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Resumo

As bactérias codificam mecanismos diversos para acoplar na competição interbacteriana. Aqui, apresentamos um protocolo baseado na cultura para caracterizar interações competitivas entre isolados bacterianos e como eles impactam a estrutura espacial de uma população mista.

Resumo

Este manuscrito descreve um ensaio de coincubação à base de cultura para detectar e caracterizar interações competitivas entre duas populações bacterianas. Este método emprega plasmíos estáveis que permitem que cada população seja diferencialmente marcada com capacidades de resistência a antibióticos distintas e proteínas fluorescentes para seleção e discriminação visual de cada população, respectivamente. Aqui, nós descrevemos a preparação e a coincubação de tensões competindo do fischeri do Vibrio , a imagem latente da microscopia de fluorescência, e a análise quantitativa dos dados. Essa abordagem é simples, produz resultados rápidos e pode ser usada para determinar se uma população mata ou inibe o crescimento de outra população, e se a competição é mediada por uma molécula diffusible ou requer contato direto com células celulares. Como cada população bacteriana expressa uma proteína fluorescente diferente, o ensaio permite a discriminação espacial de populações concorrentes dentro de uma colônia mista. Embora os métodos descritos sejam realizados com a bactéria simbiótica V. fischeri utilizando condições otimizadas para esta espécie, o protocolo pode ser adaptado para a maioria dos isolados bacterianos culturáveis.

Introdução

Este manuscrito descreve um método baseado em cultura para determinar se dois isolados bacterianos são capazes de interações competitivas. Ao estudar populações mistas, é importante avaliar em que medida os isolados bacterianos interagem, particularmente se os isolados estão competindo diretamente através de mecanismos de interferência. A competição de interferência refere-se a interações em que uma população inibe diretamente o crescimento ou mata uma população concorrente1. Essas interações são importantes para se identificar, pois podem ter efeitos profundos sobre a estrutura e a função de uma comunidade microbiana2,3.

Os mecanismos para a competição microbiana foram descobertos extensamente nos genomas das bactérias dos ambientes diversos que incluem bactérias host-associadas e Free-Living4,5,6,7, 8,9. Uma variedade de estratégias da competição foi descrita10,11 que incluem mecanismos diffusible, tais como produtos químicos bactericida1,12 e peptídeos antimicrobianos secretado13 , bem como mecanismos dependentes de contato que necessitam de contato celular para transferir um efetor inibitório para as células-alvo9,14,15,16,17 ,18.

Embora as coincubações baseadas na cultura sejam comumente usadas na microbiologia5,8,19, este manuscrito descreve como usar o ensaio para caracterizar o mecanismo de competição, bem como sugestões para adaptar o protocolo para uso com outras espécies bacterianas. Além disso, este método descreve múltiplas abordagens para analisar e apresentar os dados para responder a diferentes questões sobre a natureza das interações competitivas. Embora as técnicas descritas aqui fossem usadas previamente para identificar o mecanismo interbacteriano da matança que subjacente a competição intraespecífica entre tensões simbiótica de bactérias coisolated do fischeri do Vibrio 19, são apropriadas para muitas espécies bacterianas que incluem isolados ambientais e micróbios patogénicos humanos, e podem ser utilizadas para avaliar mecanismos competitivos Contact-dependent e diffusible. As etapas no protocolo podem exigir otimização para outras espécies bacterianas. Dado que mais sistemas modelo estão expandindo seus estudos além do uso de organismos isogênicos para incluir diferentes genótipos10,16,20,21, este método será um recurso valioso para os investigadores que procuram compreender como a concorrência Impacta os sistemas multiestirpe ou multiespécies.

