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要約

細菌は、細菌間の競争に従事するための多様なメカニズムをコードします。ここでは、細菌単離物間の競合相互作用を特徴付け、それらが混合集団の空間構造にどのように影響するかを特徴付ける培養ベースのプロトコルを提示する。

要約

この原稿は、2つの細菌集団間の競合相互作用を検出し特徴付けるための培養ベースのコインcubationアッセイについて説明する。この方法は、各集団の選択と視覚的判別のための明確な抗生物質耐性能力と蛍光タンパク質をそれぞれ差別化してタグ付けすることを可能にする安定したプラスミドを採用しています。ここでは、競合するビブリオ・フィシェリ株の調製とコインキュベーション、蛍光顕微鏡イメージング、および定量データ解析について説明する。このアプローチは簡単で、迅速な結果をもたらし、ある集団が別の集団の増殖を殺すか阻害するか、また、競合が拡散性分子を介して媒介されるか、または直接細胞間接触を必要とするかを決定するために使用することができます。各細菌集団は異なる蛍光タンパク質を発現するので、アッセイは混合コロニー内の競合する集団の空間的な判別を可能にする。記載された方法は、この種に最適化された条件を用いて共生細菌V.fischeriで行われるが、プロトコルは、ほとんどの培養可能な細菌単離物に適応することができる。

概要

この原稿は、2つの細菌単離物が競合相互作用が可能であるかどうかを決定する培養ベースの方法を概説する。混合集団を研究する場合、細菌単離物がどの程度相互作用するか、特に分離分離が干渉メカニズムを介して直接競合しているかどうかを評価することが重要です。干渉競争とは、1 つの集団が直接成長を阻害したり、競合する集団1を殺したりする相互作用を指します。これらの相互作用は、微生物コミュニティの構造と機能2、3に大きな影響を及ぼす可能性があるため、識別することが重要です。

微生物競争のメカニズムは、宿主関連細菌と自由生殖細菌4、5、6、7、および両方を含む多様な環境からの細菌のゲノムで広く発見されている。 8,9.殺菌化学物質1、12、分泌抗菌ペプチド13などの拡散性メカニズムを含む様々な競争戦略が記載されている10、11 阻害エフェクターを標的細胞に移すために細胞接触を必要とする接触依存性機構と同様に、9,14,15,16,17 、18.

培養ベースのコインキュベーションは微生物学5、8、19で一般的に使用されていますが、この原稿は、アッセイを使用して競争のメカニズムを特徴付ける方法と適応のための提案を概説しています。他の細菌種と使用するためのプロトコル。さらに、この方法では、競合インタラクションの性質に関するさまざまな質問に答えるために、データを分析および提示するための複数のアプローチについて説明します。ここで説明する技術は、以前にコビオビブリオ・フィシェリ属細菌19の共生性対称的競争の根底にある細菌間殺菌機構を同定するために用いられたが、それらは、それらのために適している環境分離物およびヒト病原体を含む多くの細菌種は、接触依存性および拡散性の両方の競争メカニズムを評価するために利用することができる。プロトコルのステップは、他の細菌種の最適化を必要とする場合があります。より多くのモデルシステムが異なる種型10、16、20、21を含むように同種生物の使用を超えて研究を拡大していることを考えると、この方法は貴重な資源となるでしょう。競争が多重株や多種系に与える影響を理解しようとする研究者のために。

