המשך הדגירה של האינטראקציה התחרותית בין vibrio פישרי מבודד

Summary

חיידקים לקודד מנגנונים שונים לעוסקים בתחרות הבינחיידקית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על תרבות לאפיון אינטראקציות תחרותיות בין מבודד חיידקי וכיצד הם משפיעים על המבנה המרחבי של אוכלוסיה מעורבת.

Abstract

כתב יד זה מתאר את היסוד המבוסס על תרבות, הדגירה לגילוי ואפיון של אינטראקציות תחרותיות בין שתי אוכלוסיות בקטריאלי. שיטה זו מעסיקה פלמידים יציבים המאפשרים לכל אוכלוסיה להיות מתויג באופן מובהק עם יכולות עמידות לאנטיביוטיקה ברורים וחלבונים פלורסנט לבחירה ואפליה חזותית של כל אוכלוסיה, בהתאמה. כאן, אנו מתארים את ההכנה ואת הדגירה של זנים vibrio פישרי מתחרה, הדמיה מיקרוסקופית פלואורסצנטית, וניתוח נתונים כמותיים. גישה זו פשוטה, התשואות תוצאות מהירות, וניתן להשתמש בה כדי לקבוע אם אוכלוסיה אחת הורגת או מעכבת את התפתחותם של אוכלוסיה אחרת, ואם התחרות מתווכת באמצעות מולקולה מפועלת או מחייבת מגע ישיר לתא הנייד. מכיוון שכל אוכלוסיית חיידקים מבטאת חלבון פלורסנט שונה, האבחנה מאפשרת אפליה מרחבית של אוכלוסיות מתחרות בתוך מושבה מעורבת. למרות השיטות המתוארות מתבצעות עם חיידק סימביוטי V. פישרי באמצעות התנאים אופטימיזציה עבור מין זה, הפרוטוקול יכול להיות מותאם לבודד בקטריאלי ביותר הניתנים לשימוש.

Introduction

כתב יד זה מתאר שיטה מבוססת-תרבות כדי לקבוע אם שני מבודד חיידקי מסוגלים לאינטראקציות תחרותיות. כאשר לומדים אוכלוסיות מעורבות, חשוב להעריך את המידה שבה החיידק מבודד את האינטראקציה, במיוחד אם מבודד מתחרים ישירות באמצעות מנגנוני הפרעה. תחרות ההפרעות מתייחסת לאינטראקציות שבהן אוכלוסיה אחת מעכבת באופן ישיר את הצמיחה או הורגת אוכלוסיית מתחרה¹. אינטראקציות אלה חשובות לזיהוי מכיוון שהן יכולות להיות בעלת השפעה מעמיקה על מבנה הקהילה ותפקודו של מיקרוביאלית^2,3.

מנגנונים לתחרות מיקרוביאלית התגלו באופן נרחב בתוך גנום של חיידקים מסביבות מגוונות, כולל שני מארחים הקשורים וחיידקים חיים חופשיים^{4,5,6,7, 8,9}. מגוון אסטרטגיות תחרות תוארו^10,11 כולל מנגנונים המפזרים, כגון כימיקלים בקטרידקים^1,12 ו מופרש פפטידים מיקרוביאלית¹³ , כמו גם מנגנונים תלויי-קשר המחייבים יצירת קשר עם תא תא להעברת מעכבות אפקטור לתאי יעד^{9,14,15,16,17 ,בן 18}

למרות שcoincubations המבוסס על תרבות משתמשים בדרך כלל במיקרוביולוגיה^5,8,19, כתב היד הזה מתאר כיצד להשתמש באפשרות לאפיין את מנגנון התחרות, כמו גם הצעות להתאמת הפרוטוקול לשימוש עם מינים חיידקיים אחרים. יתרה מזאת, שיטה זו מתארת גישות מרובות לניתוח ולהצגת הנתונים כדי לענות על שאלות שונות אודות אופי האינטראקציות התחרותיות. למרות הטכניקות המתוארות כאן היו בשימוש בעבר כדי לזהות את מנגנון ההרג הבינקטקטריאלי בבסיס התחרות הפנים מסוים בין זנים שיתופי של חיידקים vibrio פישרי מבודדים¹⁹, הם מתאימים מינים חיידקיים רבים, כולל מבודד סביבתי ופתוגנים אנושיים, ויכולים להיות מנוצלים להערכת מנגנונים תחרותיים תלויי-מגע ומפזרים. שלבים בפרוטוקול עשויים לדרוש אופטימיזציה של מינים חיידקיים אחרים. בהינתן כי מערכות מודל יותר מרחיבים את המחקרים שלהם מעבר לשימוש של אורגניזמים איזוגניים לכלול גנוטיפים שונים^10,16,20,21, שיטה זו תהיה משאב חשוב לחוקרים המבקשים להבין כיצד התחרות משפיעה על מערכות מרובות זנים או רב מינים.

