daha sonra mikroenjeksiyon un mikropların organoid lümene enjekte edilmesinde nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Organoidlerin konak-mikrop etkileşimi çalışmaları için kullanılabilen üç ana yöntem vardır: mikroenjeksiyon, mekanik kesme ve kaplama, ve monolayers yaparak. Mikroenjeksiyon, 3B yapının bakımını sağlar ve parazit hacimlerinin hassas kontrolünü ve mikroplar için doğrudan apikal yan kontak sağlar. Biz görüntüleme veya ookist üretimi için organoidlerin optimal büyüme için ayrıntıları sağlar. Son olarak, biz de nasıl yeni oluşturulan ookistler daha aşağı işleme ve analiz için organoid izole edilebilir göstermek.

Giriş

Cryptosporidium enfeksiyonunun tedavisi ve önlenmesi için ilaç veya aşıların geliştirilmesi, insanlardaki in vivo durumunu tam olarak taklit eden in vitro sistemlerin eksikliği nedeniyle engellenmiştir^1,2. Şu anda mevcut sistemlerin çoğu ya sadece kısa süreli enfeksiyon (<5 gün) izin veya parazit 3 tam yaşam döngüsünü desteklemiyor^3,4. Parazitin tam gelişimini sağlayan diğer sistemler, insanlardaki fizyolojik durumu sadakatle özetlemeyen ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarına veya kanser hücresi hatlarına dayanır^5,6,7 . Organoidler veya 'mini organlar' çeşitli doku spesifik büyüme faktörleri ile desteklenen bir ekstrasellüler matris yetiştirilen 3D doku türetilmiş yapılardır. Organoidler çeşitli organ ve dokulardan geliştirilmiştir. Genetik olarak stabildirler ve kökenlerindeki organların işlevlerinin çoğunu yeniden özetlerler ve kültürde uzun süre korunabilirler. Biz cryptosporidium ile insan bağırsak ve akciğer organoidleri enfekte etmek için bir yöntem geliştirdik bağırsak ve solunum cryptosporidiosis ile ilgili konak-parazit etkileşimleri çalışması için doğru bir in vitro modeli sağlar^{8 ,9,10,11,12,13}. Diğer yayınlanan kültür modellerinin aksine, organoid sistem gerçek hayattaki ev sahibi parazit etkileşimlerini temsil eder, yaşam döngüsünün tamamlanmasına izin verir, böylece parazit yaşam döngüsünün tüm aşamaları incelenebilir ve parazit yayılımını sürdürür 28 güne kadar¹⁰.

Cryptosporidium parvum, solunum ve bağırsak hastalıklarının epitelyumuna bulaştıran ve uzun süreli ishal hastalığına neden olan apikompleks bir parazittir. Dirençli çevre aşaması, kontamine gıda ve su¹⁴bulunan ookist, olduğunu. Bir kez yutulan veya solunan, ookist ekstistler ve epitel hücrelerine eklemek dört sporozoitler bültenleri. Sporozoitler konak hücreleri üzerinde süzülür ve konak hücre reseptörlerini meşgul, ama parazit tam hücre işgal etmez, ve onu yutmak için konak hücre ikna etmek için görünür¹⁵. Hücre içi ama ekstrasitoplazmik bir bölmede içselleştirilen parazit, hücrenin apikal yüzeyinde kalır ve parasitoforik vakuol içinde çoğalır. Bu eşeysiz üreme iki tur uğrar- merogony denilen bir süreç. Merogony sırasında, tip I merontlar yeni hücreleri istila etmek için yayımlanan sekiz merozoitler içeren geliştirmek. Bu merozoitler dört merozoit içeren tip II merontlar geliştirmek için yeni hücreler işgal. Bu merozoitler, serbest bırakıldığında, hücreleri enfekte ve macrogamonts ve microgamonts gelişir. Mikrogametler serbest bırakılır ve ookistlere dönüşen zigotlar üreten makrogametleri döllerler. Olgun ookistler daha sonra lümen içine serbest bırakılır. Oocysts ya ince duvarlı olan hemen epitel reinfect için ekstst, ya da bir sonraki konak¹⁴enfekte etmek için çevreye salınan kalın duvarlı . Cryptosporidium yaşam döngüsünün tüm aşamaları daha önce grup¹⁰tarafından geliştirilen organoid kültür sisteminde tanımlanmıştır.