プロトコル

1. コインキューベーション用の菌株を準備する

  1. コインベキュートアッセイ中に細菌競争の標的となる適切な基準株を選択します。参照ひずみの選択時のベスト プラクティスと、参照ひずみが結果に与える影響については、「ディスカッション」を参照してください。このプロトコルでは、V.fischeri株ES114が基準株として機能する。
  2. コインの中の分離物を区別するために使用される選択およびスクリーニング方法を決定する
    1. 典型的には、異なる抗生物質耐性遺伝子(例えばカナマイシンまたはクロラムフェニコール)を含む安定したプラスミドを有する株を変換し、各株に対して選択するだけでなく、異なる蛍光タンパク質(例えばGFPまたはRFP)をコードする遺伝子を視覚的に変換する。共培養における歪みの種類を区別する。
      注:安定したプラスミドの使用は、株が選択の不在でプラスミドを失う場合、この株の数は定量時に過小評価され、蛍光顕微鏡を使用して視覚的に検出できないため必要です。
    2. タグコインキバテッドV.フィシェリ株は、緑色蛍光タンパク質(GFP)および抗生物質カナマイシン(Kan R)に対する耐性を発現するプラスミドpVSV102を含むような差別的に、第2株が含まれています。プラスミドpVSV208は、赤色蛍光タンパク質(dsRed)および抗生物質クロラムフェニコール(Cm R)22に対する耐性を発現する。
      注:他の差分選択は、コインキューバティング株を区別するために使用することができます。その他の方法については、「ディスカッション」を参照してください。
    3. 選択が堅牢であることを確認するために、コインcubationアッセイの初期最適化中に次の制御を含めます。それに対して選択する必要がある抗生物質を含む寒天プレート上で差別的にタグ付けされた各株をプレート(すなわち、歪み2のために選択する媒体上のプレート株1、およびその逆)。
  3. コインキューブレーションアッセイの2日前、筋参照株pVSV102、基準株pVSV208、および適切な抗生物質を含むLBS寒天プレート(例えば、100 μg/mLカナマイシンまたは2μg/mL)に-80°C株から各競合他社株pVSV208クロラムフェニコール)を24°Cで一晩インキュベートする。すべての細胞が実験の開始時にプラスミドを含んでいることを確認するには、抗生物質の選択が必要です。
  4. アッセイの1日前に、適切な抗生物質を用いた新鮮なLBS寒天プレートに対して、株タイプ(生物学的複製物)ごとに4つの個々のコロニーを選び、再ストリークし、24°Cで一晩インキュベートする。
    注:このステップは、他の細菌種に対する最適化を必要とし得るが、より長いまたはより短いインキュベーション時間は、目的の生物の増殖速度に応じて十分な細胞を得るために必要とされ得る。