Protocol

1. להכין זנים עבור Coincubation

1. לבחור זן התייחסות מתאים שישמש כיעד לתחרות חיידקים במהלך שיטת הדגירה. ראה דיון לגבי שיטות עבודה מומלצות בעת בחירת זן הפניה וכיצד מאמץ ההפניה ישפיע על התוצאות. בפרוטוקול זה, V. פישרי זן ES114 ישמש זן התייחסות.
2. קביעת הבחירה ושיטות ההקרנה ישמשו להבחנה בין הבודדת בקובדגירה
   1. בדרך כלל, זנים שינוי עם פלסטלינה יציבה המכילה גנים שונים עמידות לאנטיביוטיקה (g. kanamycin ' או כלוראמאניול) כדי לבחור עבור כל זן, כמו גם גנים קידוד חלבונים פלורסנט שונים (g. GFP or RFP) עבור ויזואלית מבחין סוגי הזנים בתרבות הcoculture
      הערה: השימוש בפלמידים יציבים נדרש מכיוון שאם המתח מאבד את הפלפמיד בהיעדר הבחירה, אזי מספרי הנבג לא יעריכו כאשר הם מקוונו, ולא יהיו ניתנים לזיהוי חזותי באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית.
   2. תג V. פישרי הזנים הדיפרנציאלי כזה זן אחד מכיל את pVSV102 באמצע, אשר מבטא חלבון פלורסנט ירוק (gfp) והתנגדות לקאנאמיצין אנטיביוטיקה (קן^R), והזן השני מכיל פלpVSV208 בינוני, אשר מבטא חלבון פלורסנט אדום (dsRed) והתנגדות כלורמפאנרול אנטיביוטי (Cm^R)²².
      הערה: בחירות דיפרנציאליות אחרות ניתן להשתמש כדי להבדיל זנים coדגירה. ראה דיון לשיטות נוספות.
   3. כלול את הפקד הבא במהלך המיטוב הראשוני של שיטת הדגירה כדי להבטיח שהבחירה תהיה איתנה. צלחת כל זן כי הוא מתויג באופן הדיפרנציאלי על לוחות אגר המכיל את האנטיביוטיקה שצריך לבחור נגדה (כלומר, זן צלחת 1 על המדיה בוחרת עבור זן 2, ולהיפך).
3. יומיים לפני שיטת הדגירה, פס התייחסות זן pVSV102, התייחסות זן pVSV208, וכל מתחרה מאמץ pVSV208 מ-80 מניות ° c אל ליברות אגר לוחות המכילים את האנטיביוטיקה המתאימה (למשל, 100 μg/mL kanamycin או 2 μg/mL כלוראמאנקול) ומהדגירה לילה ב -24 ° c. בחירה אנטיביוטית נדרשת כדי להבטיח את כל התאים מכילים את הפלאמצע בתחילת הניסוי.
4. יום אחד לפני הצורך, לקטוף ולאסוף לסירוגין ארבע מושבות הפרט לסוג מאמץ (משכפל ביולוגי) על צלחות ליברות אגר טרי עם אנטיביוטיקה המתאימה מודענות לילה ב 24 ° c.
   הערה: שלב זה עשוי לדרוש אופטימיזציה עבור מינים חיידקיים אחרים, ככל שזמני הדגירה ארוך או קצר יותר עשוי להידרש כדי להשיג תאים מספיקים בהתאם לקצב הצמיחה של האורגניזם של הריבית.