Protocolo

1. Prepare cepas para coincubação

  1. Escolha uma cepa de referência apropriada que servirá como alvo para a competição bacteriana durante o ensaio de coincubação. Consulte a discussão sobre as melhores práticas ao selecionar uma deformação de referência e como a deformação de referência impactará os resultados. Neste protocolo, V. fischeri Strain ES114 servirá como a cepa de referência.
  2. Determinar quais métodos de seleção e triagem serão usados para distinguir entre os isolados em coincubação
    1. Tipicamente, as cepas de transformação com plasmídos estáveis contendo diferentes genes de resistência a antibióticos (por exemplo, canamicina ou cloranfenicol) para selecionar para cada cepa, bem como os genes que codificam diferentes proteínas fluorescentes (por exemplo, GFP ou RFP) para visualmente diferenciando tipos de estirpe na cocultura.
      Nota: O uso de plasmídeo estáveis é necessário, pois se uma cepa perde o plasmídico na ausência de seleção, então os números desta cepa serão subestimados quando quantificados, e não serão visualmente detectáveis usando microscopia de fluorescência.
    2. Tag coincubado cepas V. fischeri diferencialmente de tal forma que uma cepa contém o plasmídeo pVSV102, que expressa uma proteína verde fluorescente (GFP) e resistência ao antibiótico canamicina (KanR), e a segunda estirpe contém plasmídeo pVSV208, que expressa uma proteína vermelha fluorescente (dsRed) e resistência ao antibiótico cloranfenicol (cmR)22.
      Nota: Outras seleções diferenciais podem ser usadas para distinguir cepas coincubantes. Consulte discussão para obter métodos adicionais.
    3. Inclua o seguinte controle durante a otimização inicial do ensaio de coincubação para garantir que a seleção seja robusta. Placa de cada cepa que é diferencialmente marcada em placas de agar contendo o antibiótico que deve selecionar contra ele (ou seja, tensão de placa 1 na mídia que seleciona para a tensão 2, e vice-versa).
  3. Dois dias antes do ensaio de coincubação, estirpe de referência pVSV102, estirpe de referência pVSV208 e cada estirpe concorrente pVSV208 de-80 ° c em placas de agar LBS contendo o antibiótico adequado (por exemplo, 100 μg/mL de canamicina ou 2 μg/mL cloranfenicol) e incubar durante a noite a 24 ° c. A seleção de antibióticos é necessária para garantir que todas as células contenham o plasmídeo no início do experimento.
  4. Um dia antes do ensaio, escolha e restreak quatro colônias individuais por tipo de deformação (repetições biológicas) em placas de agar libras frescas com antibiótico adequado e incubadas durante a noite a 24 ° c.
    Nota: Esta etapa pode exigir a optimização para outras espécies bacterianas, porque uns tempos mais longos ou mais curtos da incubação podem ser exigidos para obter pilhas suficientes dependendo da taxa de crescimento do organismo do interesse.