2. コインキューバテ細菌株

  1. インキュベーションのための各細菌株の調製(図1A)
    1. 無菌のつまようじを使用して、寒天板から細胞を掻き取り(米粒の大きさと同じくらい)、LBSスープの1mLを含む1.5mLのマイクロ遠心管で細胞を再懸濁します。チューブの側面に押し込み、激しく上下にピペッティングして、細胞の塊を分割します。
    2. チューブと渦を1-2sでキャップします。細胞の塊がまだ見える場合は、サンプルが視覚的に均一になるまで渦またはピペットを上下に続けます。
    3. すべてのサンプルに対して手順 2.1.1-2.1.2 を繰り返します。
  2. すべてのサンプルの 600 nm (OD600)で光学密度を測定および記録します。正確なOD測定を得るためには、LBSブロスを使用してサンプルを最大10倍まで希釈する必要があります。各サンプルを所望の OD600に正規化します。株は通常、OD600〜1.0に正規化され、これはV.fischeriの〜106細菌/mLに変換される。
    注:このステップは、接種細胞密度が競争のメカニズムに応じてコインキュベーション結果に影響を与えるため、異なる細菌種の最適化を必要とする場合があります。最適化については、ディスカッションを参照してください。
  3. コインキューバティング株 (図1B,C)
    1. 標識された1.5 mL遠心管に各株の100 mL(OD 1.0に正規化)を加えることによって、1:1比(v/v)で基準株と競合他社株を混合します。対照として、参照歪み自体の差異タグ付きバージョンと混合する(参照歪みpVSV102+参照歪みpVSV208)。この制御は、競合他社株の存在が参照ひずみの成長に影響を与えるかどうかを判断するために、後の統計分析に必要です。1-2sの混合ひずみ培養物を渦。
      注:開始率が結果に大きな影響を与える可能性があり、調整が必要になる場合があるため、この手順では最適化が必要になる場合があります。最適化については、ディスカッションを参照してください。
    2. 生物学的反復ごとにステップ 2.3.1 を繰り返します。このステップを完了した後、合計8つの混合ひずみチューブが存在する必要があります:差別的にタグ付けされた参照株(コントロール)を持つ4つの生物学的反復、および差異タグ付き参照および競合株を持つ4つの生物学的反復()実験的)。
    3. LBS寒天を含むペトリプレート上の各コントロールと実験混合物のスポット10 mL;これらの培養スポットは、インキュベーション後の蛍光顕微鏡に使用されます。
    4. すべての液体が寒天に吸収されるまで、スポットがベンチで完全に乾燥し、24 °Cでペトリプレートをインキュベートします。pVSV102およびpVSV208でタグ付けされたV.fischeri株は、蛍光解剖顕微鏡を用いて集団レベルでGFPとRFPを可視化するのに十分な高い細胞密度に成長するために、最低15時間が必要です。ここでは、混合スポットをイメージングするために24時間のインキュベーションを使用します。
      注:湿りすぎたり、乾燥しすぎたりしないプレートを使用することが重要です。プレートが湿すぎる場合、コインキューブレーションスポットは寒天プレートに吸収されません。同じ日に注いだプレートの使用は避けてください。プレートが乾燥しすぎると、寒天面に小さな波や亀裂が生じ、コインの凹部が不規則な形をしています。
    5. ステップ2.3.3と同じ細菌懸濁液を使用して、各対照および実験混合物の10mLを、1ウェル当たり1mLのLBS寒天を含む24ウェルプレートにスポットします。ステップ2.3.3のように、24ウェルプレートの寒天に適切な水分があることを確認してください。スポットを完全に乾燥させ、24 °Cで5時間インキュベートします。これらの培養スポットは、実験終了時に各株のコロニー形成単位(CCF)を定量するために使用されます。
      注:個々の井戸の成長のための細菌の懸濁液をスポッティングは、終点でより容易な懸濁液を可能にする。このステップは、24ウェルプレートを使用するより経済的なアプローチとして正方形の無菌フィルター片を使用して達成することができる。正方形の滅菌フィルター片は寒天板の上に置くことができ、各実験混合物の10 mLは、24ウェルプレートではなく、これらのフィルタ上に見つけることができます。コインキューベーション時間の後、フィルターは1.5 mL遠心管に移され、コインキューブレーションスポットは渦または上下に渦巻くことによって再懸濁することができる。5時間のインキュベーション時間は、V.fischeri単離物19間の細菌間死を検出するのに十分であるが、このコインキュベーション時間は、他の種または競争的メカニズムのためにより短くまたは長くする必要があるかもしれない。詳細については、ディスカッションを参照してください。