İnsan organoidler sadakatle insan dokuları^çoğaltmakberi 9^,11,13, ve Cryptosporidiumtüm çoğaltıcı aşamaları desteklemek¹⁰, onlar çalışmak için ideal doku kültür sistemi Cryptosporidium biyolojisi ve ev sahibi parazit etkileşimleri. Burada hem Cryptosporidium ookistler hem de ekstisli sporozoitlerle organoidlere bulaşmaya ve bu doku kültür sisteminde üretilen yeni ookistlerin izole edilmesine yönelik prosedürleri açıklıyoruz.

Protokol

Tüm doku işleme ve rezeksiyon, Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) onaylı protokoller altında hasta onayı ile gerçekleştirildi.

1. Enjeksiyon için C. parvum Oocysts hazırlanması

NOT: Cryptosporidium oocysts ticari bir kaynaktan satın alınmıştır (Malzemeler Tablosubakınız). Bu ookistler buzağılarda üretilir ve fosfat tamponlu salinde (PBS) antibiyotiklerle depolanır. 4 °C'de yaklaşık 3 ay saklanabilir ler ve asla dondurulmaması gerekir. Biz normalde bir ay içinde oocysts kullanın. Organoidler ya bozulmamış ookistler ile enfekte olabilir, ya da sporozoitler ekstisli ookistlerden izole edilebilir ve orijinal inokülden ookistlerin taşınması önemliyse organoidleri enfekte etmek için kullanılabilir.

1. Cryptosporidium ookistleri hücrelere bulaştırmak için hazırlayın (Şekil 1A).
   1. Onlar organoidler eklenene kadar tüm manipülasyonlar boyunca buz üzerinde oocysts tutun.
   2. Organoidlerin tam altı iyi plaka (genellikle plaka için yaklaşık 5 x 10⁵-2,5 x 10⁵⁾ için gerekli ookist sayısını hesaplayın. Miktarı doğrulamak ve bir santrifüj tüpüne aktarmak için bir hemositometreookist lerin sayısını sayın.
      NOT: Görüntülemeye yardımcı olmak için ookistler hemositometreye yüklenmeden önce ookist spesifik floresan antikorla (Malzeme Tablosunabakınız) 1:1 karıştırılabilir. Florofor etiketli ookistler daha sonra floresan mikroskobu kullanılarak kolayca görüntülenebilir ve numaralandırılabilir. Yaklaşık 100-1.000 ookist/organoid enjekte etmenizi öneririz. Genel olarak, 1.000-2.000 organoidler altı kuyulu bir tabakta yetiştirilebilir.
   3. Ookistsüspansiyonun hacmini PBS ile 900 μL'ye kadar getirin. 100 μL sodyum hipoklorit (örneğin, Clorox) çamaşır suyu (4 °C'de) ekleyin. Buz üzerinde 10 dakika kuluçka.
   4. 4 °C'de 8.000 x g'de mikrosantrifüjde 3 dk santrifüj. Kapağı niçin içe bakacak şekilde açılan santrifüjdeki tüpleri yönlendirin. Pelet parazitlerin tüpiçinde peletlenmiş nerede olduğunu bilerek görmek zor olabilir.
   5. Pelet önlemek için dikkatli olan bir pipet ile supernatant çıkarın. Karıştırmak için Dulbecco modifiye Eagle's orta (DMEM) ve girdap 1 mL ekleyin.
   6. 4 °C'de 8.000 x g'de mikrosantrifüjde 3 dk santrifüj.
   7. DMEM ile iki kez daha yıkın.
   8. Taurokolat %0,5 (w/v) (Bkz. Malzeme Tablosuna)eklenen genleşme ortamını (OME) veya farklılaşma organoid ortamını (OMD) hazırlayın. Taurokolat her zaman hazırolmalı ve taze eklenmelidir.
      NOT: İnokülün bozulmamış ookistler olduğu enfeksiyon tahlillerimizde %0.5 taurokolat başarıyla kullandık ve konak hücreler üzerinde zararlı etkileri olmadan enfeksiyon oranlarının arttığını gördük. Ancak, taurokolat hücreler üzerinde beklenmedik etkileri olabilir, ve düşük konsantrasyonlarda enfeksiyon tahlilleri başarıyla kullanılmıştır¹⁶.
   9. 100 μL organoid kültür ortamında %0.5 (w/v) sodyum taurokolat ile takviye edilen ookistleri resuspend. 1.1.2 adımda açıklandığı gibi ookistleri tekrar sayın.
   10. Enjeksiyonu görselleştirmek için süspansiyona Hızlı Yeşil boya ekleyin.
   11. Mikro yükleyici uçlarını (Malzeme Tablosu'nabakın) ookist süspansiyonuyla doldurun ve çekilen kılcal damarları doldurmak için kullanın.
       DİkKAT: Tüm işlem seviye-2 güvenlik protokolleri ile bir doku kültürü başlık yapılmalıdır. Cryptosporidium oocysts de havayoluyla bulaşıcı olabilir gibi maskekullanımı tavsiye edilir.