2. coincubar cepas bacterianas

  1. Preparação de cada cepa bacteriana para incubação (Figura 1a)
    1. Usando um palito de dente estéril, raspar as células da placa de agar (tanto quanto o tamanho de um grão de arroz) e re-suspender as células em um tubo de microcentrífuga 1,5 mL contendo 1 mL de caldo LBS. Quebre os aglomerantes de células pressionando-os para o lado do tubo e pipetando para cima e para baixo vigorosamente.
    2. Tampe o tubo e o Vortex para 1-2 s. Se os grupos de células ainda estiverem visíveis, continue a vórtice ou pipeta para cima e para baixo até que a amostra seja visualmente uniforme.
    3. Repita os passos 2.1.1-2.1.2 para todas as amostras.
  2. Medir e gravar a densidade óptica em 600 nm (OD600) para todas as amostras. As amostras provavelmente precisarão ser diluídas até dez vezes usando o caldo LBS para obter uma medição de OD precisa. Normalize cada amostra para o OD desejado600. As cepas são tipicamente normalizadas para um OD600 ~ 1,0, que se traduz em ~ 106 bactérias/ml para V. fischeri.
    Nota: Esta etapa pode exigir otimização para diferentes espécies bacterianas, pois a densidade de células de ininoculantes Impacta os resultados da coincubação, dependendo do mecanismo de competição. Veja a discussão para otimização.
  3. Estirpes Coincubantes (Figura 1b, C)
    1. Misture a cepa de referência e a cepa concorrente em uma proporção de 1:1 (v/v) adicionando 100 mL de cada cepa (normalizada a OD 1,0) a um tubo de centrífuga de 1,5 mL rotulado. Como controle, misture a cepa de referência com uma versão diferencialmente marcada de si mesma (deformação de referência pVSV102 + deformação de referência pVSV208). Esse controle é necessário para posterior análise estatística para determinar se a presença de uma cepa concorrente impacta o crescimento da cepa de referência. Vórtice da cultura de estirpe mista para 1-2 s.
      Nota: Esta etapa pode exigir a otimização, pois a razão inicial pode afetar significativamente os resultados e pode precisar ser ajustada. Veja a discussão para otimização.
    2. Repita o passo 2.3.1 para cada repetição biológica. Após completar esta etapa, deve haver um total de oito tubos de deformação mista: quatro repetições biológicas com cepas de referência diferencialmente marcadas (controle) e quatro repetições biológicas com referência diferencialmente marcada e cepas concorrentes ( experimental).
    3. Spot 10 mL de cada controle e mistura experimental para placas de Petri contendo Agar LBS; Estes pontos da cultura serão usados para a microscopia de fluorescência após a incubação.
    4. Deixe os pontos secar completamente no banco até que todo o líquido tenha sido absorvido no agar e incubar as placas de Petri a 24 ° c por 24 h. Um mínimo de 15 h é necessário para cepas de V. fischeri marcadas com PVSV102 e pVSV208 para crescer para uma densidade de células suficientemente alta para visualizar GFP e RFP, respectivamente, no nível da população usando um microscópio de dissecação de fluorescência. Aqui, usamos uma incubação de 24 h para pontos de imagem misturados.
      Nota: É importante usar as placas que não são demasiado húmidas ou demasiado secas. Se as placas estiverem demasiado húmidas, os pontos de coincubação não serão absorvidos na placa de agar; Evite usar as placas derramadas no mesmo dia. Se as placas estiverem muito secas, pequenas ondas ou rachaduras podem se formar na superfície do ágar, tornando os pontos de coincubação irregulares em forma.
    5. Usando as mesmas suspensões bacterianas como na etapa 2.3.3, Spot 10 mL de cada controle e misturas experimentais em 24-bem placas contendo 1 mL de LBS Agar por poço. Como na etapa 2.3.3, assegure-se de que o ágar em 24 placas do poço tenha a umidade apropriada. Deixe as manchas secar completamente e incubar a 24 ° c por 5 h. Esses pontos de cultura serão utilizados para quantificar as unidades formadoras de colônias (CFUs) para cada cepa no final do experimento.
      Nota: A detecção de suspensões bacterianas para o crescimento em poços individuais permite a reressuscita mais fácil no ponto de tempo final. Esta etapa pode ser conseguida usando as partes estéreis quadradas do filtro como uma aproximação mais econômica a usar 24 placas do poço. As partes quadradas estéreis do filtro podem ser coloc em uma placa do agar e 10 mL de cada mistura experimental podem ser manchadas nestes filtros, um pouco do que em 24 placas do poço. Após o tempo de coincubação, os filtros podem ser transferidos para um tubo de centrifugação de 1,5 mL e o ponto de coincubação pode ser ressuspenso por vortexing ou pipetagem para cima e para baixo. Um tempo de incubação de 5 h é suficiente para detectar a matança interbacteriana entre os isolados de V. fischeri 19, no entanto, esse tempo de coincubação pode precisar ser mais curto ou mais longo para outras espécies ou mecanismos competitivos. Consulte a discussão para obter mais detalhes.
  4. Diluição em série para o início do inum
    1. Para executar uma diluição em série de misturas de coincubação de partida, gire uma placa 96-well 90 ° assim que há oito colunas e doze fileiras. Cada linha conterá uma amostra da mistura não diluída na primeira coluna seguida de diluições seriadas de 7 10 vezes nos poços restantes da linha (Figura 2a).
    2. Rotule cada linha com o ID de deformação, o número replicada e a hora (invacinação inicial = T0). Rotule as placas de agar LBS suplementadas com o antibiótico apropriado para detectar a série de diluição. Certifique-se de identificar qual cepa cada placa antibiótica está selecionando para.
    3. Usando uma pipeta multicanal, adicione 180 mL de caldo LBS a cada poço, deixando a primeira coluna vazia para a mistura de coincubação não diluída.
      Nota: Os pesquisadores podem optar por usar soro tamponado de fosfato (PBS) para ressuscitam manchas de coincubação e executar a diluição em série se trabalhar com uma espécie bacteriana particularmente rápido crescimento ou consistentemente realizando grandes experimentos onde diluições seriais podem tomar um longo tempo para executar. Usando PBS nestes casos impedirá o conseqüência significativo das bactérias durante o processo de executar diluições de série. No entanto, é importante ser consistente com qual solução é usada (por exemplo, PBS ou LBS) em todos os experimentos, independentemente de seu tamanho ou duração.
    4. Utilizando uma pipeta de canal único de 200 mL, transfira 100 mL da mistura de coincubação do tubo para a primeira coluna bem. Descarte a ponta e repita para todas as misturas de coincubação.
    5. Usando uma pipeta multicanal, transfira 20 mL da coluna 1 para a 2 e misture pipetando para cima e para baixo. Descarte as pontas e repita para cada coluna de modo que, no final, cada linha contenha uma diluição em série de dez vezes da mistura inicial de coincubação.
      Nota: Seja consistente com o número de vezes que as diluições são pipetadas para cima e para baixo. Por exemplo, pressione a alça da pipeta cinco vezes para que cada diluição seja consistente em toda a série de diluição.
    6. Usando uma pipeta multicanal equipada com oito pontas, aspirar 5 mL de cada poço em uma série de diluição (ou seja, uma fileira de oito poços) e Spot-lo na placa de agar LBS que seleciona para a cepa de referência (suplementado com canamicina). Repita este passo para a seleção da placa para a estirpe concorrente (suplementada com cloranfenicol) (Figura 2b). Deixe as manchas secar completamente antes de colocar na incubadora.
      Nota: As mesmas pontas podem ser usadas para manchar uma série da diluição da repetição nas placas que selecionam para a referência e a tensão do concorrente, mas devem ser mudadas entre repetições. Evite tocar no final da ponta da pipeta para as placas de agar LBS, pois isso pode criar uma depressão que pode se assemelhar a uma colônia bacteriana e distorcer os resultados durante contagens de placas. Se a ponta toca na placa, faça uma nota e não inclua a depressão em contagens da colônia.
  5. Tendo T medições finais
    1. Após os pontos de coincubação nas placas de 24 poços terem sido incubados por 5 h a 24 ° c, adicionar 1 mL de caldo LBS a cada poço e ressuscitar os pontos de coincubação por pipetagem para cima e para baixo até que todas as células sejam resrepended. Seja consistente com o vigor em que as células são ressuscipended em todas as repetições. Por exemplo, pressione a alça da pipeta oito vezes para suspender totalmente cada amostra.
    2. Uma vez que cada ponto de coincubação é reativado, prepare uma placa de 96 poços para uma diluição serial e placas de agar LBS com os antibióticos apropriados para detectar a diluição da mesma forma que o passo 2.4.1.
    3. Execute as etapas 2.4.2-2.4.6 para concluir a diluição serial para medições finais T.
      Nota: Um importante controle deve ser incluído durante a otimização inicial do ensaio de coincubação. No final do período de coincubação, a placa de cepas mistas para a mídia que inclui ambos os antibióticos. Nenhuma estirpe deve poder crescer a menos que 1) uma mutação espontânea ocorra, ou 2) os marcadores selecionáveis são trocados entre tensões.