  4. 接種を開始するためのシリアル希釈
    1. 開始コインキュベーション混合物の連続希釈を実行するには、8列と12行があるので、96ウェルプレート90°を回転させます。各行には、最初の列に希釈されていない混合物のサンプルが含まれ、その後、行の残りのウェル全体で 7 つの 10 倍の連続希釈が続きます (図 2A)。
    2. 各行にひずみ ID、反復数、および時間 (開始イノクル = T0) を付けます。希釈系列を見つける適切な抗生物質を補充したLBS寒天プレートにラベルを付けます。各抗生物質プレートが選択している株を特定してください。
    3. マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルにLBSスープの180 mLを追加し、希釈されていないコインcubation混合物の最初の列を空のままにします。
      注:研究者は、リン酸緩衝生理食生(PBS)を使用して、特に急速に成長している細菌種で作業する場合、またはシリアル希釈が必要な大規模な実験を一貫して行う場合、コインキュベーションスポットを再中断し、シリアル希釈を行うことを選択することができます。実行する長い時間。これらのインスタンスでPBSを使用すると、シリアル希釈を行う過程で細菌の著しい増殖を防ぐことができます。ただし、サイズや持続時間に関係なく、すべての実験で使用されるソリューション(PBSやLBSなど)と一致することが重要です。
    4. 200 mLの単一チャネルピペットを使用して、チューブから最初のカラムにコインcubation混合物の100 mLをうまく転送します。先端を捨て、すべてのコインcubation混合物について繰り返します。
    5. マルチチャンネルピペットを使用して、列1から2に20 mLを転送し、上下にピペットでミックスします。各列のヒントを破棄し、各行が最初のコインキュベーション混合物の10倍のシリアル希釈を含むように、各列を繰り返します。
      注:希釈が上下にピペトされる回数と一致する。たとえば、希釈シリーズ全体で一貫性を保つために、各希釈ごとにピペットハンドルを5回押し下げます。
    6. 8つの先端を取り付けたマルチチャンネルピペットを使用して、希釈シリーズ(すなわち、8つのウェルの1行)で各ウェルから5mLを吸引し、参照株を選択するLBS寒天プレート(カナマイシンで補充)にスポットします。競合他社株(クロラムフェニコールを補充)を選択するプレート上にこのステップスポッティングを繰り返します(図2B)。インキュベーターに入れる前に、スポットを完全に乾燥させます。
      注:同じヒントを使用して、参照と競合株を選択するプレート上の複製希釈系列を見つけることができますが、反復間で変更する必要があります。これは、細菌のコロニーに似て、プレートカウント中に結果を歪めることができるうつ病を作成することができるので、LBS寒天プレートにピペット先端の端に触れないようにしてください。先端がプレートに触れる場合は、メモを作成し、コロニー数にうつ病を含めません。
  5. T最終測定の取り組み
    1. 24ウェルプレートのコインキュベーションスポットを24°Cで5時間インキュベートした後、各ウェルに1 mLのLBSスープを加え、すべての細胞が再懸濁するまで上下にピペッティングしてコインキューベーションスポットを再懸濁させます。すべての反復でセルが再中断される活力と一致します。たとえば、ピペット ハンドルを 8 回押し下げると、各サンプルを完全に再中断します。
    2. 各コインキュベーションスポットが再懸濁したら、ステップ2.4.1と同じ方法で希釈を見つける適切な抗生物質を使用して、シリアル希釈用の96ウェルプレートとLBS寒天プレートを準備します。
    3. ステップ 2.4.2-2.4.6 を実行して、T 最終測定のシリアル希釈を完了します。
      注:重要な制御は、コインcubationアッセイの初期最適化中に含まれるべきである。コインキュベーション期間の終わりに、両方の抗生物質を含む培地に混合株をプレートします。いずれの株も、1)自発的な突然変異が生じるか、または2)選択可能なマーカーが株間で交換されない限り、成長してはならない。