2. C. parvum Oocysts gelen Sporozoitlerin Vitro Arıtma

1. Yukarıda açıklandığı gibi ağartma ve çamaşır suyu yıkama sonra C. parvum oocysts gelen sporozoitler arındırın.
   1. Ookistleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Oda sıcaklığında eksistosortalarda ookistlerin resuspend ihyası (DMEM'de %0.75 w/v sodyum taurokolate) 1 x 10⁷ oocysts/mL elde etmek. Taurokolat eklenmesi ookistlerin eksistosit oranını artırır, sporozoit verimi artırmak.
   2. 37 °C'de 1-1,5 saat kuluçka ookist süspansiyonu.
   3. Excystation ölçüde örnek mikroskobik kontrol edin; Sporozoitlerin iyi iyileşmesi için %60-80 eksisestasyon makuldür. Ekscystation düzeyi düşükse, daha uzun kuluçka (başka bir 30 dk için 1 saat).
   4. Başlangıç ookistsayısına göre yüzde ekscystation belirleyin. Excystation olarak hesaplanır:
      % ekscystation = [1 – (başlangıçta bozulmamış ookist sayısı/ookist sayısı)] x 100
   5. 14 mL PBS veya orta, karıştırma ve kurtarma hücreleri (bozulmamış oocysts, oocyst kabukları ve sporozoitler) eksisit reaktifleri kaldırmak için hücreleri yıkamak 3,400 x g 20 dk sporozoitler kurtarmak için santrifüj tarafından. Hücreleri kaybetmemek için dikkatlice aspire edin.
   6. DMEM'in 1-2 mL'sinde sporozoit peletini yeniden askıya alınve 3 x 10⁷ oocysts/mL elde edin (başlangıç ookist sayısına göre).
   7. Kalan ookistleri ve kabukları temizlemek için süspansiyonu 3 μm'lik bir filtreden geçirin(Şekil 1B). 10 mL'lik şırınga namlusuna bağlı polikarbonat filtre (3 μm gözenek boyutu) ile donatılmış 47 mm filtre tutucu cihazı kullanın. Filtre tutucu cihazı 15 mL'lik bir tüpün üzerine yerleştirin. Bir buz kovası veya soğuk odada montaj yerleştirin.
   8. Filtre tertibatına sporozoit süspansiyonunun 7,5 mL'sini ekleyin ve yerçekimine göre filtrelemenize izin verin. 7,5 mL'lik başka bir DMEM ile yıkayın.
      NOT: Sporozoit izolasyontaze ookistler ve iyi excystation başarı sağlamak için önemlidir. Çok fazla ekskistsiz ookist varsa, süspansiyon yerçekimi ile akmaz. Şırınga üzerinde basınç uygulanması ekskissiz ookistler ile zorlayabilir. Sporozoitlerin mikroenjeksiyonu ookistlerden daha zordur çünkü sporozoitler kümelenebilir ve kılcal damarı bloke edebilir. Bunu önlemek için, biz sporozoitler ile organoidler enjekte ederken daha geniş bir kılcal uç yapmanızı öneririz. Yeterli enfeksiyon düzeyine ulaşmak için, ookist lerle enfekte organoidlere kıyasla her organoide sporozoit sayısının 2-4 kat daha fazla enjekte edilmesi gerekir.
   9. Filtrelenmiş sporozoit süspansiyonun3.400 x g'de, 20 dk'lık sallanan kova rotoru ile pelet sporozoitleri santrifüj edin.
   10. 50-100 μL OME veya OMD organoid kültür ortamında (Bkz. Malzeme Tablosu)%0,05 (w/v) Hızlı Yeşil boya ve L-glutatyon, betain, L-sistein, linoleik asit ve taurin içeren azaltıcı tampon⁵ (bkz. Malzeme Tablosu).
       NOT: Ookistlerin çok uzun süre kuluçkaya yatması sporozoitlerin lysis ve kötü iyileşmeye neden olabilir ve bu nedenle kaçınılmalıdır.