3. visualizando Coincubações usando microscopia de fluorescência

  1. Imagem cada ponto de coincubação em placas de Petri de agar LBS das etapas 2.3.3 e 2.3.4 usando um microscópio estéreo equipado para detecção de fluorescência verde e vermelha, que correspondem com as proteínas de fluorescência sendo expressas nos plasmímetros estáveis.
  2. Comece tomando imagens do ponto de coincubação de controle (cepa de referência pVSV102 + deformação de referência pVSV208).
    1. Ajuste a ampliação para que o ponto esteja em foco.
    2. Usando a luz e o filtro apropriados da excitação para observar GFP, ajuste o tempo da exposição assim que somente a fluorescência do ponto da coincubação é detectável e toda a fluorescência do fundo dos meios é baixa ou não visível.
    3. Mude a luz e o filtro da excitação para observar RFP, ajustando o tempo da exposição para minimizar o fundo do meio.
  3. Para cada ponto de coincubação dos tratamentos experimentais, imagem para a cepa de referência utilizando o filtro GFP e o tempo de exposição determinado na etapa 3.2.2.
  4. Imagem a cepa concorrente usando o filtro RFP, ajustando o tempo de exposição para que a fluorescência só é observada a partir do ponto de coincubação e fluorescência de fundo do meio é mínima. Salve ambas as imagens e nomeie-as para incluir ambas as IDs de deformação, o número replicando, o tempo de incubação quando a imagem foi tirada (por exemplo, 24 h). Repita para todas as repetições.
    Nota: O tempo de coincubação pode necessitar de ser ajustado para diferentes plasmíos ou espécies bacterianas. Veja a discussão para otimização.