2. coדגירה זנים חיידקיים

1. הכנת כל זן חיידקי לדגירה (איור 1a)
   1. באמצעות קיסם סטרילי, לגרד את התאים מן הצלחת אגר (ככל הגודל של גרגר של אורז) ו להשעות מחדש את התאים בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL המכיל 1 מ ל של מרק ליברות. לשבור את הגושים התא על ידי לחיצה עליהם לתוך הצד של הצינור ללטף למעלה ולמטה במרץ.
   2. קאפ את הצינור ואת המערבולת עבור 1-2 s. אם הגושים של התא עדיין גלויים, המשך למערבולת או לפיפטה למעלה ולמטה עד שמדגם הוא אחיד באופן חזותי.
   3. חזור על שלבים 2.1.1-2.1.2 עבור כל הדגימות.
2. למדוד ולהקליט את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר (OD₆₀₀) עבור כל הדגימות. סביר להניח שיהיה צורך לדלל דגימות עד לקיפול של 10 באמצעות ציר ליברות כדי לקבל מדידה מדויקת של OD. הנרמל כל אחת מהדוגמאות לצורך OD₆₀₀. זנים הם מנורמל בדרך כלל כדי OD₆₀₀ ~ 1.0, אשר מיתרגם ~ 10⁶ חיידקים/mL עבור V. פישרי.
   הערה: שלב זה עשוי לדרוש אופטימיזציה עבור מינים חיידקיים שונים כמו צפיפות התא האינוייתי משפיע על תוצאות coincubation בהתאם מנגנון התחרות. ראה דיון למיטוב.
3. זני החלקה (איור 1b, ג)
   1. מערבבים את זן ההפניה ואת זן מתחרה ביחס 1:1 (v/v) על-ידי הוספת 100 mL של כל זן (מנורמל ל-OD 1.0) כדי התווית 1.5 שפופרת צנטריפוגה mL. כפקד, לערבב את זן התייחסות עם גרסה מתויג מבחינה מדומה של עצמו (התייחסות זן pVSV102 + התייחסות זן pVSV208). פקד זה נדרש לניתוח סטטיסטי מאוחר יותר כדי לקבוע אם הנוכחות של זן מתחרה משפיעה על התפתחותם של מאמץ ההפניה. מערבולת התרבות זן מעורב עבור 1-2 s.
      הערה: ייתכן ששלב זה ידרוש אופטימיזציה כאשר יחס ההתחלה יכול להשפיע באופן משמעותי על תוצאות וייתכן שיהיה צורך לכוונן אותם. ראה דיון למיטוב.
   2. חזור על שלב 2.3.1 עבור כל שכפול ביולוגי. לאחר השלמת שלב זה, צריך להיות סך של שמונה מעורב מאמץ צינורות: ארבע משכפל ביולוגי עם התייחסות משולבת מתויג זנים (שליטה), וארבעה משכפל ביולוגי עם התייחסות דיפרנציאלי מתויג וזנים מתחרה ( ניסיוני).
   3. נקודה 10 מ ל של כל שליטה והתערובת הניסיונית על לוחות פטרי המכילים ליברות אגר; כתמי תרבות אלה ישמשו למיקרוסקופיה פלואורסצנטית לאחר הדגירה.
   4. הניחו לכתמים להתייבש לחלוטין על הספסל עד שהנוזל נספג בתוך האגר ומודלים את צלחות פטרי ב -24 ° c עבור 24 שעות. מינימום של 15 h נדרש עבור זנים V. פישרי מתויג עם pVSV102 ו pVSV208 לצמוח צפיפות תא גבוהה מספיק כדי להמחיש gfp ו rfp, בהתאמה, ברמת האוכלוסייה באמצעות מיקרוסקופ מבתר פלואורסצנטית. כאן, אנו משתמשים בדגירה של 24 שעות לדימות מקומות מעורבים.
      הערה: חשוב להשתמש בלוחות שאינם לחים או יבשים מדי. אם הלוחות הם לחים מדי, כתמים coincubation לא נספג לתוך הצלחת אגר; להימנע משימוש בלוחות שנשפכו באותו יום. אם הלוחות יבשים מדי, גלים קטנים או סדקים עשויים להיווצר על פני השטח של אגר, הפיכת כתמי הדגירה לא סדיר בצורה.
   5. השימוש באותם שתלים חיידקיים כמו בשלב 2.3.3, ספוט 10 מ ל של כל שליטה ותערובות ניסיוני לתוך לוחות 24-היטב המכיל 1 מ ל ליברות אגר לכל טוב. כמו בשלב 2.3.3, לוודא אגר ב 24-הצלחות היטב יש את הלחות המתאימה. הניחו לכתמים להתייבש לחלוטין ולדגירה ב -24 ° c עבור 5 h. כתמי תרבות אלה ישמשו לכמת את היחידות היוצרות את המושבה (הדפוס) לכל מאמץ בסוף הניסוי.
      הערה: בארות בודדות מאפשרות השעיה בקטריאלי לצמיחה בבארות נפרדות בשעת סיום הזמן. שלב זה עשוי להתבצע באמצעות חתיכות סינון מרובע סטרילי כגישה חסכונית יותר לשימוש לוחות 24-היטב. כיכר חתיכות סינון סטרילי ניתן להציב על צלחת אגר ו 10 מ ל של כל תערובת ניסיוני ניתן לזהות על המסננים האלה, ולא על לוחות 24-היטב. לאחר הזמן coincubation, המסננים יכולים להיות מועברים לתוך שפופרת צנטריפוגה 1.5 mL ומקום coincubation ניתן להשעות מחדש על ידי vortexing או ליטוף למעלה ולמטה. זמן דגירה 5 h מספיק כדי לזהות הריגה בין חיידקים בין V. פישרי מבודד¹⁹, עם זאת, הזמן הזה coincubation יכול להיות קצר יותר או ארוך יותר עבור מינים אחרים או מנגנונים תחרותיים. עיין בדיון לקבלת פרטים נוספים.