3. Mikroenjeksiyon için İnsan Bağırsak ve Akciğer Organoidleri In Vitro Kültür

1. Genişleme ve farklılaşma ortam koşulları altında kültür bağırsak organoidler.
   Not:Bağırsak ve akciğer organoid yayılımının ayrıntıları daha önce diğer makalelerde açıklanmıştır.^8,13(bkz.Malzeme Tablosumedya tarifleri için). Burada organoid kültür yöntemini kısacaCryptosporidiumenjeksiyon ve büyüme. Organoidlerde parazitlerin görüntülenmesi için genişleme ortamında yetişen organoidlerin, farklılaşma ortamında yetişen organoidlerde görülenden daha az enkaz birikimi olduğu için, büyüme farklılaşma ortamlarında yetiştirilen organoidlerin tercih edildiğini bulduk. Ancak amaç ookistleri izole etmekse, farklılaşma ortamlarında yetişen organoidler çok daha fazla sayıda ookist üretirler.
   1. 37 °C'de hücre dışı matrislerde 3B kültürlerde organoidleri muhafaza edin (Bkz. Malzemeler Tablosu). Üstüne OME (genişletme ortamı) ekleyin ve her gün yenileyin.
      NOT: Akciğer organoidleri için ayrı genişleme ve farklılaşma ortamımız yoktur.
   2. Mikroenjeksiyon için organoidleri bölmek ve plakalamak için, insan organoidleri içeren 6 kuyulu plakadan ortam çıkarın ve kuyuya F12+++ (Malzeme TablosunaBakın) ekleyin ve 1 mL pipet ucu yla boru lama ile matrisi birkaç kez parçalayın. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpe toplayın (tüp başına 2 mL F12+++ daha fazla işlem için yeterlidir).
   3. Başka bir 15 mL tüp içine F12 +++ 10-12 mL ekleyin ve insan bağırsak ve akciğer organoidleri kırmak için orta, pipet yukarı ve aşağı 3 kez içine bir ateş cilalı cam pipet yerleştirin.
      NOT: Uzun bir cam pipet (20-30 cm) kullanın ve kısa bir süre ateş cila. Organoidler zarar görebildiği için açıklığı (1 mm çapında) çok küçük yapmayın. Kısa bir süre ateş parlatarak pipetin ucunu pürüzsüz hale getirin. Organoidleri ~50 μm'lik daha küçük parçalara ayırın. Akciğer organoidleri daha kalın bir dış zara sahiptir ve bu nedenle bağırsak organoidlerine göre cam pipetle daha güçlü kesme gerektirir. Ayrıca, bağırsak organoidler (her passaging arasında 14 güne kadar) daha yavaş bir büyüme hızı var.
   4. 5-7 mL'ye kadar F12+++ ve 5 dk boyunca 350 x g'de santrifüj ekleyin.
      NOT: Bu adımda santrifüj hızı, hücre dışı matristen iyi ayrılmış iyi bir hücre peleti yapmak için normalden daha yüksektir (Bkz. Malzemeler Tablosu). Fare ince bağırsak organoidlerine göre insan ince bağırsak organoidlerinin bozulmasının daha zor olduğunu gözlemledik.
   5. Hücreleri rahatsız etmeden mümkün olduğunca çok orta çıkarın, sonra 4 °C'de tutulan matris ile pelet yeniden askıya; Altı kuyulu bir plakanın kuyu başına 200-300 μL matrisi gereklidir. Organoidler oldukça yüksek hücre yoğunluğunu korumak için üçte bir bölünmelidir.
   6. Organoidleri her biri yaklaşık 5-10 μL'lik matris damlacıklarında altı kuyulu bir plakanın kuyusu içinde plakalayın. 37 °C'de 20-30 dk kuluçkaya yatırın ve üzerine genleşme ortamı (OME) ekleyin.
   7. Her 2-3 günde bir ortamı değiştirin.
      NOT: Yaklaşık 5-7 gün içinde, EM'de büyüyen organoidler 100-200 μm'lik bir boyuta ulaşır lar ve enjeksiyona hazırdırlar.
   8. EM'de 5-6 gün sonra organoidleri ayırt etmek için ortamı farklılaşma ortamı (DM) koşullarına göre değiştirin ve parazitleri enjekte etmeden önce 5-6 gün daha tutun.
      NOT: Organoidlerin genişlemesi için organoidlerin yoğun olarak plakakullanılması tavsiye edilir. Mikroenjeksiyon için, altı kuyulu bir plaka kullanımı daha az yoğunlukta kaplanmış organoidler ile tavsiye edilir. Örneğin, altı kuyuluk bir plakanın üç kuyudan mikroenjeksiyonlar için tam altı kuyuluk plakasına plaka organoidleri. Matris uzun süreli depolama için -20 °C'de muhafaza edilmeli ve kullanılmadan önce 4 °C'de veya buz üzerinde çözülmelidir. Akciğer organoidlerinin genişlemesi benzer bir şekilde yapılır ancak akciğer organoidine özgü media bileşenleri(Tablo 1)⁸ .