4. análise de dados

  1. Calculando CFUs para cada controle e tratamento experimental em cada ponto temporal (T início e T final)
    1. Uma vez que as colônias são visíveis em placas de diluição seriais (por exemplo, 24 h a 24 ° c para V. fischeri), identifique o fator de diluição onde as colônias individuais podem ser contadas e não cresceram juntas em grandes aglomerados Multicolônias (Figura 2b). Para cada repetição, conte e registre o número de colônias individuais para uma determinada diluição. Esse número representa o CFUs para essa replicação.
    2. Converter CFUs para a diluição para CFUs total para cada cepa na coincubação usando a fórmula abaixo:
      [CFUs ÷ (fator de diluição x Vol. de ponto de diluição)] x Vol. da amostra não diluída = CFUs total
      Exemplo: T0: [(6 CFUs) ̧ (10 ^-6 x 0, 5 mL)] x [0, 1 mL] = 1,2 E7 CFUs total da cepa 1 no ponto misto no início do experimento
      T5: [(4 CFUs) ̧ (10 ^-3 x 0, 5 mL)] x [1,0 mL] = 8,0 E5 CFUs total da cepa 1 no ponto misto após 5 h de coincubação
      Os valores de CFU para cada cepa em cada ponto de tempo são os dados brutos que podem ser usados para várias análises e testes estatísticos diferentes (ver seção 4,2 abaixo).
  2. Realize as seguintes transformações de dados para determinar se uma cepa concorrente supera a deformação de referência por: (i) determinar se a proporção da deformação de referência diminui na presença da cepa concorrente, ou (II) calcular o índice competitivo relativo do registro (RCI). Essas análises convertem os dados brutos em rácios e podem ser úteis para determinar o resultado competitivo de uma interação, mas não conseguem determinar o mecanismo da concorrência (ou seja, matar vs inibição do crescimento).
    1. Calculando a proporção de cada cepa para cada ponto de tempo durante a coincubação
      1. Converta dados CFU para a proporção de cada cepa em um tratamento. Para a cepa de referência (RS) em T0, divida o CFUs total para a cepa de referência em T0 pela soma dos CFUs totais para a cepa de referência e o concorrente (CS) em T0:
        RST0 cfus ÷ (RST0 Cfus + csT0 cfus) = proporção de deformação de referência em T0.
        Realize o mesmo cálculo para determinar a proporção da cepa concorrente em T0:
        CST0 cfus ÷ (RST0 Cfus + csT0 cfus) = proporção de deformação de referência em T0
        Repita esse processo para cada ponto de tempo e replicar para o tratamento experimental e o tratamento de controle (coincubação de deformação de referência diferencialmente marcada).
      2. Gráfico a proporção média de cada tipo de deformação em T0 e T5 em um gráfico de barras empilhadas (Figura 3a).
      3. Certifique-se de que a razão inicial desejada das cepas foi obtida. Para as coincubações em que as cepas foram inicialmente misturadas 1:1, cada tipo de deformação deve incluir ~ 0,5 da população em T0 e não deve ser estatisticamente diferente entre si usando o teste t de Student (P > 0, 5). Se a proporção de uma estirpe for significativamente maior do que a da outra estirpe em T0, repita o experimento até que seja alcançada uma razão de partida de 1:1.
      4. Determine se a cepa concorrente compreende uma proporção significativamente maior da população após 5 h. realize um teste t de Student comparando a proporção de cada cepa no tratamento experimental em T0 e T5. Se a proporção de estirpe concorrente for significativamente diferente da estirpe de referência em T5 (P < 0, 5), este resultado sugere que a competição de estirpe pode ter ocorrido. Prossiga para o passo 4.2.1.5.
      5. Para determinar se a presença da cepa concorrente reduziu a proporção da cepa de referência após 5 h, realize um teste t de Student comparando a proporção da cepa de referência no controle com a proporção da cepa de referência no tratamento experimental (cepa de referência v estirpe concorrente).
        Nota: se a proporção da cepa de referência for estatisticamente menor no tratamento experimental em relação ao controle (P < 0, 5), a cepa concorrente reduziria significativamente a proporção da cepa de referência após 5 h e superou a cepa de referência.
    2. Calculando o valor do log RCI para cada tratamento (incluindo o controle)
      Nota: O índice competitivo relativo, ou RCI, é um único valor que compara como a proporção final de tipos de deformação difere da taxa inicial. O valor de RCI é transformado em log de tal forma que um valor de log RCI maior que zero indica que a cepa concorrente (CS) superou a cepa de referência (RS), um valor de log RCI menor que zero indica que a cepa de referência superou a cepa concorrente, e um log RCI valor de zero indica que nenhuma cepa foi supercompetida.
      1. Calcule os valores de log RCI para cada controle e tratamento experimental usando a seguinte equação:
        Log [(CST5 CFU ̧ RST5 cfus) ̧ (csT0 CFU ̧ RST0 cfus)] = log RCI
      2. Os valores de RCI de log de gráfico usando uma caixa separada & plotagem de bigodes onde os dados são representados graficamente na direção horizontal (Figura 3B).
      3. Determine se cada tratamento foi significativamente diferente de zero realizando o teste t de um aluno comparando os valores de log RCI de cada tratamento (incluindo o controle) a um conjunto de dados comparando o mesmo número de repetições todos com um valor zero. Se os valores do log RCI para o tratamento experimental são estatisticamente maiores que zero (P < 0, 5), então a cepa concorrente superou a cepa de referência.
        Nota: O controle não deve ser estatisticamente diferente de zero (P > 0, 5), pois as cepas de referência diferencialmente marcadas são isogênicas.
