הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור טכניקת העיכול על הקרום להכנת דגימות עבור ספקטרומטר מסה. טכניקה זו מקלה על ניתוח נוח של אינטראקציות חלבון-חלבון.

Abstract

חלבונים תאיים רבים אינטראקציה פיזית בהתאם לנסיבות תאיים שלהם מסחטות. אכן, פונקציות הסלולר תלוי במידה רבה חלבון תאיים – אינטראקציות חלבון. לכן, המחקר הנוגע לאינטראקציות אלו הוא הכרחי להקלה על הבנת התהליכים הפיזיולוגיים. שיתוף משקעים של חלבונים משויכים, ולאחריו ניתוח ספקטרומטר המסה (MS), מאפשר זיהוי אינטראקציות של חלבונים חדשניים. במחקר זה, סיפקנו את הפרטים של הטכניקה הרומן של immunoprecipitation-נוזלי כרומטוגרפיה (LC)-MS/MS ניתוח בשילוב עם העיכול על הקרום לניתוח של חלבון-אינטראקציות החלבון. טכניקה זו מתאימה לimmunoprecipitants גולמי ויכולה לשפר את התפוקה של ניתוחים פרוטאואריים. מתויג רקומביננטי חלבונים היו זירז באמצעות נוגדנים ספציפיים; בשלב הבא, immunoprecipitants מחק על החלקים הממבראני של הממברנה, שהיו חשופים לאלקיללציה. בעקבות טריסיזציה, משקעי החלבון המשועכלים נותחו באמצעות LC-MS/MS. באמצעות טכניקה זו, הצלחנו לזהות מספר מועמדים משויכים חלבונים. כך, שיטה זו היא נוחה ושימושית לאפיון של החלבון הרומן – אינטראקציות חלבונים.

Introduction

למרות החלבונים לשחק תפקידים מחוקה באורגניזמים חיים, הם מסונתז ללא הרף, מעובד, ומושפל בסביבה תאיים. יתר על כן, חלבונים תאיים לעתים קרובות האינטראקציה פיזית ביולוגית, אשר משפיע על הפונקציה של אחד או שניהם^1,2,3. לדוגמה, הכריכה הישירה של הומוCWC22 החלבון המשויך ל-איקריוטית באמצעות תרגום מסוג 4a3 (eIF4A3) הכרחית להרכבת מתחם הצומת אקסון⁴. בהתאם למצב זה, מוטציה eIF4A3 חסר אהדה עבור CWC22 נכשלת להקל על החדרת הצומת mRNA מונחה מורכבים מורכב של שחבור⁴. לפיכך, המחקר של אינטראקציות חלבונים הוא חיוני להבנה מדויקת של רגולציה הפיזיולוגית כמו גם של פונקציות סלולריות.

ההתקדמות האחרונה בספקטרומטר המסה (MS) הוחלו על הניתוח המקיף של אינטראקציות חלבונים בחלבון. למשל, שיתוף משקעים של חלבונים אנדוגני או אקסוגנבאופן ברור הציג חלבונים מתויגים עם החלבונים המשויכים שלהם, ואחריו ניתוח MS, מאפשר זיהוי של אינטראקציות החלבון הרומן⁵. עם זאת, בקבוק אחד גדול של ניתוח MS/MS הוא התאוששות ירודה מעיכול טריפטי של דגימות חלבון. עבור ניהול ניתוחים פרוטאומית על lysates תא, ב-ג'ל ושיטות עיכול על-ממברנה מועסקים בדרך כלל כדי להכין בדיקות MS/MS. בעבר השוונו הליך העיכול ב-ג'ל עם טכניקת העיכול⁶, והראה כי האחרון היה קשור כיסוי רצף טוב יותר. Pvc difluoride (pvdf) קרום עשוי להיות מתאים למטרה זו, כי היא חזקה מכנית עמידים בפני ריכוזים גבוהים של ממיסים אורגניים^7,8, המתיר העיכול אנזימטי של קיבוע חלבונים בנוכחות 80% acetonitrile⁹. יתר על כן, השתק על קרום יכול לגרום לשינויים שינויים בחלבונים היעד, המוביל שיפורים ביעילות העיכול הטריפטי¹⁰. בהתאם לכך, במאמר זה, תיארנו את השימוש בניתוח immunoprecipitation-LC/MS/MS של אינטראקציות חלבונים באמצעות טכניקת העיכול על הממברנה. שיטה פשוטה זו מקלה על הניתוח הנוח של אינטראקציות חלבונים בחלבון גם במעבדות שאינן מתמחות.