4. Organoid Lümen içine Ookistler / Sporozoitler Mikroenjeksiyon

1. 3D organoidin apikal tarafına mikroenjekte parazitler (Şekil 2).
   1. Mikro pipet çekmece sikullanarak 1 mm çapındaki cam kılcal damarlar hazırlayın.
      NOT: Mikropipet çekmecede kullanılan ayarlar (Bkz. Malzeme Tablosu)şunlardır: Isı = 663, Pull = 100, Hız = 200, Zaman = 40 ms. Ayarlar belirli bir makineiçin kullanıcı talimatlarına göre ayarlanmalıdır.
   2. Kılcal damarın ucunu forceps ile kesin. Kılcal uç boyutu/çapı 9-12 μm; bu ookistlerin kolay akışını sağlar (4-5 μm boyutu).
   3. Mikro-loader ipuçları nı kullanarak kılcal damarları ookist veya sporozoit süspansiyonile doldurun.
   4. Ookist dolu kılcal damarı bir mikroenjektöre yükleyin.
   5. Mikroenjekte 100-200 nL süspansiyon her organoid içine ters bir mikroskop altında 5x büyütme, basınç sabit tutmak. Mikroenjeksiyondan sonra, her gün OME veya OMD ile ortam yenileyin ve plakayı 37 °C'de koruyun.
      NOT: Mikroenjeksiyon için mikromanipülatör kullanmayız. Her numunede eşit enjeksiyon sağlamak için tüm deney için aynı kılcal damar kullanımı önerilir.