      4. Realize o teste t de Student para determinar se os valores de RCI de log para o tratamento experimental foram significativamente maiores que o controle (P < 0, 5). Se os valores do log RCI do tratamento experimental são estatisticamente maiores do que o tratamento de controle, a cepa concorrente superou a cepa de referência.
  3. Realize a seguinte análise estatística para determinar o mecanismo pelo qual a cepa concorrente supera a cepa de referência: (i) analisar dados brutos de CFU total, ou (II) examinar a porcentagem de recuperação da cepa de referência. Essas análises podem ser mais complicadas para ver em relação àquelas da etapa 4,2, mas identificarão se a cepa concorrente supera a cepa de referência ao superá-la, inibindo o crescimento da deformação de referência ou eliminando ativamente a deformação de referência.
    1. Analisando dados totais brutos do CFU
      1. Dados brutos totais do CFU do gráfico para ambas as cepas usando um gráfico de dispersão intercalada, onde as réplicas são mostradas como pontos de dados individuais (figura 4a). Exiba dados em uma escala de log e adicione uma linha horizontal indicando o CFUs T0 médio para ambas as cepas.
      2. Para determinar se a presença da cepa concorrente afetou negativamente a cepa de referência, realize um teste t de Student comparando os CFUs de referência para os tratamentos de controle e experimentais em T5. Se a cepa de referência CFUs no tratamento experimental for estatisticamente menor do que no controle (P < 0, 5), então a presença da cepa concorrente afetou significativamente a cepa de referência.
      3. Para determinar se a presença da cepa concorrente inibiu o crescimento ou eliminou a cepa de referência, realize um teste t de Student comparando a cepa de referência CFUs em T0 e T5 para os tratamentos de controle e experimentais.
        Nota: Na ausência de um concorrente, a cepa de referência deve mostrar um aumento significativo na CFU quando comparado T0 e T5 para o tratamento de controle. Ao analisar o tratamento experimental, se a cepa de referência CFUs em T5 não for estatisticamente diferente comparada ao T0 (P > 0, 5), a cepa concorrente inibiu o crescimento da cepa de referência. Se a cepa de referência T5 CFUs for significativamente menor que os CFUs T0 (P < 0, 5), então a cepa concorrente matou a cepa de referência.
    2. Calculando a recuperação percentual da cepa de referência
      1. Transforme dados totais do CFU para a cepa de referência (RS) em dados de recuperação por cento usando a equação abaixo:
      2. (RST5 cfus ̧ RST0 cfus) x 100 =% recuperação de deformação de referência
      3. Exiba a porcentagem de recuperação da deformação de referência usando um gráfico de barras separado, onde cada barra representa o controle ou o tratamento experimental (Figura 4B). Adicione uma linha tracejada em y = 100 para indicar 100% de recuperação de deformação de referência (sem aumento ou diminuição na cepa de referência CFUs de 0 h a 5 h).
      4. Para determinar se a cepa concorrente afetou negativamente a cepa de referência, realize um teste t de Student comparando a recuperação de porcentagem de referência para o tratamento de controle para o tratamento experimental. Se a recuperação percentual é significativamente menor do que o controle (P < 0, 5), em seguida, a cepa concorrente afetou negativamente a cepa de referência.
      5. Para identificar se a cepa concorrente inibiu o crescimento ou eliminou a cepa de referência, realize um teste t de Student comparando a recuperação de porcentagem de referência para o tratamento experimental e um conjunto de dados com o mesmo número de repetições, todos com um valor de 100.
        Nota: Se o tratamento experimental não for estatisticamente diferente de 100 (P > 0, 5), a cepa concorrente inibiu o crescimento da cepa de referência. Se a recuperação por cento de deformação de referência no tratamento experimental for significativamente menor que 100 (P < 0, 5), então a cepa concorrente matou a cepa de referência.
    3. Interpretar imagens de microscopia de fluorescência
      1. Uma vez que as imagens da microscopia de fluorescência são tomadas, determine se cada tensão é visivelmente detectável no ponto de coincubação. Para a coincubação de controle (cepa de referência pVSV102 + cepa de referência pVSV208), tanto a GFP quanto a RFP devem ser visíveis a partir de um ponto de coincubação. Se esse não for o caso, configure o experimento novamente, garantindo que as cepas sejam corretamente rotuladas e coincuficadas em placas sem antibióticos.
      2. Para cada ponto de coincubação experimental, verifique se há possíveis resultados.
        Nota: Se a cepa concorrente for visível, mas a cepa de referência não for detectada, isso sugere que a cepa concorrente matou ou inibiu o crescimento da cepa de referência. Se ambas as cepas estiverem presentes e uniformemente misturadas (GFP e RFP presentes ao longo do ponto de coincubação), esses dados sugerem que a cepa concorrente não compete com a cepa de referência e ambas as cepas coexistem. Se ambas as cepas estão presentes, mas são separadas espacialmente (microcolônias de GFP ou RFP estão presentes ao longo do ponto de coincubação), que sugere a cepa de referência e a cepa concorrente pode estar engajando em interações competitivas e modificações para pode ser necessária a estirpe de referência ou a relação inicial de coincubação. Consulte a discussão para obter mais detalhes.