3. 蛍光顕微鏡を用いてコインcub化を可視化する

  1. LBS寒天ペトリプレート上の各コインキュベーションスポットを、安定したプラスミドで発現する蛍光タンパク質に対応した緑色および赤色蛍光検出用に装備されたステレオ顕微鏡を用いて、ステップ2.3.3および2.3.4から画像化する。
  2. まず、対照コインキューブレーションスポット(参照歪みpVSV102+参照歪株pVSV208)の画像を撮ることから始める。
    1. スポットがフォーカスに合わせられるように倍率を調整します。
    2. 適切な励起光とフィルタを使用してGFPを観察し、コインキューブレーションスポットからの蛍光のみが検出可能であり、媒体からの任意のバックグラウンド蛍光が低いか見えないように露光時間を調整します。
    3. 励起光とフィルタを変更して RFP を観察し、露出時間を調整してメディアからの背景を最小限に抑えます。
  3. 実験処理から各コインキュベーションスポットについて、ステップ3.2.2で決定したGFPフィルタと露光時間を用いて参照歪みの画像を用いて示す。
  4. RFPフィルタを用いて競合他社株を画像化し、培地からのコインキュベーションスポットおよび背景蛍光からのみ蛍光が観察されるように露光時間を調整することは最小限である。両方の画像を保存し、両方の歪みの一部のID、反復数、画像が撮影されたインキュベーション時間(例えば、24時間)を含むようにそれらを名前を付けます。すべての反復について繰り返します。
    注:コインキューブレーション時間は、異なるプラスミドまたは細菌種に対して調整する必要がある場合があります。最適化については、ディスカッションを参照してください。