5. Organoidlerin İmmünofluoresans Boyama

1. P1000 pipetli organoidleri (1-2 x 24 kuyu) soğuk F12+++içeren 15 mL'lik bir tüpe toplayın.
2. Pelet organoidler 300 x g için 2 dakika, pelet bozmadan supernatant kaldırmak ve yavaşça kalan hacim içine gevşek pelet pipet.
3. PBS'de %2 paraformaldehit 5 mL ekleyin. Organoidlerin duvara yapışmasını önlemek için tüpü ters çevirmeyin. Organoidlerin tüpün dibine yerleşmelerine ve gece boyunca 4 °C'de veya oda sıcaklığında 1 saat eve yerleşmelerine izin verin.
4. Fiksatif kaldırın ve permeabilizasyon tamponu 10 mL ekleyin (%0.2 PBS Triton).
5. Tüpü oda sıcaklığında 20 dakika döndürün (bu tüm organoidlerin süspansiyonda kalmasını sağlar).
6. 2 dk için 300 x g organoidler pelet, ve sonra supernatant atın.
7. 500 μL'lik bloklama çözeltisinde (Malzeme Tablosunabakınız) organoidleri nazikçe yeniden askıya alın ve 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
8. Bir shaker oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka. Organoidlerin yer çekimi ile tüpün dibine yerleşmelerine izin verin. Bloke çözeltisini birincil antikor solüsyonuyla değiştirin (Bkz. Malzeme Tablosu)ve oda sıcaklığında veya gecelemede 4 °C'de 1-2 saat kuluçkaya yatırın.
9. % 0.1 Tween içeren PBS ile 3x yıkayın. Organoidler her zaman yerleşmek ve supernatant kaldıralım.
10. İkincil antikor solüsyonu ekleyin (Malzemeler Tablosunabakın) ve oda sıcaklığında 2 saat kuluçkaya yatırın.
11. % 0.1 Tween içeren PBS ile 3x yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra 50 μL PBS bırakın.
12. Slaytta 50 μL PBS'de asılı olan organoidleri pipetleyerek kaydıra monte edin. Fazla PBS'yi çıkarın, bir damla montaj maddesi ekleyin (Malzemeler Tablosunabakın) ve coverslip'i en üste ekleyin. Oje ile kenarları mühür ve kurumasına izin.