Protocol

1. Immunoprecipitation

הערה: השתמשנו במאגר הליזה שאינו נתרן dodecyl סולפט (SDS) ומשחרלי ציטראט, כפי שמתואר בסעיפים הבאים. עם זאת, השימוש בטכניקה immunoprecipitation חלופית בתוך הבית עשוי להיות גם ישים עבור הכנת דגימות LC-MS/MS.

1. מעבר תאים מתורבתים עם וקטורים קידוד תג אפירופה לבד או חלבון פיוז'ן. עבור רכישת נתונים נציג, העברת J774 תאים (1 x 10⁶) עם וקטורים קידוד חלבון פלורסנט ירוק (gfp) בלבד או gfp-התמזגו Capn6 (calpain-6 גנים) באמצעות ליפוזומים בליקיק.
2. נוגדן ממשלים לחרוזים מגנטיים.
   1. למטרה זו, לערבב אנטי GFP נוגדן (2 μL/התגובה) עם חרוזים מגנטיים (25 μL/תגובה) ב 500 μL של מאגר ציטראט פוספט (24.5 מ"מ חומצה לימון, 51.7 mM dibasic נתרן פוספט; pH 5.0) במבחנה 1.5 mL.
   2. לסובב את התערובת ב 50 סל ד עבור 1 h בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטוף את החרוזים המצוייסים שלוש פעמים עם מאגר פוספט ציטראט המכיל 0.1% פוליוקסלין (20) סורביתן מונאולאורון.
3. לאחר מכן תאים מזוהמים באמצעות מאגר פירוק המתאים. עבור רכישת נתונים נציג, לאחר תאים מזוהמים 30 דקות על הקרח ב 400 μL של מאגר לפירוק (50 mM טריס-HCl; pH 7.5, 120 mM הנאקל, 0.5% פולי (oxye,) octylphenyl אתר) המכיל 40 Μm/L פנילתיל סולולוניל, 50 μg/mL לleupeptin, מתוך. mL aprotinin נין, 200 μm/ליטר נתרן אורטודאנואט, ו 1 מ"מ אתילן (EGTA) בחומצה בדיקה 1.5 mL 24 שעות לאחר הזיהום.
4. נקה את הליפוסט על ידי תפרידו ב 15,000 x g עבור 5 דקות ולאסוף את supernatant.
5. . לנקות את הליפוסט הוסף חרוזים מגנטיים ללא תווית (25 μL/תגובה) במבחנה 1.5 mL-מבחן. שטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 500 μL של מאגר ציטראט פוספט. לאחר הסרת מאגר פוספט ציטראט בשטיפה הסופי, להוסיף את התא למטה על החרוזים המגנטיים. לסובב את התערובת באמצעות מסובבי ב 50 סל ד עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.
6. מניחים את צינור הבדיקה על מעמד מגנטי עבור 5 דקות עבור הפרדה מגנטית, ולאסוף את התא ליפוסט. מומלץ להשתמש במעמד המגנטי המיועד ליצרן.
7. אגד את חלבונים היעד לחרוזים מצוהים. מניחים את החרוזים החיסוני (Ig) G-מעלה על דוכן מגנטי עבור 5 דקות עבור הפרדה מגנטית, למחוק את מאגר ציטראט, ולאחר מכן להוסיף את התא ליפוסט החרוזים המופרדים.
8. לסובב את התערובת ב 50 סל ד עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
9. הפרד בין החלבונים היעד מחלבונים ללא יעד בחינם. לשטוף את החרוזים שלוש פעמים באמצעות 500 μL של מאגר פוספט ציטראט המכיל 0.1% Polyoxyethylene (20) סורביתן monolaurate. לאחר השטיפה הסופית, להוסיף 30 μL של מאגר ציטראט (pH 2 – 3), ו דגירה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי elute היעד חלבונים.
   הערה: אם ההתאוששות מimmunoprecipitation אינה מספיקה, השימוש בתגי אפירופה חלופיים, כגון דגל או שלו, עשוי לשפר את היעילות. אם היעילות של הימנעות אינה מספיקה, השימוש באלואנטים אחרים, כגון פתרון מבוסס SDS, עשוי לשפר את היעילות.

