Valutazione delle interazioni tra proteine e proteine utilizzando una tecnica di digestione On-Membrane

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per una tecnica di digestione su membrana per la preparazione di campioni per la spettrometria di massa. Questa tecnica facilita la comoda analisi delle interazioni proteina-proteina.

Abstract

Numerose proteine intracellulari interagiscono fisicamente in conformità con le loro circostanze intracellulari ed extracellulari. Infatti, le funzioni cellulari dipendono in gran parte dalle interazioni intracellulari proteina-proteina. Pertanto, la ricerca su queste interazioni è indispensabile per facilitare la comprensione dei processi fisiologici. La co-precipitazione delle proteine associate, seguita dall'analisi della spettrometria di massa (MS), consente l'identificazione di nuove interazioni proteiche. In questo studio, abbiamo fornito dettagli della nuova tecnica di immunoprecipitazioni-liquid a cromatografia (LC)-MS/MS analisi combinata con la digestione on-membrane per l'analisi delle interazioni proteina-proteina. Questa tecnica è adatta per immunoprecipitanti grezzi e può migliorare la produttività delle analisi proteomiche. Le proteine ricombinanti marcate sono state precipitate usando anticorpi specifici; successivamente, gli immunoprecipitanti ornati su pezzi di membrana difluoruro polivichine sono stati sottoposti a alchilazione riduttiva. Dopo la prova, i residui di proteine digerite sono stati analizzati utilizzando LC-MS/MS. Utilizzando questa tecnica, siamo stati in grado di identificare diverse proteine associate candidate. Pertanto, questo metodo è conveniente e utile per la caratterizzazione di nuove interazioni proteina-proteina.

Introduzione

Anche se le proteine svolgono ruoli di stitutive negli organismi viventi, vengono continuamente sintetizzate, elaborate e degradate nell'ambiente intracellulare. Inoltre, le proteine intracellulari interagiscono frequentemente fisicamente e biochimicamente, il che influisce sulla funzione di uno o entrambi^1,2,3. Ad esempio, il legame diretto dell'omologa proteica associata allo spsome CWC22 con il fattore di avvio della traduzione eucacacale 4A3 (eIF4A3) è necessaria per l'assemblaggio del complesso di giunzione esonista⁴. Coerentemente con questo, un mutante eIF4A3 che manca di affinità per CWC22 non riesce a facilitare lo splicing⁴di mRNA di giunzione esone Pertanto, lo studio delle interazioni proteiche è fondamentale per la comprensione precisa della regolazione fisiologica e delle funzioni cellulari.

Recenti progressi nella spettrometria di massa (MS) sono stati applicati all'analisi completa delle interazioni proteina-proteina. Ad esempio, la co-precipitazione di proteine endogene o proteine esogeneamente introdotte con le proteine associate, seguite dall'analisi della SM, consente l'identificazione di nuove interazioni proteiche⁵. Tuttavia, uno dei principali colli di bottiglia dell'analisi MS/MS è la scarsa ripresa da digerimenti a prova di campioni di proteine. Per condurre analisi proteomiche su lismi cellulari, le tecniche di digestione in gel e on-membrana sono generalmente impiegate per preparare campioni MS/MS. In precedenza abbiamo confrontato una procedura di digestione in gel con una tecnica di digestione su membrana⁶e abbiamo dimostrato che quest'ultima era associata a una migliore copertura della sequenza. La membrana di polivinylidene difluoruro (PVDF) può essere adatta a questo scopo perché è meccanicamente robusta e resistente ad alte concentrazioni di solventi organici^7,8, permettendo la digestione enzimatica di immobilizzati proteine in presenza dell'80% di acetonitrile⁹. Inoltre, l'immobilizzazione su una membrana può indurre cambiamenti conformazionali nelle proteine bersaglio, portando a miglioramenti nell'efficienza della digestione a setto^{10 .} Di conseguenza, in questo articolo, abbiamo descritto l'uso dell'immunoprecipitazioni-LC/MS/MS analisi delle interazioni proteiche utilizzando una tecnica di digestione su membrana. Questo semplice metodo facilita la comoda analisi delle interazioni proteina-proteina anche in laboratori non specialistici.