6. Ookistlerin Organoidlerden İzolasyonları

1. Organoid lümenden yeni oluşan ookistleri izole edin.
   Not:Ookistler, immünomanyetik ayırma ile organoidlerden izole edilir (bkz.Malzeme Tablosu) aşağıda açıklanan değişiklikler ile. İzole ookistler daha sonra immünoresans ve elektron mikroskobu ile analiz edilebilir.
   1. OMD'de 5-7 gün süreyle tutulan ve enfekte olmamış, 1 gün enfekte olmuş ve 5 gün enfekte olmuş farklılaştırılmış organoidlerle başlayın. İlk ikisini negatif denetim olarak kullanın.
      NOT: Biz diferansiye organoidler akciğer veya genişleyen bağırsak organoidler¹⁰daha fazla ookist üretmek bulduk.
   2. Organoidleri 15 mL santrifüj tüpünde toplayın. 3.000 x g ve 10 °C'de 20 dk için organoidleri santrifüj edin.
      NOT: Bu yüksek hız hiçbir ookistkırık olabilir herhangi bir organoidler dışında kayıp olduğundan emin olmak için gereklidir.
   3. Organoid ortamı çıkarın ve 5 mL su ile değiştirin.
   4. Bir yangın cilalı cam Pasteur pipet ile tekrarlanan güçlü pipetleme organoidler bozun.
   5. Kümeler görünürse, organoid süspansiyonu bir cam danhomogenizer'e aktarın ve organoidler iyice bozulana kadar homojenize edin. Dounce homogenizer ookistleri etkilemez.
   6. Görünür kümeler olmadığında, ookist izolasyon kitinden 5 mL arabellek A ekleyin. Karıştırın ve sonra anti-oocyst IgM ile kaplanmış manyetik boncuk120 μL ekleyin.
   7. Hücre süspansiyonu ve manyetik boncukları oda sıcaklığında 2 saat boyunca, rocker platformunda sürekli karıştırma ile kuluçkaya yatırın.
   8. Kuluçka sonunda, hücre ve boncuk içeren tüpleri 15 mL tüpler için tasarlanmış manyetik ayırma rafına yerleştirin.
   9. Tüpleri manyetik ayırma rafındaki 3 dk boyunca manuel olarak döndürün. Boncuklar mıknatısın yanındaki tüpün yan tarafına yapışır.
   10. Dikkatle, 10 mL pipet ile, boncuksupernatant kaldırın. 450 μL Tampon B'deki boncukları yeniden askıya alın ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın.
       NOT: Ookistlerin izolasyonu onaylanana kadar supernatant tutun.
   11. Kalan boncuk ve ookistleri toplamak için 15 mL'lik tüpü 450 μL Tampon B ile yıkayın ve bu yıkamayı mikrosantrifüj tüpündeki manyetik boncuklara ekleyin.
   12. Adım 6.1.11'i bir kez daha tekrarlayın. Tüm boncuklar ve yakalanan ookistler artık mikrosantrifüj tüpüne aktarılmalıdır.
   13. Mikrocentrifuge tüplerini tutmak için tasarlanmış manyetik ayırma rafına mikrosantrifüj tüpünü yerleştirin.
   14. 3 dakika boyunca elle manyetik ayırma rafındaki tüpü döndürün.
   15. Yeni bir tüp içine bir pipet ile supernatant dikkatle çıkarın.
       NOT: Ookistlerin izolasyonu onaylanana kadar supernatant tutun.
   16. Manyetik ayırma rafından manyetik boncuk lar ve ookistler içeren mikrosantrifüj tüpünü çıkarın.
   17. Boncuklardan ookistleri çıkarmak için manyetik boncuklara 0,1 N HCl'lik 100 μL ekleyin. 30 s.'lik girdap.
       NOT: Girdap maksimum hızdan biraz daha az olacak şekilde ayarlanmalıdır.
   18. Oda sıcaklığında 10 dakika için 0,1 N HCl boncuk kuluçka.
   19. Yine girdap. Daha sonra tüpü manyetik ayırma rafına geri yerleştirin. Boncuklar için tüp tarafına uymak için bekleyin ve sonra yeni bir mikrosantrifüj tüp için supernatant aktarın.
   20. 6.1.17 ile 6.1.19 adımlarını tekrarlayın ve ikinci eluate ile ilk eluat'ı birleştirin.
   21. Eluate'yi 20 μL 1 N NaOH veya 1 M Tris, pH 8 gibi başka bir nötralize tamponu ile nötralize edin.
   22. Ookistleri saymak için, eluatın 10 μL'sini alın, 10 μL ookist spesifik antikorla birleştirin (Bkz. Malzemeler Tablosu)ve hemositometrede floresan ookistleri sayın.
       NOT: İzole ookistler 4 °C'de depolanabilir veya hemen immünoresans veya elektron mikroskobu görüntülemesi için kullanılabilir.

Sonuçlar

Burada sunulan protokoller, mikroenjeksiyon için hazır ookistve sporozoitlerin(Şekil 1A)etkin bir şekilde saflaştırılmasıile sonuçlanır. Ekssestasyon protokolü, ookistlerin yaklaşık %70-80'inden sporozoitlerin salınımına neden olur, bu nedenle kalan ookistlerin ve kabukların 3 μm'lik bir filtreden filtrelesiniz. Filtrasyon neredeyse %100 sporozoit arınma ile sonuçlanır(Şekil 1B). Ayrıca, yeşil boya eklenmesi tüm organoidlerin enjeksiyonu...

Tartışmalar

Bağırsak ve hava yolu organoidlerinde Cryptosporidium parazitkültürü, konak-parazit etkileşimlerini incelemek için doğru bir model sağlar¹⁰ ama aynı zamanda birçok uygulama vardır. Örneğin, genetik olarak modifiye Cryptosporidium parazitlerinin seçilmesi ve yayılması için mevcut yöntemler, in vivo enfeksiyon için gerekli modifikasyonlara sahip parazitlerin izolasyonuna izin vermeyen fareler^19'da geçiş gerektirir. Cryptosporidium