2. העיכול על-ממברנה של חלבונים

הערה: שימוש בחומרים וציוד ללא חלבון הכרחי כדי למנוע זיהום בחלבונים אקגניים. בנוסף, מומלץ כי המפעיל ללבוש מסכה כירורגית וכפפות כדי למנוע זיהום על ידי חלבונים אנושיים.

1. חותכים ממברנות PVDF לתוך 3 מ"מ x 3 מ"מ חתיכות באמצעות מספריים כירורגי כי נמחקו עם מתנול ומיובשים מיד לפני השימוש.
2. הוסף 2 – 5 μL של אתנול על פיסות של קרום PVDF על רדיד אלומיניום נקי.
3. לפני שהם יבשים לחלוטין, להוסיף את הללויה (2 – 5 μL כל אחד, 4 – 6 חתיכות לכל מדגם) על הקרומים PVDF הידרופילי, ולאחר מכן האוויר יבש הקרומים עד משטח הקרום הופך מאט. ניתן לאחסן ממברנות יבשים ב -4 ° c.
4. העבר את כל הקרומים לתוך 1.5 מ"ל צינורות פלסטיק, להוסיף 20 – 30 μL של אתנול כדי להפוך את הקרומים הידרופילי, ולאחר מכן להסיר את האתנול באמצעות פיפטה.
5. לפני הקרום מתייבש לחלוטין, להוסיף 200 μL של dithiothreitol (DTT) מבוססי פתרון התגובה (80 mM NH₄hco₃, 10 מ"מ dtt, ו 20% acetonitrile) ו-דגירה את זה ב 56 ° c עבור 1 h.
6. החלף את פתרון התגובה עם 300 μL של פתרון iodoacetamide (80 mM NH₄hco₃, 55 mm iodoamide, ו 20% acetonitrile), ו דגירה עבור 45 מינימום בטמפרטורת החדר בחושך.
7. רוחצים את הקרומים פעמיים עם 1 מ ל של מים מזוקקים ופעם אחת עם 1 מ ל של 2% acetonitrile על ידי ערבוב מערבולת עבור > 10 s.
8. התמוססות הגברת טריפסין (טבלת חומרים) ישירות בפתרון הריאקציה (30 מ"מ NH₄hco₃ המכיל 70% acetonitrile). הוסף 100 μL של פתרון התגובה המכיל 1 μg של טריפסין (טבלת חומרים) (30 מ"מ NH₄hco₃ המכיל 70% acetonitrile) ו דגירה ב 37 ° צ' לילה.
9. העבר את פתרון התגובה המכיל את מעכל טריטיק לתוך שפופרת נקי 1.5 mL באמצעות פיפטה.
10. הוסף 100 μL של הפתרון לשטוף (70% acetonitrile/1% trifluoroacetic חומצה) כדי קרום ו מודטה אותו ב 60 ° צ' עבור 2 h. לאסוף את הפתרון לשטוף ולערבב אותו עם פתרון התגובה. הוסף עוד 100 μL של הפתרון לשטוף את קרום וsonicate אותו עבור 10 דקות. לאחר מכן לאסוף את הפתרון לשטוף ולערבב עם פתרון התגובה.
11. מכסים את צינור הבדיקה עם פיסת סרט מעבדה ולעשות כמה חורים קטנים עם מחט. יבש את הפתרון באמצעות מרכז ואקום.
12. מפזר את שאריות ב 10 μl של 0.2% חומצה פורמית. לאחר צנטריפוגה (12,000 × g, 3 דקות בטמפרטורת החדר), העבר את הסופרנטנט לתוך שפופרת דגימה.
    הערה: הסירים הם הצעדים הקריטיים בסעיף זה. במהלך העיכול חלבון ממברנה, כביסה של הקרומים המכילים את החלבונים לאחר הפחתת והאללציה עם מים מזוקקים, ואחריו 2% acetonitrile, עבור יותר מ 10 שניות כל אחד, הוא קריטי להסרת הריאגנטים.