5. determinando se a interação é dependente do contato

Nota: Se você achar que uma cepa mata ou inibe a cepa de referência, a interação pode ser diffusible ou dependente do contato. Para determinar se a interação é dependente do contato da célula-célula, realize um ensaio de coincubação conforme descrito acima para as etapas 1-2 com as seguintes modificações.

  1. Execute as etapas 1.1-2.2.
  2. Uma vez que as cepas são normalizadas, fisicamente separar cepas usando um filtro de nitrocelulose com um tamanho de poros de 0,22 mm. Este tamanho de poros permite a difusão de antimicrobianos e pequenas moléculas, mas previne o contato físico entre as células V. fischeri .
    Nota: Se a interação for dependente do contato célula-celular, a separação da cepa de referência da cepa concorrente com o filtro deve revogar o fenótipo de morte ou inibição e a cepa de referência não deve ter reduzido cfus. Se a interação não é dependente do contato da célula-pilha, e é um mecanismo diffusible, separar as tensões não deve impedir que a tensão do concorrente mate a tensão da referência.
    1. Spot 5 mL da cepa de referência para o centro de um filtro e Spot 5 mL da cepa concorrente para o centro de um filtro diferente. Coloque o filtro que contém a deformação de referência na superfície de uma placa de agar LBS. Coloque o filtro que contém a estirpe concorrente directamente sobre o filtro com a estirpe de referência.
      Nota: Cada cepa é manchada em filtros, em vez de a tensão inferior manchado diretamente sobre a placa de agar para que as cepas podem ser mais facilmente colocados diretamente em cima um do outro.
    2. Se houver preocupação de que as cepas não sejam empilhadas diretamente em cima uma da outra, diminua o volume de infiltra de deformação de referência manchado no filtro. Isso garantirá que a área do ponto de deformação de referência seja menor e totalmente acima ou abaixo da cepa concorrente. Alternar qual cepa está no topo e na parte inferior para dar conta de diferenças na difusão de nutrientes do meio de agar.
    3. Para garantir que o filtro permite a difusão de pequenas moléculas, inclua um tratamento de controle onde a cepa de referência é manchada em um filtro e um antibiótico que é sensível a (cloranfenicol) é manchado para o outro. Empilhe os filtros diretamente em cima um do outro e coloque em uma placa de agar LBS. O antibiótico deve ser capaz de difundir através do filtro e deve matar a cepa de referência.
  3. Incubar as placas com filtros a 24 ° c por 5 h. Não inverta a placa de agar durante a incubação para evitar a movimentação dos filtros.
  4. Realize diluições seriais para o ininoculado inicial de acordo com a etapa 2,4.
  5. Tendo T medições finais
    1. Usando pinças estéreis, transfira cada conjunto de filtros para um tubo Falcon de 50 mL contendo 5 mL de caldo LBS. Assegure-se de que os filtros estejam fisicamente separados dentro do tubo para permitir a ressuspensão completa de cada tipo de deformação.
    2. Ressuscitar as cepas de filtros por pipetagem para cima e para baixo até que os filtros são claras de todas as células. Use pinças para girar os filtros e limpar o material celular de ambos os lados. Esterilize pinças com etanol entre as amostras.
    3. Realize a diluição em série para T final de acordo com a etapa 2,5. Ao calcular o CFUs total para T final, ajuste o "volume total da amostra não diluída" de 1 mL a 5 mL.