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Basement membrane extract (extracellular matrix)	amsbio	3533-010-02
Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody)	Waterborne, Inc	A400FLR-1X	Final Concentration = Use 2-3 drops/slide
Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads	Waterborne, Inc	IMS400-20
Dynamag 15 rack	Thermofisher Scientific	12301D
Dynamag 2 rack	Thermofisher Scientific	12321D
EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µm	EMD-Millipore	TSTP02500
Fast green dye	SIGMA	F7252-5G
Femtojet 4i Microinjector	Eppendorf	5252000013
Glass capillaries of 1 mm diameter	WPI	TW100F-4
Matrigel (extracellular matrix)	Corning	356237
Microfuge tube 1.5 mL	Eppendorf	T9661-1000EA
Micro-loader tips	Eppendorf	612-7933
Micropipette puller P-97	Shutter instrument	P-97
Normal donkey Serum	Bio-Rad	C06SB
Penstrep	Gibco	15140-122
Sodium hypoclorite (use 5%)	Clorox	50371478
Super stick slides	Waterborne, Inc	S100-3
Swinnex-25 47 mm Polycarbonate filter holder	EMD-Millipore	SX0002500
Taurocholic acid sodium salt hydrate	SIGMA	T4009-5G
Tween-20	Merck	8221840500
Vectashield mounting agent	Vector Labs	H-1000
Vortex Genie 2	Scientific industries, Inc	SI0236
Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)			Final amount
DMEM	Invitrogen	12634-010	500 mL
Penstrep	Gibco	15140-122	5 mL of stock in 500 mL DMEM
Glutamax	Gibco	35050038	5 mL of stock in 500 mL DMEM
Hepes	Gibco	15630056	5 mL of stock in 500 mL DMEM
INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media)			Final concentration
A83-01	Tocris	2939-50mg	0.5 µM
Adv+++			make up to 100 mL
B27	Invitrogen	17504044	1x
EGF	Peprotech	AF-100-15	50 ng/mL
Gastrin	Tocris	3006-1mg	10 nM
NAC	Sigma	A9125-25G	1.25 mM
NIC	Sigma	N0636-100G	10 mM
Noggin CM	In house*		10%
P38 inhibitor (SB202190)	Sigma	S7076-25 mg	10 µM
PGE2	Tocris	2296/10	10 nM
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1	1 mL/500 mL media
RSpoI CM	In house*		20%
Wnt3a CM	In house*		50%
In house* - cell lines will be provided upon request
INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media)			To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME)
LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media)			Final concentration
Adv+++			make up to 100 mL
ALK-I A83-01	Tocris	2939-50mg	500 nM
B27	Invitrogen	17504044	0.0763888889
FGF-10	Peprotech	100-26	100 ng/mL
FGF-7	Peprotech	100-19	25 ng/mL
N-Acetylcysteine	Sigma	A9125-25G	1.25 mM
Nicotinamide	Sigma	N0636-100G	5 mM
Noggin UPE	U-Protein Express	Contact company directly	10%
p38 MAPK-I	Sigma	S7076-25 mg	1 µM
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1	1:500
RhoKI Y-27632	Abmole Bioscience	M1817_100 mg	2.5 µm
Rspo UPE	U-Protein Express	Contact company directly	10%
Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection)			Final concentration
L-Glutathione reduced	Sigma	G4251-10MG	0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM
Betaine	Sigma	61962	0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM
L-Cysteine	Sigma	168149-2.5G	0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM
Linoleic acid	Sigma	L1376-10MG	6.8 μg/mL of OME/OMD /LOM
Taurine	Sigma	T0625-10MG	0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM
Blocking buffer (for immunoflourescence staining)			Final concentration
Donkey/Goat serum	Bio-Rad	C06SB	2%
PBS	Thermo-Fisher	70011044	Make up to 100 mL
Tween 20	Merck	P1379	0.1%
List of Antibodies used
Alexa 568 goat anti-rabbit	Invitrogen	A-11011	Dilution-1:500; RRID: AB_143157
Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo	Waterborne, Inc	A400FLK	Dilution- 1:200
Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive	Waterborne, Inc	IMS400-20	Dilution-1:500
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306	Dilution-1:1,000; RRID : AB_2629482
Phalloidin-Alexa 674	Invitrogen	A22287	Dilution-1:1,000; RRID: AB_2620155
Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O’Connor (co-author).	Upon request	Upon request	Dilution-1:500
Sporo-Glo	Waterborne, Inc	A600FLR-1X	Dilution- 1:200