Protocollo

1. Immunoprecipitazioni

NOTA: Abbiamo usato buffer di lisiesi e elusione di citrati non sodiaio (SDS), come descritto nelle sezioni seguenti. Tuttavia, l'uso di una tecnica alternativa di immunoprecipitazioni interna può essere applicabile anche per la preparazione di campioni LC-MS/MS.

1. Cellule coltivate transfect con vettori che codificano un tag dell'epitopo da solo o una proteina di fusione. Per l'acquisizione di dati rappresentativi, trasferire le celle J774 (1 x 10⁶) con vettori che codificano la proteina fluorescente verde (GFP) da sola o Capn6 gpulso (gene calpain-6) utilizzando liposomi cationici.
2. Anticorpo coniugato alle perline magnetiche.
   1. A tale scopo, mescolare l'anticorpo anti-GFP (2 mL/reazione) con perline magnetiche (25 :L/reazione) in 500 l di tampone di fosfato citrato (24,5 mM di acido citrico, 51,7 mM disidratato di sodio dibasico; pH 5.0) in una provetta da 1,5 mL.
   2. Ruotare la miscela a 50 giri per 1 h a temperatura ambiente. Quindi, lavare le perline coniugate IgG tre volte con tampone di fosfato citrato contenente 0,1% polioxyethylene (20) monolaurate sorbita.
3. Lyse le cellule traste utilizzando un buffer di lisi appropriato. Per l'acquisizione di dati rappresentativi, lisci le cellule trasfette per 30 min sul ghiaccio in 400 - L di tampone di lisi (50 mM Tris-HCl; pH 7,5, 120 mM NaCl, 0,5% poli(oxyethelene) etere di ottilio) contenente 40 fluoruro di molo/L, 50 g/mL leupeptina, 50 g/ mL aprotinina, 200 mol/L orthovanadate di sodio e 1 mM di acido tetracettico di glicole etilene (EGTA) in provetta 1,5 mL 24 ordopo la trasfezione.
4. Cancellare il lisato centrifugando a 15.000 x g per 5 min e raccogliere il supernatante.
5. Preclear il lisato. Aggiungere perline magnetiche non etichettate (25 gradi/reazione) in una provetta da 1,5 ml. Lavare le perline tre volte con 500 gradi l di tampone di fosfato di citrato. Dopo la rimozione del tampone di fosfato di citrato nel lavaggio finale, aggiungere il lisato cellulare sopra le perline magnetiche. Ruotare la miscela utilizzando il rotatore a 50 giri/mper per 30 min a temperatura ambiente.
6. Posizionare la provetta su un supporto magnetico per 5 min per la separazione magnetica, e raccogliere la cella lysate. Si raccomanda l'uso del supporto magnetico designato dal produttore.
7. Legare le proteine bersaglio alle perline coniugate. Posizionare le perline coniugate immunoglobuline (Ig)G su un supporto magnetico per 5 min per la separazione magnetica, eliminare il buffer di citrato, quindi aggiungere il lisato cellulare alle perline separate.
8. Ruotare la miscela a 50 giri per 1 h a temperatura ambiente.
9. Separare le proteine bersaglio dalle proteine non bersaglio libere. Lavare le perline tre volte utilizzando 500 l di tampone di fosfato di citrato contenente 0,1% Polyoxyethylene (20) monolauraterita sorbita. Dopo il lavaggio finale, aggiungere 30 gradi di tampone di citrato (pH 2–3) e incubare per 5 min a temperatura ambiente per eluire le proteine bersaglio.
   NOTA: Se il recupero dall'immunoprecipitazioni è insufficiente, l'uso di tag epitopi alternativi, come FLAG o HIS, può migliorare l'efficienza. Se l'efficienza dell'eluzione è insufficiente, l'uso di altri elusivi, come una soluzione basata su SDS, può migliorare l'efficienza.