4. דילול סדרתי לצורך התחלת הרשת
   1. כדי לבצע דילול סדרתי של התחלת תערובות coincubation, לסובב 96-טוב צלחת 90 ° כך יש שמונה טורים 12 שורות. כל שורה תכיל מדגם של התערובת הבלתי מדוללת בעמודה הראשונה ואחריו מדלל סדרתי 7 10 מתקפל על פני הבארות הנותרות בשורה (איור 2A).
   2. סמן כל שורה באמצעות מזהה המתח, את מספר השכפול ואת השעה (החל את המקור = T0). סמן את הצלחות ליברות אגר בתוספת אנטיביוטיקה המתאימה לזהות את סדרת הדילול. הקפד לזהות איזה זן כל צלחת אנטיביוטי בחירה עבור.
   3. באמצעות פיפטה רב-ערוצית, הוסיפו 180 מ ל של מרק ליברות לכל באר, והשאירו את הטור הראשון ריק לתערובת הקוונט הבלתי מדוללת.
      הערה: החוקרים יכולים לבחור להשתמש מלוחים באגירה פוספט (PBS) כדי להשהות מחדש כתמים coincubation ולבצע דילול סדרתי אם עובד עם מינים במיוחד בקטריאלי הגוברת או בעקביות ביצוע ניסויים גדולים שבו מדלל סדרתי עשוי לקחת זמן רב לביצוע. שימוש ב-PBS במקרים אלה ימנע צמיחה משמעותית של חיידקים במהלך תהליך של ביצוע מדלל סדרתי. עם זאת, חשוב להיות עקבי באיזה פתרון משתמשים (לדוגמה, PBS או £) בכל הניסויים, ללא קשר לגודלם או למשך הזמן שלהם.
   4. באמצעות 200 mL בערוץ אחד הצינורות, העברה 100 mL של תערובת coincubation מן הצינור אל העמודה הראשונה היטב. מחק את העצה וחזור על כל תערובות coincubation.
   5. שימוש בפיפטה רב-ערוצית, העברת 20 מ ל מטור 1 עד 2 ומערבבים באמצעות ליטוף למעלה ולמטה. מחק את העצות וחזור על כל עמודה כך שבסופו של דבר, כל שורה מכילה דילול טורי בעל עשרה קיפולים של התערובת הראשונית של הדגירה.
      הערה: להיות עקבי עם מספר הפעמים. שדילול בצינורות למעלה ולמטה לדוגמה, לדכא את ידית הפיפטה חמש פעמים עבור כל דילול להיות עקבי לאורך סדרת הדילול.
   6. שימוש בפיפטה רב ערוצי מצויד עם שמונה טיפים, מאלץ 5 מ ל מכל באר בסדרת דילול (כלומר, שורה אחת של שמונה בארות) ולאתר אותו על צלחת אגר ליברות הבוחר עבור זן התייחסות (בתוספת kanamycin). חזור על שלב זה האיתור על הצלחת בחירה עבור זן המתחרה (בתוספת עם כלורמפננול) (איור 2B). לאפשר למקומות להתייבש לגמרי לפני הצבת בחממה.
      הערה: ניתן להשתמש באותם עצות כדי לזהות סדרת דילול שכפול על לוחות בחירה עבור ההפניה והמתח המתחרה, אך יש לשנותה בין שכפול. הימנע לגעת בסופו של עצה הצינורות לצלחות ליברות אגר כמו זה יכול ליצור דיכאון שיכול להידמות מושבה חיידקית ותוצאות הטיה במהלך ספירות צלחות. אם העצה נוגעת בצלחת, רשום הערה ואינך כולל את הדיכאון בספירות המושבה.
5. לקיחת מדידות אחרונות
   1. לאחר כתמי הדגירה של לוחיות הרישוי של 24 לוחות הבאר כבר מודללו עבור 5 h ב -24 ° c, להוסיף 1 מ ל של מרק ליברות כל טוב ולהשעות מחדש את כתמי coincubation על ידי ליטוף למעלה ולמטה עד כל התאים מושעה מחדש. הקפד על עקביות בעוצמה שבה התאים מושעים מחדש על פני כל המשכפלת. לדוגמה, לדכא את ידית הפיפטה שמונה פעמים כדי להשעות מחדש כל דוגמה.
   2. לאחר כל נקודה coincubation מושהה מחדש, להכין צלחת 96-באר עבור דילול סדרתי צלחות ליברות אגר עם אנטיביוטיקה המתאים שבו לזהות את הדילול באותו אופן כמו שלב 2.4.1.
   3. בצע את השלבים 2.4.2-2.4.6 כדי להשלים את הדילול הטורי עבור מדידות הסופי T.
      הערה: שליטה חשובה צריכה להיכלל במהלך האופטימיזציה הראשונית של שיטת הדגירה. בסוף תקופת הדגירה, צלחת זנים מעורבים על מדיה הכוללת גם אנטיביוטיקה. מאמץ לא צריך להיות מסוגל לגדול אלא אם 1) מוטציה ספונטנית מתרחשת, או 2) סמנים לבחירה מוחלפים בין זנים.