4. データ分析

  1. 各コントロールおよび各タイムポイントでの実験処理の CFC の計算 (T 開始および T 最終)
    1. コロニーがシリアル希釈プレート上に見え始めたら(例えば、V.fischeriの24°Cで24h)、個々のコロニーをカウントすることができ、大きなマルチコロニークラスターに一緒に成長していない希釈因子を特定する(図2B)。反復ごとに、特定の希釈の個々のコロニーの数をカウントおよび記録します。この数値は、そのレプリケートの CFU を表します。
    2. 以下の式を使用して、コインキューベーションの各株の合計 CFO に希釈の CFO を変換します。
      [ CFC ÷ (希釈係数 x vol. 希釈スポットの vol. ] 希釈されていないサンプルの x vol. = 全 CFC
      例: T0: [(6 CFO) ] (10^-6 x 0.005 mL)] x [0.01 mL] = 実験開始時の混合スポットにおける歪み 1 の合計 CFO 1
      T5: [(4 CFO) ( 10^-3 x 0.005 mL)] x [1.0 mL] = 5 h コインキュベーション後の混合スポットにおける歪み 1 の合計 CFO
      各時点での各ひずみの CFU 値は、複数の異なる分析および統計検定に使用できる生データです(下記のセクション 4.2 を参照)。
  2. 次のデータ変換を実行して、競合競技者ひずみが参照ひずみよりも優れているかどうかを判断します: (i) 参照ひずみの比率が競合株の存在下で減少するか、または (ii) を計算します。相対的な競争指数 (RCI) をログに記録します。これらの分析は生データを比率に変換し、相互作用の競合結果を決定するのに役立ちますが、競争のメカニズム(すなわち、殺害対成長阻害)を決定することはできません。
    1. コインキューベーション中の各時間ポイントの各歪みの比率の計算
      1. CFU データを処理中の各株の比率に変換します。T0 の参照ひずみ (RS) の場合、T0 での参照ひずみの合計 CFC を、参照ひずみの合計 CCF と T0 の競合企業 (CS) の合計で除算します。
        RST0 CFO ÷ (RST0 CFO + CST0 CFC) = T0 での参照歪みの比率。
        同じ計算を実行して、T0 での競合株の比率を決定します。
        CST0 CFC ÷ (RST0 CCF + CST0 CFC) = T0 での参照歪みの比率
        各時間点に対してこのプロセスを繰り返し、実験処理と対照処理(分化タグ付き参照歪みコインキュベーション)の両方を複製する。
      2. 積み上げ棒グラフでT0とT5の各ひずみタイプの平均比率をグラフ化します(図3A)。
      3. 株の所望の開始比が得られたことを確認します。株が最初に1:1混合されたコインキュベーションの場合、各株タイプはT0の母集団の約0.5を含み、学生のt検定(P> 0.05)を使用して統計的に異なってはならないはずです。1株の割合がT0の他の株よりも有意に大きい場合は、1:1の開始比が達成されるまで実験を繰り返します。
      4. 競技者株が5時間後に集団の有意に大きな割合を含むかどうかを決定する. T0およびT5での実験処理における各株の割合を比較する学生のt検定を行う。競合株の割合がT5(P<0.05)の基準株の割合と有意に異なる場合、この結果は歪み競争が発生した可能性を示唆している。手順 4.2.1.5 に進みます。
      5. 競技者株の存在が5時間後に基準株の比率を減少させたかどうかを判断するために、コントロール内の参照株の比率と参照歪の比率を比較する学生のt検定を実行する。実験的治療(参照株対競合他社株)。
        注:基準株の割合が対照(P<0.05)に対する実験処理において統計的に低い場合、競合株は5時間後に基準株の割合を有意に減少させ、参照株を上回った。
    2. 各処理のログ RCI 値の計算 (コントロールを含む)
      注:相対競合指数(RCI)は、歪みタイプの終わり率が開始比とどのように異なるかを比較する単一の値です。RCI 値は、ゼロより大きいログ RCI 値が競合株 (CS) が参照ひずみ (RS) を上回り、ログ RCI 値がゼロ未満であることを示すようにログ変換され、ログ RCI は競合株を上回り、ログ RCI は対照を超えています。0 の値は、どちらのひずみも競合が競合しがちにないことを示します。
      1. 次の式を使用して、各制御および実験処理の対数 RCI 値を計算します。
        ログ [(CST5 CFU の RST5 CFU) ( CST0 CFU の RST0 CFU)] = ログ RCI
      2. グラフログRCI値は、データが水平方向にグラフ化される別々のボックス&ウィスカープロットを使用して行われます(図3B)。
      3. 各治療がゼロ値で同じ数の反復を比較するデータ・セット(対照を含む)のログRCI値を比較する学生のt検定を行うことによって、各治療がゼロから有意に異なっていたかどうかを判別します。実験処理の対数 RCI 値が統計的にゼロ (P < 0.05) より大きい場合、競合株は参照ひずみを上回りました。