2. Digestione delle proteine a membrana

NOTA: L'utilizzo di materiali e attrezzature privi di proteine è necessario per evitare la contaminazione con proteine esogene. Inoltre, si raccomanda all'operatore di indossare una maschera chirurgica e guanti per evitare la contaminazione da proteine umane.

1. Tagliare le membrane PVDF in pezzi da 3 mm x 3 mm utilizzando forbici chirurgiche che sono state asciugate con metanolo e asciugate immediatamente prima dell'uso.
2. Aggiungere 2-5 - L di etanolo sui pezzi di membrana PVDF su un foglio di alluminio pulito.
3. Prima di asciugare completamente, aggiungere l'eluant (2-5 - ciascuno, 4-6 pezzi per campione) sulle membrane idrofili PVDF, quindi asciugare ad aria le membrane fino a quando la superficie della membrana diventa opaca. Le membrane essiccate possono essere conservate a 4 gradi centigradi.
4. Trasferire tutte le membrane in tubi di plastica da 1,5 ml, aggiungere 20-30 l' di etanolo per rendere le membrane idrofile, quindi rimuovere l'etanolo utilizzando una pipetta.
5. Prima che la membrana si asciughi completamente, aggiungere 200 l di soluzione basata su dithiothreitol (DTT) (80 mM NH₄HCO₃, 10 mM DTT e 20% acetonitrile) e incubarla a 56 gradi centigradi per 1 h.
6. Sostituire la soluzione di reazione con 300 luna di soluzione iodoacetamide (80 mM NH₄HCO₃, 55 mM iodoacetamide e 20% acetonitrile) e incubare per 45 min a temperatura ambiente al buio.
7. Lavare le membrane due volte con 1 mL di acqua distillata e una volta con 1 mL del 2% acetonitrile per miscelazione vortice per >10 s.
8. Sciogliere la trippsina MS-grade lyofilizzata (Tabella dei materiali) direttamente nella soluzione di reazione (30 mM NH₄HCO₃ contenente 70% acetonitrile). Aggiungete 100 l della soluzione di reazione contenente 1 g di trippsina (Tavolo deimateriali) (30 mM NH₄HCO₃ contenenti 70% acetonitrile) e incubate a 37 gradi durante la notte.
9. Trasferire la soluzione di reazione contenente i digest a prova in una provetta pulita da 1,5 mL utilizzando una pipetta.
10. Aggiungete alla membrana 100 l di soluzione di lavaggio (70% acetonitrile/1%) e mescolatela a 60 gradi centigradi per 2 h. Raccogliere la soluzione di lavaggio e mescolarla con la soluzione di reazione. Aggiungere altri 100 l di soluzione di lavaggio alla membrana e sonicarlo per 10 min. Quindi raccogliere la soluzione di lavaggio e mescolare con la soluzione di reazione.
11. Coprire la provetta con un pezzo di pellicola da laboratorio e fare un paio di piccoli fori con un ago. Asciugare la soluzione utilizzando un concentratore a vuoto.
12. Sciogliere il residuo in 10 , luna dello 0,2% di acido formico. Dopo la centrifugazione (12.000 g, 3 min a temperatura ambiente), trasferire il super-natante in un tubo campione.
    NOTA: i lavamenti sono i passaggi critici di questa sezione. Durante la digestione delle proteine in membrana, il lavaggio delle membrane contenenti le proteine immobilizzate dopo la riduzione e l'alchilazione con acqua distillata, seguita dal 2% di acetonitrile, per più di 10 secondi ciascuna, è fondamentale per la rimozione dei reagenti.