Resultados

A fim de avaliar as interações competitivas entre populações bacterianas, foi desenvolvido um protocolo de ensaio de coincubação e otimizado para V. fischeri. Este método utiliza plasmíos estáveis que codificam genes de resistência a antibióticos e proteínas fluorescentes, permitindo a seleção diferencial e a discriminação visual de cada cepa. Analisando os dados coletados a partir do ensaio de coincubação, pode-se identificar o desfecho competitivo de uma inter...

Discussão

O ensaio de coincubação descrito acima fornece um método poderoso para descobrir a competição interbacteriana. Essa abordagem permitiu a identificação da competição intraespecífica entre os isolados de V. fischeri e a caracterização do mecanismo competitivo19. Embora o método descrito foi otimizado para a bactéria Marinha V. fischeri, pode ser facilmente modificada para acomodar outras espécies bacterianas, incluindo isolados clínicos e ambientais. É importante n...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer aos revisores por seu feedback útil. A.N.S. foi apoiado pela Fundação Gordon e Betty Moore através de Grant GBMF 255, 3 para a Fundação de pesquisa de ciências biológicas.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL Microcentrifuge TubesFisher05-408-129
10 μL multichannel pipette
100 μL multichannel pipette
300 μL multichannel pipette
10 μL single channel pipette
20 μL single channel pipette
200 μL single channel pipette
1,000 μL single channel pipette
24-well platesFisher07-200-84sterile with lid
96-well platesVWR10062-900sterile with lid
Calculator
ChloramphenicolSigmaC0378stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg/mL LBS)
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software
ForcepsFisher08-880
Kanamycin SulfateFisherBP906-5stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS)
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS)FisherSA1J788H50.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100)
Petri platesFisherFB0875713sterile with lid
Spectrophotometer
Semi-micro cuvettesVWR97000-586
TipOne 0.1-10 μL starter systemUSA Scientific1111-350010 racks
TipOne 200 μL starter systemUSA Scientific1111-50010 racks
TipOne 1000 μL starter systemUSA Scientific1111-252010 racks
Vortex
NameCompanyCatalog NumberComments
LBS media
1 M Tris Buffer (pH ~7.5)50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)
Agar TechnicalFisherDF0812-17-915 g (Add only for plates)
DI water950 mL
Sodium ChlorideFisherS640-320 g
TryptoneFisherBP9726510 g
Yeast ExtractFisherBP9727-25 g

Referências

  1. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).
  2. Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).
  3. Dörr, N. C. D., Blockesh, M. Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).
  4. Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).
  5. Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2. PloS One. 8 (4), e61086 (2013).
  6. Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).
  7. Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068 (2010).
  8. Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export. MBio. 4 (4), (2013).
  9. García-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins. Elife. 6, 24869 (2017).
  10. Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Multifaceted interfaces of bacterial competition. Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).
  11. Cornforth, D. M., Foster, K. R. Antibiotics and the art of bacterial war. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).
  12. Shank, E. A., Kolter, R. New developments in microbial interspecies signaling. Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).
  13. Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo. MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).
  14. Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage. Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).
  15. Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards?. Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).
  16. Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins. Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).
  17. Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon. Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).
  18. Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).
  19. Speare, L., et al. Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).
  20. Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
  21. Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae. Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).
  22. Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).
  23. Sana, T. G., et al. The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).
  24. Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae. PLoS. 9 (8), e0004031 (2015).
  25. Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains. PloS One. 4 (8), e6734 (2009).
  26. Ishikawa, T., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).
  27. Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).
  28. Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).
  29. Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer. Science. 347 (6217), 63-67 (2015).
  30. Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).
  31. Huang, Y., et al. Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis. Frontiers in microbiology. 8, 528 (2017).

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