3. מדמיין את Coincubations באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

1. תמונה כל מיקום coincubation על ליברות אגר לוחיות פטרי משלבים 2.3.3 ו 2.3.4 באמצעות מיקרוסקופ סטריאו מצויד ירוק ואדום איתור פלואורסצנטית, אשר תואמים את החלבונים הפלואורסצנטית להיות מבוטא על פלמידים יציבים.
2. התחל על-ידי לקיחת תמונות של ספוט coincubation הבקרה (התייחסות זן pVSV102 + הפניה זן pVSV208).
   1. התאימו את ההגדלה כך שהנקודה תהיה ממוקדת.
   2. באמצעות אור עירור המתאים ולסנן כדי להתבונן GFP, להתאים את זמן החשיפה כך רק הזריחה מן הכתם coincubation ניתן לזיהוי וכל זריחה רקע מהתקשורת הוא נמוך או לא גלוי.
   3. שנו את אור העירור והמסנן כדי להתבונן ב-RFP, כוונון זמן החשיפה כדי למזער את הרקע מהמדיום.
3. עבור כל נקודת הדגירה של הטיפולים הניסיוניים, התמונה של זן התייחסות באמצעות מסנן GFP וזמן חשיפה נקבע בשלב 3.2.2.
4. התמונה של זן המתחרה באמצעות מסנן RFP, כוונון זמן החשיפה כך שהקרינה הפלואורסצנטית רק מנקודת הדגירה של הקוקובציה והרקע של המדיום הוא מינימלי. שמור את שתי התמונות ואת שמם כדי לכלול גם את מזהי המתח, את מספר השכפול, את זמן הדגירה כאשר התמונה צולמה (למשל, 24 שעות). חזור על הפעולה עבור כל המשכפלת.
   הערה: הזמן coincubation יכול להיות צריך להיות מותאם עבור פלמידים שונים או מינים חיידקיים. ראה דיון למיטוב.

