JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים שיטה לאפיון של מובילי הממברנה המונעת על ידי פרוטון בתכשירים ושלפוחית ממברנה המיוצרים על ידי ביטוי הטרוולוגי ב -E. coli והליזה של תאים באמצעות עיתונות צרפתית.

Abstract

מספר שיטות פותחו כדי לאפיין פונקציונלית שנאים ממברנה הרומן. Polyamines נמצאים בכל מקום בכל האורגניזמים, אבל מחליפי פוליאמין בצמחים לא זוהו. כאן, אנו לתאר שיטה לאפיון האנטיאמין נוגדי סבלים באמצעות ממברנה שלפוחית שנוצר מן הליזה של התאים קולי של es, הטרוסקסואלים המביעים באופן מצער צמח antiporters. ראשית, אנו הAtBAT1 באופן מאוד הביע מאמץ של E. coli לקוי של המרת פוליאמין ו ארגינין מובילים. שלפוחיות הופקו באמצעות מכבש צרפתי, מטוהרים על ידי משתמשים בשיטת סינון ממברנה ומנוצל באמצעות מדבקות של מצעים המסומנים כדי להדגים את ספציפיות המצע של המוביל. מאמר זה הוכיח כי AtBAT1 הוא מוביל פרוטונים בתיווך של ארגינין, חומצה γ-עמינח בוטירית, בריקבון ובספרצין. זן מוטציה שפותחה עבור הטיפול של AtBAT1 עשוי להיות שימושי עבור ניתוח פונקציונלי של משפחות אחרות של צמח ובעלי חיים מחליפי פוליאמין. כמו כן ההשערה שניתן להשתמש בגישה זו כדי לאפיין סוגים רבים אחרים של סבלים, כל עוד חלבונים אלה יכולים להתבטא בקרום התא החיידקי. E. coli היא מערכת טובה לאפיון של מובילי הרומן, שכן ישנן שיטות מרובות שיכולות להיות מועסקים לטרנספורטי מוטייז.

Introduction

חלבונים המעורבים בסחר של מטבוליטים מהווים רמה חיונית של רגולציה פיזיולוגית, אבל הרוב המכריע של מובילי הצמח ממברנה עדיין לא התאפיין מבחינה פונקציונלית. מספר אסטרטגיות יושמו על מנת לאפיין את החלבונים בתחבורה הרומן. הטרוולוגי ביטוי אורגניזמים כגון E. coli ו איקריוטית תאים כגון שמרים, xenopus oocytes, תאים מהיונקים, תאים חרקים ותאי הצמח כל שימשו כדי לקבוע את פעילות התחבורה שלהם1. תאים איקריוטית הם המועדף על הביטוי של חלבונים איקריוטית, כי הרכב הסלולר הבסיסי, העברת אותות מסלולים, תמלול ותרגום machineries תואמים את התנאים המקומיים.

שמרים כבר אורגניזם מודל חשוב לאפיון של חלבונים התחבורה הרומן בצמחים. הצמח הראשון של התחבורה חלבון אשר התבטא בהצלחה ב שמרים (סכמיקו פומבה) היה המוביל ההקז HUP1 מ כלורלה2. מאז, הרבה העברת צמחים חלבונים האופיינים פונקציונלית באמצעות מערכת ביטוי שמרים. אלה כוללים, הצמח מובילי סוכר (SUC1 ו SUC23, VfSUT1 ו VfSTP14) ואת מובילי האוקאין (AUX1 ו-PIN5). החסרונות של ניצול שמרים כדי לבטא חלבונים צמחיים יכולים לכלול פעילות לקויה של חלבונים מקומי פלסטיות מכיוון שמרים חסר זה אורגנל, mistargeting6, והיווצרות של אגרגטים מקופלים והפעלה של תגובות המתח שמרים בשל הבעות יתר של חלבונים ממברנה7,8,9.

ביטוי הטרוולוגי של חלבונים בתחבורה בקסנפוס אוציטים שימשו רבות לאפיון האלקטרולוגי של מובילי10. המפעל הראשון של הרכב חלבונים המאופיינת באמצעות ביטוי הטרוולוגי ב Xenopus oocytes היו ערוץ האשלגן KAT110 ו-arabidopsis טרנספורטר הקסז STP111. מאז, xenopus oocytes המועסקים כדי לאפיין רבים הובלה צמחים חלבונים כגון מובילי קרום פלזמה12, וולאר סוכרוז SUT413 ו המשלח מאלער ארמיטה ALMT914. מגבלה חשובה של Xenopus oocytes עבור התחבורה אומר הוא כי הריכוז של מטבוליטים תאיים לא יכול להיות מניפולציות1. יתר על כן, הידע המקצועי נדרש כדי להכין Xenopus oocytes והשונות של אצוות oocyte קשה לשלוט.