        注:対照は、差異的にタグ付けされた参照株が等元性であるため、ゼロ (P > 0.05) と統計的に異なってはならないはずです。
      4. 学生のt検定を実行して、実験処理のログRCI値が対照よりも有意に大きいかどうかを判断します(P< 0.05)。実験処理からの対数RCI値が対照処理よりも統計的に大きい場合、競合他社株は基準歪みを上回った。
  3. 次の統計分析を実行して、競合株が参照ひずみを上回るメカニズムを決定します: (i) 生の合計 CFU データを分析するか、(ii) 参照ひずみのパーセント回復率を調べます。これらの分析は、ステップ4.2からのものに対して相対的に見るのがより面倒な場合がありますが、競合他社株がそれを成長させ、参照株の成長を阻害するか、または積極的に参照株を排除することによって参照株を上回るかどうかを識別します。
    1. 未加工の CFU データの分析
      1. インターリーブ散布プロットを使用して両方の株の生の合計CFUデータをグラフ化し、そこで反復は個々のデータポイントとして表示されます(図4A)。ログスケールにデータを表示し、両方の株の平均 T0 CFO を示す水平線を追加します。
      2. 競合株の存在が参照株に悪影響を及ぼすかどうかを判断するには、T5での対照および実験処置に関する参照株CCFを比較する学生のt検定を実行する。実験処理における基準株CFCが対照(P<0.05)よりも統計的に低い場合、競合株の存在は参照株に有意に影響を与えた。
      3. 競合株の存在が参照株の増殖を阻害したか、または除去したかを決定するために、対照および実験的処置のためにT0およびT5における参照株CUを比較する学生のt検定を行う。
        注:競合他社が存在しない場合、基準株は対照処理のためにT0およびT5を比較する際にCFUの有意な増加を示すべきである。実験処理を分析する場合、T5における基準株CUがT0(P>0.05)と比較して統計的に異なっていない場合、競合株は参照株の増殖を阻害した。 参照株T5 CFCがT0CFO(P< 0.05)よりも有意に低い場合、競合株は参照歪みを殺した。
    2. 参照ひずみの回復率の計算
      1. 参照ひずみ (RS) の CFU データの合計を、次の式を使用してパーセントの回復データに変換します。
      2. (RST5 CCF の RST0 CFO) x 100 = 参照歪みの % リカバリ
      3. 各バーが対照または実験処理のいずれかを表す分離棒グラフを使用して、参照ひずみの回復率を表示します(図4B)。y = 100 で破線を追加して、参照ひずみの 100% の回復を示します (0 h から 5 h までの参照ひずみ CCF の増減はありません)。
      4. 競技者株が参照株に悪影響を及ぼしたかどうかを判断するには、対照処理と実験治療の基準歪み率回復を比較する学生のt検定を実行する。パーセントの回復がコントロール (P< 0.05) よりも有意に小さい場合、競合株は参照ひずみに悪影響を及ぼします。
      5. 競合他社株が基準株の増殖を阻害したか、または除去されたかを特定するために、実験治療のための参照歪みパーセント回復を比較する学生のt検定を実行し、同じ回数の反復を持つデータセットをすべて値は 100 です。
        注:実験治療が100(P> 0.05)と統計的に異なっていない場合、競合株は参照株の増殖を阻害した。 実験治療における基準株率回復が100(P<0.05)よりも有意に低い場合、競合株は参照株を殺した。
    3. 蛍光顕微鏡画像の解釈
      1. 蛍光顕微鏡画像が撮影されたら、各株がコインキュベーションスポットで目に見えて検出可能かどうかを判断します。対照コインキューベーション(参照歪株pVSV102+参照歪株pVSV208)の場合、GFPとRFPの両方が1つのコインキューベーションスポットから見える必要があります。そうでない場合は、再び実験を設定し、菌株が適切に標識され、抗生物質を含まないプレート上でコインキューバンされていることを確認します。
      2. 各実験コインキュベーションスポットについて、可能な結果を確認してください。
        注:競合株が目に見えるが、基準株が検出されない場合、競合株が死亡または参照株の増殖を阻害することを示唆する。両方の株が存在し、均一に混合されている場合(GFPとRFPがコインキュベーションスポット全体に存在する)、これらのデータは、競合他社株が基準株と競合せず、両方の株が共存することを示唆しています。両方の株が存在するが、空間的に分離されている場合(GFPまたはRFPのいずれかのマイクロコロニーがコインキュベーションスポット全体に存在する)、これは、参照株と競合他社株が競争的な相互作用と変更に従事している可能性があることを示唆しています。参照歪みまたは初期コインキュベーション比が必要な場合があります。詳細については、ディスカッションを参照してください。