4. ניתוח נתונים

1. חישוב של CFUs עבור כל שליטה וטיפול ניסיוני בכל זמן (התחלה T סופי)
   1. לאחר שהמושבות נראות לעין על לוחיות הדילול הסדרתיות (למשל, 24 שעות ב -24 ° c עבור V. פישרי), לזהות את גורם הדילול שבו ניתן לספור מושבות בודדות ולא לגדול ביחד לתוך אשכולות גדולים, רב מושבות (איור 2b). עבור כל שכפול, לספור ולתעד את מספר המושבות הבודדות עבור דילול נתון. מספר זה מייצג את ה-CFUs עבור השכפול.
   2. המרת הדפוס לדילול הכולל של כל מאמץ באמצעות הנוסחה להלן:
      * X vol. של המדגם הבלתי מדולל = סה כ הפוס
      דוגמה: T0: [(6 CFUs) ̧ (10 ^-6 x 0.005 mL)] x [0.01 mL] = 1.2 E7 סך כל הדפוס של זן 1 במקום המעורב בתחילת הניסוי
      T5: [(4 CFUs) ̧ (10 ^-3 x 0.005 mL)] x [1.0 mL] = 8.0 הסכום הכולל של מאמץ 1 בנקודה מעורבת לאחר 5 שעות הדגירה
      ערכי CFU לכל מאמץ בכל נקודת זמן הם נתונים גולמיים שניתן להשתמש בהם עבור מספר ניתוחים שונים ובדיקות סטטיסטיות (ראה סעיף 4.2 להלן).
2. בצע את המרות הנתונים הבאים כדי לקבוע אם מתח מתחרה מתחרה במתח ההפניה על-ידי: (i) קביעה אם הפרופורציה של מאמץ ההפניה פוחתת בנוכחות המתח המתחרה, או (ii) חישוב ה לרשום אינדקס תחרותי יחסי (RCI). מנתח אלה להמיר נתונים גולמיים לתוך יחסי והוא יכול להיות שימושי כדי לקבוע את התוצאה התחרותית של אינטראקציה, אבל לא יכול לקבוע את המנגנון של התחרות (כלומר, הריגת לעומת עיכוב הצמיחה).
   1. חישוב הפרופורציה של כל מאמץ לכל נקודת זמן במהלך הדגירה
      1. המרת נתוני CFU לפרופורציה של כל זן בטיפול. עבור זן ההפניה (RS) ב-T0, חלק את ה-CFUs הכולל למתח הייחוס ב-T0 על-ידי סכום הסיכום הכולל של מאמץ ההפניות והמתחרה (CS) ב-T0:
         ר'_T0 (ר'_T0 cfus + הפקולטה למדעי העניינים) = חלק ממתח הייחוס בT0.
         בצע את אותו חישוב כדי לקבוע את שיעור המתח של המתחרה ב-T0:
         הפקולטה למדעי_הT0 (ר'_T0 Cfus + cs_T0 cfus) = חלק ממתח הייחוס בT0
         חזור על תהליך זה עבור כל נקודת זמן ולשכפל עבור שני הטיפול הניסיוני ואת הטיפול בקרת (דיפרנציאלי-מתויג התייחסות להתאמץ החומר הדגירה).
      2. גרף החלק הממוצע של כל סוג זן ב T0 ו T5 בגרף עמודות מוערמות (איור 3A).
      3. ודא שהיחס ההתחלתי הרצוי של זנים התקבל. עבור coincubations איפה זנים היו בתחילה מעורב 1:1, כל סוג זן צריך לכלול ~ 0.5 של האוכלוסייה ב T0 ולא צריך להיות מבחינה סטטיסטית שונה זה מזה באמצעות מבחן t של סטודנט (P > 0.05). אם הפרופורציה של זן אחד היא גדולה באופן משמעותי מזו של המתח השני ב T0, ולאחר מכן חזור על הניסוי עד להשגת יחס התחלתי של 1:1.
      4. קבע אם זן המתחרה כולל חלק גדול משמעותית מהאוכלוסייה לאחר 5 שעות. בצע מבחן t של סטודנט השוואת את הפרופורציה של כל זן בטיפול ניסיוני ב T0 ו T5. אם שיעור של זן מתחרה שונה באופן משמעותי מזה של זן ההתייחסות ב-T5 (P < 0.05), תוצאה זו מרמזת על תחרות המתח ייתכן שהתרחשו. . המשך לשלב 4.2.1.5
      5. כדי לקבוע אם הנוכחות של זן המתחרה הקטינה את הפרופורציה של זן ההתייחסות לאחר 5 שעות, לבצע מבחן t של סטודנט השוואת את הפרופורציה של זן ההפניה בפקד עם הפרופורציה של זן ההפניה ב טיפול ניסיוני (מתח התייחסות v מתחרה זן).
         הערה: אם החלק של מאמץ ההתייחסות הוא מבחינה סטטיסטית נמוכה יותר בטיפול ניסיוני יחסית לפקד (P < 0.05), המתח המתחרה הפחית באופן משמעותי את הפרופורציה של זן ההפניה לאחר 5 h ו התחרו מאמץ הייחוס.
   2. חישוב ערך RCI של יומן הרישום עבור כל טיפול (כולל הפקד)
      הערה: האינדקס התחרותי היחסי, או RCI, הוא ערך בודד המשווה את האופן שבו יחס הסיום של סוגי הזנים שונה מיחס ההתחלה. ערך ה-RCI משתנה ככזה שערך RCI של יומן רישום גדול מאפס מציין שמתח המתחרה (CS) מחוץ למתח ההפניה (RS), ערך RCI של יומן קטן מאפס מציין שמתח ההפניה התחרה במתח המתחרה וביומן הרישום RCI ערך אפס מעיד על כך שלא היתה התחרתה במתח.
      1. חשב ערכי RCI של יומן עבור כל פקד וטיפול ניסיוני באמצעות המשוואה הבאה:
         יומן רישום [(CS_T5 cfu ̧ rs_T5 cfu) ̧ (cs_T0 cfu ̧ rs_T0 cfu)] = התחבר rci
      2. ערכי ה-RCI של הגרף משתמשים בתיבה מופרדת & מגרש שפפם שבו נתונים מרוגרפים בכיוון האופקי (איור 3B).
      3. קבע אם כל טיפול היה שונה באופן משמעותי מאפס על-ידי ביצוע מבחן t של סטודנט המשווה בין ערכי RCI של היומן בכל טיפול (כולל הפקד) לערכת נתונים המשווה את אותו מספר של שכפול בערך אפס. אם ערכי RCI היומן עבור הטיפול הניסיוני הם מבחינה סטטיסטית גדול יותר מאפס (P < 0.05), אז המתח המתחרה החוצה את המתח ההפניה.
