使用膜内消化技术评估蛋白质与蛋白质相互作用

摘要

在这里,我们提出了一个方案,用于制备质谱样本的膜上消化技术。该技术有助于方便分析蛋白质与蛋白质的相互作用。

摘要

许多细胞内蛋白质根据细胞内和细胞外情况进行物理交互。事实上,细胞功能很大程度上依赖于细胞内蛋白质与蛋白质的相互作用。因此,关于这些相互作用的研究对于促进对生理过程的理解是必不可少的。相关蛋白质的共沉淀,然后进行质谱分析(MS),能够识别新的蛋白质相互作用。在这项研究中,我们详细介绍了免疫沉淀-液相色谱(LC)-MS/MS分析与膜内消化相结合,用于蛋白质与蛋白质相互作用的分析。该技术适用于粗免疫沉淀物,可提高蛋白组分析的通量。标记重组蛋白是使用特定抗体沉淀的;其次,在聚氯丁二烯膜片片上被斑点的免疫沉淀物进行还原烷基化。在胰蛋白酶化后,使用LC-MS/MS对消化的蛋白质残留物进行分析。因此,该方法对新型蛋白质与蛋白质相互作用的表征是方便和有用的。

引言

虽然蛋白质在生物体中起着构成作用,但它们在细胞内环境中不断被合成、加工和降解。此外,细胞内蛋白质经常在物理和生物化学上相互作用,这会影响一个或两个1,2,3的功能。例如,将与plissome相关的蛋白同源性CWC22与真核转化启动因子4A3(eIF4A3)直接结合是组装外子结复合^物4所必需的。与此一致,一种对CWC22缺乏亲和力的eIF4A3突变体未能促进外子结复合驱动的mRNA拼接4。因此,蛋白质相互作用的研究对于准确理解生理调节和细胞功能至关重要。

质谱学(MS)的最新进展已应用于蛋白质-蛋白质相互作用的综合分析。例如,内源性蛋白质或外源引入标记蛋白及其相关蛋白的共沉淀,然后进行MS分析,能够识别新的蛋白质相互作用5。然而,MS/MS分析的一个主要瓶颈是蛋白质样品的胰蛋白消化不良恢复。用于对细胞解物进行蛋白体分析,通常采用凝胶内和膜内消化技术来制备MS/MS样品。我们之前将凝胶内消化程序与膜内消化技术6进行了比较,并表明后者与更好的序列覆盖率有关。聚苯乙烯二氟化酶 (PVDF) 膜可能适合于此目的,因为它机械坚固,耐高浓度有机溶剂^7、8,允许固定的酶消化蛋白质在存在80%醋酸酯9。此外,膜上的固定可以诱导目标蛋白的构象变化,导致胰体消化效率的^提高10。因此,在本文中,我们描述了使用膜内消化技术对蛋白质相互作用进行免疫沉淀-LC/MS/MS分析的使用。这种简单的方法便于分析蛋白质-蛋白质相互作用,即使在非专业实验室。