3. Analisi della ionizzazione di elettrospray LC (ESI)-MS/MS

1. Attivare uno strumento ESI-MS/MS (Tabella dei materiali) accoppiato con un sistema HPLC nano-LC ( Tabella deimateriali). Collegare una precolonna (Tabella dei materiali) e una colonna analitica ( Tabella deimateriali).
2. Prima dell'analisi, calibrare lo spettrometro di massa utilizzando digest tryptici di albumina del siero bovino disciolto in acido formico dello 0,2%, che fornisce peptidi standard.
3. Analizzare i campioni utilizzando la modalità iosone positivo e un intervallo di massa di 400-1.250 m/z; quindi acquisire fino a 10 spettri MS/MS (100 ms ciascuno) con un intervallo di massa di 100-1.600 m/z e un gradiente lineare del 2%-80% acetonitrile e 0,2% di acido formica per 80 min ad una portata di 300 nL/min.
4. Analizzare i dati di output utilizzando un software per l'identificazione delle proteine (Tabella dei materiali) per identificare le proteine associate candidate. Per l'identificazione positiva di una proteina candidata, è necessario il rilevamento di almeno un frammento di peptide ad alta fedeltà (> 95% di fedeltà).
5. Omettere le proteine che sono precipitazioni simili in lisa che esprime GFP (trasfezione del vettore che esprime un tag GFP da solo) dalla lista delle proteine candidate.
   NOTA: se nell'analisi del database vengono identificate poche proteine, la modifica delle condizioni di acquisizione MS/MS (ad esempio, la modifica del tempo da 100 ms ciascuna a 50 ms ciascuna) può aumentare il numero di proteine identificate.

Risultati

Tramite la procedura sopra descritta, gli immunoprecipitanti sono stati analizzati utilizzando LC-MS/MS (Figura 1). Dopo l'esclusione delle proteine di derivazione esogena (proteine di altre specie e IGA), 17 proteine sono state identificate negli immunoprecipitanti associati al calpain-6 (tabella1) e 15 proteine sono state identificate negli immunoprecipitanti associati alla GFP ( Tabella 2). Delle proteine associate al calp...

Discussione

In precedenza abbiamo descritto un'analisi delle modifiche ossidative dell'apolipoproteina B-100 nella lipoproteina a bassa densità ossidata utilizzando LC-MS/MS preceduta da una tecnica di digestione su membrana⁶. Nel presente studio, abbiamo combinato questa tecnica con l'immunoprecipitazioni e abbiamo identificato diverse proteine associate al calpaino 6. Questa nuova tecnica rappresenta un metodo conveniente di screening per le proteine candidate candidate. Calpain-6 è un membro non proteoli...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Wako	014-00386
Citric acid	Wako	030-05525
DiNA	KYA Tech Co.		nanoflow high-performance liquid chromatography
DiNa AI	KYA Tech Co.		nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler
DTT	Nacalai tesque	14112-94
Dynabeads protein G	Thermo Fisher Scientific	10003D
Formic acid	Wako	066-00461
HiQ Sil C18W-3	KYA Tech Co.	E03-100-100	0.10mmID * 100mmL
Iodoacetamide	Wako	095-02151
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000008
Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8)	Clontech	632380
NaCl	Wako	191-01665
NH4HCO3	Wako	018-21742
Nonidet P-40	Sigma	N6507	poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9)
peptide standard	KYA Tech Co.	tBSA-04	tryptic digests of bovine serum albumin
PP vial	KYA Tech Co.	03100S	plastic sample tube
Protease inhibitor cooctail	Sigma	P8465
ProteinPilot software	Sciex	5034057	software for protein identification
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111	trypsin
Sodium orthovanadate	Sigma	S6508
Sodium phosphate dibasic dihydrate	Sigma	71643
TFA	Wako	206-10731
trap column	KYA Tech Co.	A03-05-001	0.5mmID * 1mmL
TripleTOF 5600 system	Sciex	4466015	Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer
Tris	Wako	207-06275
Tween-20	Wako	160-21211