         הערה: הפקד לא צריך להיות מבחינה סטטיסטית שונה מאפס (P > 0.05), כי מתויג התייחסות באופן הדיפרנציאלי הם איזוגניים.
      4. בצע מבחן t של סטודנט כדי לקבוע אם ערכי הרישום של RCI עבור הטיפול הניסיוני היו גדולים באופן משמעותי מהפקד (P < 0.05). אם ערכי ה-RCI של היומן מהטיפול הניסיוני הם גדולים מבחינה סטטיסטית מטיפול הבקרה, המתח המתחרה החוצה את המתח ההפניה.
3. בצע את הניתוח הסטטיסטי הבא כדי לקבוע את המנגנון שבו המתח מתחרה מתחרה את זן ההפניה: (אני) לנתח נתונים גולמיים CFU הכולל, או (ii) לבחון אחוז התאוששות של זן התייחסות. מנתח אלה יכול להיות מסורבל יותר כדי להציג ביחס לאלה משלב 4.2, אבל יזהה אם מתחרה מאמץ להערים על זן ההפניה על-ידי הגדלת אותו, עיכוב התייחסות מאמץ גדילה, או באופן פעיל ביטול זן ההפניה.
   1. ניתוח נתוני CFU כולל גולמיים
      1. גרף raw הכולל נתוני CFU עבור שני הזנים באמצעות מגרש פיזור משולב, כאשר משכפל מוצגים כנקודות נתונים בודדות (איור 4A). הצגת נתונים בקנה מידה של יומן רישום והוספת קו אופקי המציין את T0 CFUs הממוצע עבור שני הזנים.
      2. כדי לקבוע אם הנוכחות של זן המתחרה השפיע לרעה על מאמץ ההפניה, בצע בדיקה t של סטודנט השוואת מאמץ התייחסות CFUs עבור הבקרה וטיפולים ניסיוניים ב T5. אם מאמץ ההתייחסות CFUs בטיפול ניסיוני הם נמוך מבחינה סטטיסטית מאשר בפקד (P < 0.05), אז הנוכחות של זן המתחרה השפיעו באופן משמעותי את המתח ההפניה.
      3. כדי לקבוע אם הנוכחות של זן המתחרה או עכבות את הצמיחה של או ביטלה את המתח ההפניה, לבצע מבחן t של סטודנט השוואת זן ההפניה CFUs ב T0 ו T5 עבור השליטה והניסוי טיפולים.
         הערה: בהעדר מתחרה, זן ההתייחסות צריך להראות עלייה משמעותית ב-CFU בעת השוואת T0 ו-T5 לטיפול בבקרה. כאשר לנתח את הטיפול הניסיוני, אם ההתייחסות למתח CFUs ב T5 הם לא שונים מבחינה סטטיסטית לעומת T0 (P > 0.05), אז זן המתחרה עכבות את הצמיחה של זן ההתייחסות. אם התייחסות זן T5 CFUs נמוך באופן משמעותי מ T0 CFUs (P < 0.05), אז המתח המתחרה הרג את זן ההפניה.
   2. חישוב אחוז שחזור של זן ההפניה
      1. הפוך נתוני CFU כולל עבור זן ההפניה (RS) לנתוני שחזור אחוזים באמצעות המשוואה להלן:
      2. (RS_T5 cfus ̧ RS_T0 cfus) x 100 =% שחזור של זן ייחוס
      3. הצג את אחוז השחזור של זן ייחוס באמצעות גרף עמודות מופרד שבו כל סרגל מייצג את הפקד או הטיפול הניסיוני (איור 4B). הוסף קו מקווקו ב-y = 100 כדי לציין 100% שחזור של זן התייחסות (אין להגדיל או להקטין את המתח ההפניה CFUs מ-0 h עד 5 h).
      4. כדי לקבוע אם זן המתחרה השפיע באופן שלילי על מאמץ ההפניה, בצע בדיקה t של סטודנט השוואת מאמץ התייחסות אחוז שחזור לטיפול בבקרה לטיפול ניסיוני. אם אחוז השחזור הוא קטן באופן משמעותי מהפקד (P < 0.05), המתח המתחרה השפיע לרעה על זן ההפניה.
      5. כדי לזהות אם זן המתחרה עכבות את התפתחותם של או ביטלה את מאמץ ההפניה, בצע מבחן t של סטודנט השוואת התייחסות מאמץ שחזור לטיפול ניסיוני וערכת נתונים עם מספר זהה של הכפלת כל עם ערך של 100.
         הערה: אם הטיפול הניסיוני הוא לא שונה מבחינה סטטיסטית מ 100 (P > 0.05), אז זן המתחרה עכבות את הצמיחה של מאמץ ההתייחסות. אם זן ההתייחסות אחוז שחזור בטיפול ניסיוני הוא נמוך באופן משמעותי מ 100 (P < 0.05), אז המתח המתחרה הרג את זן ההפניה.
   3. פענוח תמונות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית
      1. לאחר תמונות מיקרוסקופ הזריחה נלקחים, לקבוע אם כל זן הוא בעליל לזיהוי בנקודה coincubation. עבור בקרת coincubation (התייחסות זן pVSV102 + התייחסות זן pVSV208), הן GFP ו-RFP צריך להיות גלוי מנקודה coincubation אחת. אם זה לא המקרה, להגדיר את הניסוי שוב להבטיח זנים מתויגים כראוי coדגירה על לוחות ללא אנטיביוטיקה.
      2. עבור כל נקודת הדגירה הניסיונית, בדוק אם יש תוצאות אפשריות.
         הערה: אם זן המתחרה גלוי, אך זן ההפניה אינו מזוהה, המרמז שהמתחרה נהרג או עכבות את התפתחותם של מאמץ ההפניה. אם שני הזנים הם נוכחים אחיד מעורב (GFP ו RFP הנוכחי לאורך הנקודה coincubation), הנתונים האלה מצביעים על זן מתחרה לא להתחרות עם זן התייחסות ושני זנים יחד. אם שני הזנים הם נוכחים אבל הם מופרדים באופן מידי (מיקרומושבות של או GFP או RFP נמצאים לאורך הנקודה coincubation), כי מציע זן ההתייחסות זן מתחרה עשוי להיות מרתק אינטראקציות תחרותי ושינויים מאמץ ההפניה או יחס הקוגנציה הראשונית עשוי להידרש. עיין בדיון לקבלת פרטים נוספים.