3. LC-electrospray יינון (ESI)-ניתוח MS/MS

1. הפעלת כלי ESI-MS/MS (טבלת חומרים) בשילוב עם מערכת מערכות ננו-LC (טבלת חומרים). קישור עמוד מראש (טבלת חומרים) וטור אנליטי (טבלת חומרים).
2. לפני הניתוח, לכייל את ספקטרומטר המסה באמצעות מעכל טריטיק של סרום שור מומס 0.2% פורמית חומצה, המספקת פפטידים סטנדרטיים.
3. ניתוח דגימות באמצעות מצב יון חיובי וטווח מסה של 400 – 1250 m/z; לאחר מכן לרכוש עד 10 ms/ms ספקטרום (100 ms כל אחד) עם טווח המוני של 100-1600 m/z ו מעבר ליניארי של 2% – 80% acetonitrile ו 0.2% פורמית חומצה עבור 80 דקות בקצב הזרימה של 300 nL/min.
4. ניתוח נתוני הפלט באמצעות תוכנה לזיהוי חלבונים (טבלת חומרים) כדי לזהות את המועמדים המשויכים חלבונים. לזיהוי חיובי של חלבון מועמד, יש צורך בזיהוי של רסיס פפטיד באיכות גבוהה אחד לפחות (> 95% אמינות).
5. להשמיט את החלבונים כי הם זירז דומה ב-GFP-ביטוי lysates (העברה של וקטור ביטוי תג GFP לבד) מרשימת חלבונים המועמדים.
   הערה: אם מעט חלבונים מזוהים בניתוח מסד הנתונים, שינוי של תנאי הרכישה MS/MS (g., שינוי הזמן מ 100 ms כל אחד ל 50 ms כל) עשוי להגדיל את מספר החלבונים המזוהים.

תוצאות

באמצעות ההליך הנ ל תיאר, immunoprecipitants נותחו באמצעות LC-MS/MS (איור 1). לאחר החרגה של חלבונים הנגזרים באופן שונה (חלבונים ממינים אחרים IgGs), 17 חלבונים זוהו calpain-6-הקשורים immunoprecipitants (שולחן 1) ו 15 חלבונים זוהו ב gfp הקשורים immunoprecipitants ( טבלה 2). של calpain-6 ו-GFP ?...

Discussion

בעבר תיארנו ניתוח של שינויים חמצוניים של אפוליפופרוטאין B-100 ב תחמוצת בצפיפות נמוכה ליפופרוטאין באמצעות LC-ms/ms לפניו על-ידי טכניקה העיכול הממברנה⁶. במחקר הנוכחי, אנו משולבים טכניקה זו עם immunoprecipitation וזיהה מספר calpain-6-הקשורים חלבונים. טכניקה זו מייצגת שיטה נוחה להקרנה עבור חלבונים ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Wako	014-00386
Citric acid	Wako	030-05525
DiNA	KYA Tech Co.		nanoflow high-performance liquid chromatography
DiNa AI	KYA Tech Co.		nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler
DTT	Nacalai tesque	14112-94
Dynabeads protein G	Thermo Fisher Scientific	10003D
Formic acid	Wako	066-00461
HiQ Sil C18W-3	KYA Tech Co.	E03-100-100	0.10mmID * 100mmL
Iodoacetamide	Wako	095-02151
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000008
Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8)	Clontech	632380
NaCl	Wako	191-01665
NH4HCO3	Wako	018-21742
Nonidet P-40	Sigma	N6507	poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9)
peptide standard	KYA Tech Co.	tBSA-04	tryptic digests of bovine serum albumin
PP vial	KYA Tech Co.	03100S	plastic sample tube
Protease inhibitor cooctail	Sigma	P8465
ProteinPilot software	Sciex	5034057	software for protein identification
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111	trypsin
Sodium orthovanadate	Sigma	S6508
Sodium phosphate dibasic dihydrate	Sigma	71643
TFA	Wako	206-10731
trap column	KYA Tech Co.	A03-05-001	0.5mmID * 1mmL
TripleTOF 5600 system	Sciex	4466015	Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer
Tris	Wako	207-06275
Tween-20	Wako	160-21211