研究方案

1. 免疫沉淀

注:我们使用非硫酸钠(SDS)溶解液缓冲液和柠子酸盐洗脱,如下各节所述。然而,使用替代的内部免疫沉淀技术可能也适用于制备LC-MS/MS样本。

1. 转染培养细胞与载体编码表位标记单独或融合蛋白。为了获得代表性数据,使用载体单独编码绿色荧光蛋白 (GFP)或使用阳离子脂质体处理 GFP 融合 Capn6(calpain-6 基因),传输 J774 细胞(1 x 10 6)。
2. 抗体与磁珠结合。
   1. 为此,在1.5 mL试管中,将抗GFP抗体(2μL/反应)与磁珠(25μL/反应)混合在500μL柠檬酸盐缓冲液(24.5 mM柠檬酸,51.7 mM二基磷酸钠;pH 5.0)中。
   2. 在室温下,以 50 rpm 转速旋转混合物 1 小时。然后,用含有0.1%聚乙烯(20)的磷酸酸盐缓冲液清洗IgG-结合珠三次。
3. 使用适当的莱沙缓冲液对转染细胞进行酶。为了获得代表性数据, 在400 μL裂解液缓冲液(50mM Tris-HCl;pH 7.5,120 mM NaCl,0.5%聚(氧甲苯)八苯醚)中,在冰上裂解30分钟,含有40μmol/L苯基硫磷氟化物,50μg/mL白蛋白,50μgmL 丙氨酸,200 μmol/L 正交钠,和 1 mM 乙二醇四乙酸 (EGTA) 在 1.5 mL 试管转染后 24 小时。
4. 在 15,000 x g处离心 5 分钟,清除裂液,并收集上清液。
5. 预清除乳清。在 1.5 mL 试管中添加未标记的磁珠(25 μL/反应)。用500μL的磷酸酸盐缓冲液清洗珠子三次。在最终洗涤中去除磷酸酸酸酸酸盐缓冲液后,在磁珠上加入细胞解结液。在室温下,在 50 rpm 转速下使用旋转器旋转混合物 30 分钟。
6. 将试管放在磁性支架上 5 分钟进行磁分离,并收集细胞莱沙。建议使用制造商指定的磁架。
7. 将靶蛋白与偶联珠子结合。将免疫球蛋白(Ig)G结合珠放在磁性支架上5分钟进行磁分离,丢弃云酸盐缓冲液,然后将细胞流化液添加到分离的珠子中。
8. 在室温下,以 50 rpm 转速旋转混合物 1 小时。
9. 将靶蛋白与游离的非目标蛋白分离。使用含有0.1%聚乙烯(20)的磷酸酸二酯缓冲液清洗珠子三次。最后洗涤后,加入30μL的青酸盐缓冲液(pH 2⁄3),并在室温下孵育5分钟,使靶蛋白洗净。
   注:如果免疫沉淀恢复不足,使用替代表位标记,如FLAG或HIS,可以提高效率。如果洗脱效率不足,使用其他洗脱剂(如基于 SDS 的解决方案)可以提高效率。

2. 蛋白质膜内消化

注:使用无蛋白材料和设备是避免外源性蛋白质污染所必需的。此外,建议操作者戴上外科口罩和手套,以避免被人类蛋白质污染。

1. 使用手术剪刀将PVDF膜切成3毫米x3毫米片,在使用前用甲醇擦拭并干燥。
2. 在干净的铝箔上的PVDF膜上加入2~5μL乙醇。
3. 在完全干燥之前,将洗脱剂(每个样品2~5 μL,每个样品4~6片)添加到亲水性PVDF膜上,然后对膜进行空气干燥,直到膜表面变得哑光。干燥的膜可以储存在4°C。
4. 将所有膜转移到1.5 mL塑料管中,加入20~30μL乙醇,使膜亲水,然后用移液器去除乙醇。
5. 在膜完全干燥之前,加入200 μL的二硫二硫醇(DTT)基反应溶液(80mM NH₄HCO3,10 mM DTT和20%乙酰乙酰乙烯),并在56°C孵育1小时。
6. 用300 μL的碘乙酰胺溶液(80mM NH₄HCO 3、55 mM碘乙酰胺和20%乙酰乙酰胺)代替反应溶液,在黑暗中室温下孵育45分钟。
7. 用1 mL蒸馏水清洗膜两次,用涡旋混合1mL的2%醋酸酯清洗一次,超过10s。
8. 直接在反应溶液中溶解冻干MS级胰蛋白酶(材料表)(30mM NH₄HCO₃含有70%乙酰乙酰乙酰乙酯)。加入含有1μg胰蛋白酶(材料表)(30mM NH₄HCO₃含有70%醋酸酯)的反应溶液100μL,并在37°C孵育过夜。
9. 使用移液器将含有胰胶消化液的反应溶液转移到干净的 1.5 mL 试管中。
10. 将100μL的洗涤溶液(70%醋酸/1%三氟乙酸)加入膜,在60°C孵育2小时。收集洗涤液并将其与反应溶液混合。在膜中再加入100μL的洗涤溶液,并使其声波10分钟。然后收集洗涤液,并与反应溶液混合。
11. 用一块实验膜盖住试管,用针打几个小孔。使用真空集中器干燥溶液。
12. 将残留物溶解在10μL的0.2%的甲酸中。离心后(12,000 μ g,室温下3分钟),将上清液转移到样品管中。
    注: 分纸条是本节的关键步骤。在膜上蛋白质消化过程中,在还原后清洗含有固定蛋白的膜,然后用蒸馏水进行烷基化,然后用2%的乙酰乙酰乙烷,每次超过10秒,对于去除试剂至关重要。