5. קביעה אם קשר גומלין תלוי במגע

הערה: אם אתה מגלה כי מאמץ אחד הורג או מעכב את מאמץ ההפניה, האינטראקציה עלולה להיות מאוד הדדית או תלוית קשר. כדי לקבוע אם האינטראקציה תלויה בקשר בין תאי תא, בצע שיטת דגירה כמתואר לעיל עבור שלבים 1-2 עם השינויים הבאים.

1. בצע את שלבים 1.1-2.2.
2. לאחר זנים הם מנורמלת, זנים נפרדים פיזית באמצעות מסנן ניטרוצלולוזה עם גודל 0.22 מילימטר הנקבוביות. זה גודל נקבובית מאפשר דיפוזיה של antimicrobials ומולקולות קטנות אבל מונע מגע פיזי בין התאים V. פישרי .
   הערה: אם האינטראקציה תלויה במגע תא תא, הפרדה של זן ההפניה מתוך מאמץ מתחרה עם המסנן צריך לחסל את ההרג או העכבות להתאמץ ומאמץ ההתייחסות לא צריך להפחית את CFUs. אם האינטראקציה אינה תלויה במגע תא תא, והיא מנגנון מאוד מונע, הפרדת הזנים לא צריכה למנוע את המתח המתחרה מלהרוג את מאמץ ההפניה.
   1. ספוט 5 מ ל של מתח ההתייחסות על מרכז מסנן וספוט 5 מ ל של מתח מתחרה על המרכז של מסנן אחר. מניחים את המסנן המכיל את המתח ההפניה על פני השטח של צלחת ליברות אגר. הצב את המסנן המכיל את זן המתחרה ישירות מעל המסנן עם המתח ההפניה.
      הערה: כל זן הוא הבחין על מסננים במקום הזן התחתון הבחין ישירות על הצלחת אגר כך זנים יכולים להיות בקלות רבה יותר ממוקם ישירות על גבי זה.
   2. אם יש חשש כי זנים אינם מוערמים ישירות על גבי זה, להקטין את עוצמת הקול של מאמץ התייחסות הבחין על המסנן. פעולה זו תבטיח את האזור של נקודת המתח ההפניה הוא קטן יותר ובאופן מלא מעל או מתחת למתח המתחרה. חלופה אשר המתח הוא על גבי ובתחתית כדי להסביר את ההבדלים בדיפוזיה של חומרים מזינים ממדיום אגר.
   3. כדי להבטיח את המסנן מאפשר דיפוזיה של מולקולות קטנות, כוללים טיפול בקרה שבו זן ההתייחסות הוא הבחין על מסנן ואנטיביוטיקה כי הוא רגיש (כלוראמננול) הוא הבחין על השני. מחסנית את המסננים ישירות אחד על השני ומניחים על צלחת ליברות אגר. אנטיביוטיקה צריך להיות מסוגל לפזר דרך המסנן וצריך להרוג את זן ההתייחסות.
3. מודאת הצלחות עם מסננים ב 24 ° c עבור 5 h. אל להפוך את הצלחת אגר כאשר הדגירה כדי למנוע הזזת המסננים.
4. בצעו דילול סדרתי לצורך ההתחלה בהתאם לשלב 2.4.
5. לקיחת מדידות אחרונות
   1. שימוש בפינצטה סטרילית, העברת כל סט של מסננים לצינורית הבז 50 mL המכילה 5 מ ל של מרק ליברות. ודא כי המסננים מופרדים פיזית בתוך הצינור כדי לאפשר השעיה מלאה של כל סוג מאמץ.
   2. השהה מחדש את זני מסננים על ידי ליטוף למעלה ולמטה עד המסננים ברורים של כל התאים. השתמש בפינצטה כדי לסובב את המסננים ולנקות את חומר התאים משני הצדדים. לעקר מלקחיים עם. אתנול בין דגימות
   3. בצע דילול סדרתי עבור הסופי T לפי שלב 2.5. בעת חישוב CFUs הכולל עבור T סופי, להתאים את "הנפח הכולל של מדגם לא מדולל" מ-1 מ ל ל 5 mL.

תוצאות

על מנת להעריך את האינטראקציות התחרותיות בין אוכלוסיות בקטריאליות, פרוטוקול שיטת הדגירה פותח וממוטב עבור V. פישרי. שיטה זו משתמשת פלמידים יציבים לקודד גנים עמידות לאנטיביוטיקה וחלבונים פלורסנט, המאפשר בחירה דיפרנציאלית ואפליה חזותית של כל זן. על-ידי ניתוח הנתונים שנ...

Discussion

שיטת הדגירה שתוארה לעיל מספקת שיטה רבת-עוצמה לגילוי תחרות בין-חיידקית. גישה זו אפשרה לזיהוי של התחרות התוך ספציפי בין V. פישרי מבודד ואפיון של מנגנון תחרותי¹⁹. למרות השיטה שתוארה היה אופטימיזציה עבור החיידק הימי V. פישרי, זה יכול להיות שונה בקלות כדי להכיל מינים חיידקי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fisher	05-408-129
10 μL multichannel pipette
100 μL multichannel pipette
300 μL multichannel pipette
10 μL single channel pipette
20 μL single channel pipette
200 μL single channel pipette
1,000 μL single channel pipette
24-well plates	Fisher	07-200-84	sterile with lid
96-well plates	VWR	10062-900	sterile with lid
Calculator
Chloramphenicol	Sigma	C0378	stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg/mL LBS)
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software
Forceps	Fisher	08-880
Kanamycin Sulfate	Fisher	BP906-5	stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS)
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS)	Fisher	SA1J788H5	0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100)
Petri plates	Fisher	FB0875713	sterile with lid
Spectrophotometer
Semi-micro cuvettes	VWR	97000-586
TipOne 0.1-10 μL starter system	USA Scientific	1111-3500	10 racks
TipOne 200 μL starter system	USA Scientific	1111-500	10 racks
TipOne 1000 μL starter system	USA Scientific	1111-2520	10 racks
Vortex
Name	Company	Catalog Number	Comments
LBS media
1 M Tris Buffer (pH ~7.5)			50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)
Agar Technical	Fisher	DF0812-17-9	15 g (Add only for plates)
DI water			950 mL
Sodium Chloride	Fisher	S640-3	20 g
Tryptone	Fisher	BP97265	10 g
Yeast Extract	Fisher	BP9727-2	5 g