5. インタラクションが接触依存であるかどうかを判断する

注:1つの株が参照株を殺すか阻害する場合、相互作用は拡散性または接触依存性である可能性があります。相互作用が細胞間接触に依存しているかどうかを判断するために、以下の修飾を伴うステップ1-2について、上記のようにコインcubationアッセイを行う。

  1. 手順 1.1-2.2 を実行します。
  2. 株が正規化されると、0.22mmの細孔サイズのニトロセルロースフィルターを使用して、物理的に別々の株。この細孔サイズは、抗菌剤と低分子の拡散を可能にしますが、V.フィシェリ細胞間の物理的な接触を防ぎます。
    注:相互作用が細胞間接触に依存する場合、フィルタとの競合株からの参照株の分離は、殺しまたは阻害表現型を分解し、参照株はCUを減少させるべきではない。相互作用が細胞間接触に依存せず、拡散可能なメカニズムである場合、株を分離することは、競合株が参照歪みを殺すことを妨げるべきではない。
    1. フィルタの中心に基準ひずみのスポット5 mLと、別のフィルタの中心に競合他社株のスポット5 mL。参照ひずみを含むフィルタをLBS寒天板の表面に配置します。競合他社のひずみを含むフィルタを、参照ひずみを持つフィルターの上に直接配置します。
      注:各株は寒天プレートに直接見つかった底株ではなく、フィルター上にスポットされているので、株は互いの上に直接置くことができます。
    2. 株が互いに直接積み重ねられていない懸念がある場合は、フィルター上に見つかった参照歪みのイノクルの体積を減らします。これにより、参照ひずみスポットの面積が小さく、競合他社の歪みの上または下に完全に含まれなくなります。寒天媒体からの栄養素の拡散の違いを説明するために、どの株が上と底にあるかの代替。
    3. フィルタが小分子の拡散を可能にするために、基準株がフィルター上に見つかった制御処理と、それが感受性である抗生物質(クロラムフェニコール)が他方に見つかった。フィルターを互いに直接積み重ね、LBS寒天プレートの上に置きます。抗生物質は、フィルタを介して拡散することができ、参照株を殺す必要があります。
  3. 24 °Cで5時間フィルターでプレートをインキュベートします。フィルターを動かさないようにインキュベーションする際は、寒天プレートを反転させないようにしてください。
  4. ステップ 2.4 に従って開始イヌキュラムのシリアル希釈を実行します。
  5. T最終測定の取り組み
    1. 滅菌ピンセットを使用して、LBSスープの5 mLを含む50 mLファルコンチューブにフィルターの各セットを転送します。フィルターがチューブ内で物理的に分離されていることを確認し、各ひずみタイプの完全な再停止を可能にします。
    2. フィルターがすべてのセルからクリアされるまで、上下にピペッティングして、フィルターから株を再中断します。ピンセットを使用して、フィルターを回転させ、両側からセル材料をクリアします。サンプル間のエタノールでピンセットを殺菌します。
    3. ステップ 2.5 に従って、T ファイナルのシリアル希釈を実行します。TファイナルのCFOの合計を計算する場合は、1 mLから5 mLに「希釈されていないサンプルの総体積」を調整します。

結果

細菌集団間の競合相互作用を評価するために、V.fischeri用に最適化されたコインcubationアッセイプロトコルが開発され、最適化された。この方法は、抗生物質耐性遺伝子および蛍光タンパク質をコードする安定したプラスミドを利用し、各株の差異選択および視覚的判別を可能にする。コインベーションアッセイから収集したデータを分析することで、相互作用?...

ディスカッション

上記のコインcubationアッセイは、細菌間の競合を発見するための強力な方法を提供する。このアプローチは、V.fischeri分離と競争メカニズム19の特性特性間の特異的競争の同定を可能にした。記載された方法は海洋細菌V.フィシェリ用に最適化されたが、臨床および環境分離を含む他の細菌種に対応するように容易に改変することができる。競争メカニズムは、多...

開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

私たちは、彼らの有用なフィードバックのためのレビュー担当者に感謝したいと思います。A.N.S.は、ライフサイエンス研究財団への助成金GBMF 255.03を通じてゴードンとベティムーア財団によって支援されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL Microcentrifuge TubesFisher05-408-129
10 μL multichannel pipette
100 μL multichannel pipette
300 μL multichannel pipette
10 μL single channel pipette
20 μL single channel pipette
200 μL single channel pipette
1,000 μL single channel pipette
24-well platesFisher07-200-84sterile with lid
96-well platesVWR10062-900sterile with lid
Calculator
ChloramphenicolSigmaC0378stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg/mL LBS)
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software
ForcepsFisher08-880
Kanamycin SulfateFisherBP906-5stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS)
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS)FisherSA1J788H50.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100)
Petri platesFisherFB0875713sterile with lid
Spectrophotometer
Semi-micro cuvettesVWR97000-586
TipOne 0.1-10 μL starter systemUSA Scientific1111-350010 racks
TipOne 200 μL starter systemUSA Scientific1111-50010 racks
TipOne 1000 μL starter systemUSA Scientific1111-252010 racks
Vortex
NameCompanyCatalog NumberComments
LBS media
1 M Tris Buffer (pH ~7.5)50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)
Agar TechnicalFisherDF0812-17-915 g (Add only for plates)
DI water950 mL
Sodium ChlorideFisherS640-320 g
TryptoneFisherBP9726510 g
Yeast ExtractFisherBP9727-25 g

参考文献

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