3. LC_电喷雾电电化 (ESI)-MS/MS 分析

1. 激活 ESI-MS/MS 仪器(材料表)与纳米 LC HPLC 系统 (材料表) 结合。链接预列 (材料表) 和分析列 (材料表) 。
2. 在分析之前,使用溶解在0.2%的基分酸中的牛血清白蛋白的锥体消化剂校准质谱仪,提供标准肽。
3. 使用正子模式和400~1,250 m/z的质量范围分析样品;然后获取多达 10 MS/MS 光谱(每个 100 ms),质量范围为 100~1,600 m/z,线性梯度为 2%-80% 醋酸和 0.2% 的甲酸,流量为 300 nL/min,为 80 分钟。
4. 使用蛋白质识别软件(材料表)分析输出数据,以识别候选相关蛋白质。为了对候选蛋白质进行阳性鉴定,需要检测至少一个高保真肽片段(>95%保真度)。
5. 从候选蛋白质列表中省略在GFP表达的交错中同样沉淀的蛋白质(仅表达GFP标记的载体转染)。
   注:如果在数据库分析中识别的蛋白质很少,MS/MS采集条件的修改(例如,将时间从每个100毫秒更改为50 ms)可能会增加识别的蛋白质数量。

结果

通过上述程序,使用LC-MS/MS(图1)对免疫沉淀物进行了分析。排除外源性蛋白质(来自其他物种和IgG的蛋白质)后,在降钙-6相关免疫沉淀物中识别了17种蛋白质(表1),在GFP相关免疫沉淀物中识别了15种蛋白质(表 2)。在降钙-6和GFP相关蛋白中,有11种在两种免疫沉淀物中被识别(图2)。一旦排除这些和降钙酶-6本身,5种?...

讨论

我们之前已经描述了使用LC-MS/MS在膜上消化^技术6之前,在氧化的低密度脂蛋白中对脂蛋白B-100的氧化修饰的分析。在本研究中,我们将该技术与免疫沉淀相结合,并确定了几种与钙痛-6相关的蛋白质。这种新技术代表了筛选候选相关蛋白质的便捷方法。Calpain-6是钙蛋白酶^家族11的非蛋白解体成员,据报道,它通过其蛋白质-蛋白质^{相互作用12、13}<...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Wako	014-00386
Citric acid	Wako	030-05525
DiNA	KYA Tech Co.		nanoflow high-performance liquid chromatography
DiNa AI	KYA Tech Co.		nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler
DTT	Nacalai tesque	14112-94
Dynabeads protein G	Thermo Fisher Scientific	10003D
Formic acid	Wako	066-00461
HiQ Sil C18W-3	KYA Tech Co.	E03-100-100	0.10mmID * 100mmL
Iodoacetamide	Wako	095-02151
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000008
Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8)	Clontech	632380
NaCl	Wako	191-01665
NH4HCO3	Wako	018-21742
Nonidet P-40	Sigma	N6507	poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9)
peptide standard	KYA Tech Co.	tBSA-04	tryptic digests of bovine serum albumin
PP vial	KYA Tech Co.	03100S	plastic sample tube
Protease inhibitor cooctail	Sigma	P8465
ProteinPilot software	Sciex	5034057	software for protein identification
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111	trypsin
Sodium orthovanadate	Sigma	S6508
Sodium phosphate dibasic dihydrate	Sigma	71643
TFA	Wako	206-10731
trap column	KYA Tech Co.	A03-05-001	0.5mmID * 1mmL
TripleTOF 5600 system	Sciex	4466015	Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer
Tris	Wako	207-06275
Tween-20	Wako	160-21211