ביטוי הטרוולוגי באורגניזם מודל E. coli היא מערכת אידיאלית במונחים של אפיון של הרכב הרומן הייצור חלבונים. עם הגנום הרציף15, המאפיינים המולקולריים והפיזיולוגיים של E. coli ידועים היטב. כלים מולקולריים וטכניקות מבוססים היטב16. בנוסף, וקטורים ביטויים שונים, זנים שאינם פתוגניים ומוטציות זמינים17,18,19. יתר על כן, E. coli יש שיעור צמיחה גבוהה והוא יכול להיות בקלות גדל בתנאי מעבדה. חלבונים רבים ניתן להתבטא בקלות ומטוהרים בכמויות גבוהות E. coli9. כאשר חלבונים לא יכולים להיות ישירות במערכות הסלולר, החוקה של חלבונים לתוך ליפוזומים גם היה מוצלח, אם כי מאתגר חדשנות לאפיון של חלבונים קרום מטוהרים. אפיון פונקציונלי של הובלה מיטוכונדריאלי של הצמח חלבונים כולל מובילי מסיסות כגון מובילי פוספט סויה, תירס, אורז, arabidopsis, dicarboxylate אוחר-tricarboxylate המוביל ב arabidopsis הושגה באמצעות מערכת זו מודל20,21. עם זאת, רקומביננטי חלבונים של חלבון העגבניות SICAT9 נמצאו לא פונקציונלי בניסויים מחדש, וחברים אחרים של משפחת טרנספורטר החתול נמצאו לא פונקציונלי ב xenopus oocyte בחני22. לכן, יש צורך בכלים מולקולריים נוספים לאפיון מובילי הקרום.

חמש מערכות תחבורה פוליאמין. נמצאו ב -אי קולי23 הם כוללים שני מובילי ABC מדיה ספיגה של spermidine וריקבון, מחליף ריקבון/הצפרים, מחליף cadaverine/ליזין, היצואן spermidine ומייבא ריקבון. הריקבון מחליף PotE היה מאופיין באמצעות שלפוחית הזרע, שם הפנים החוצה הוכנו על ידי לישיתאים עם העיתונות הצרפתית ומדידת ספיגה של הריקבון לתוך השלפוחיות בתמורה הצפרים24. ושלפוחית מספרת שימשו גם כדי לאפיין מוביל סידן, אשר מתווך את ההובלה של סידן בתגובה למעבר פרוטון25. ניסויים אלה התבקשו מאיתנו לפתח אסטרטגיה לאפיון של מחליפי פוליאמין אחרים. בתחילה יצרנו זן של אי קולי חסר. בחומר מחליפי החומר כאן, אנו מדגימים את האפיון התפקודי של צמח פוליאמין antiporter על ידי הביטוי הטרוולוגי במתח שהשתנה E. coli , הדור של שלפוחיות קרום באמצעות העיתונות הצרפתית, וקרינה assays.

Protocol

1. הדור של החיידק E. coli כפול להעיף את המוטציה עם התמרה tion

  1. השג את ה- e. coli בודד הסתרה זנים מוטציה ΔPotE ו ΔCadB ממרכז המלאי הגנטי e. coli (http://cgsc.biology.yale.edu).
    הערה: הזן ΔPotE הוא kanamycin עמידים26 ואת המתח הΔCadB הוא העמיד טטרציקלין27.
  2. בנו את המתח הכפול של Pote/CadB (dko) בעזרת פרוטוקול התמרה של P128.
    1. הכנה ליפוסט
      1. לדלל תרבות לילה של ΔPotE ב-LB טרי (1:100) שיושלם עם 10-25 MM MgCl2, 5 מ"מ cacl2, ו 0.1-0.2% גלוקוז.
      2. גדל ב 37 ° c עבור 1-2 h.
      3. הוסף 40 μL של P1 ליפוסט לתרבות, והמשך לצמוח ב 37 ° c. צג עבור 1-3 h עד שהתרבות הייתה מתוחה
        הערה: כאשר התרבות מיועלת, הפסולת התאית תהיה גלויה בצינור והתרבות תהיה בעלת אובדן משמעותי של עכירות.
      4. הוסיפו מספר טיפות של כלורופורם (50-100 μL) לליפוסט ולמערבולת. צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 2 דקות כדי להסיר את הפסולת התאית ולהעביר את supernatant לצינור טרי.
    2. התמרה חושית
      1. לגדול ΔCadB זן לילה בינוני ליברות.
      2. לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב 4,000 x g עבור 2 דקות להשעות מחדש ב 1/5-1/3 נפח התרבות שנקטפו ב-LB טרי בתוספת עם 100 MM MgSO4 ו 5 מ"מ cacl2.
      3. הוסף את ΔCadB cell הבולם לצינור עם phage משלב 1.2.1.4 ולערבב במהירות.
      4. הוסף 200 μL של 1 M Na-ציטראט (pH 5.5), ולאחר מכן להוסיף 1 מ ל של LB. דגירה ב 37 ° c עבור 1 h כדי לאפשר את הביטוי של סמן עמידים לאנטיביוטיקה.
      5. בתאי ספין ב 4000 x g עבור 5 דקות.
      6. השהה מחדש ב-100 μL ליברות עם 100 mM Na-ציטראט (pH 5.5) ומערבולת היטב כדי לפזר תאים.
      7. בחר את זני רקומביננטי על ליברות אגר צלחות עם 50 μg/ml kanamycin ו 10 μg/ml טטרציקלין ולאחר מכן לאשר על ידי תגובת שרשרת פולימראז(PCR) עםהתחל 26,27.
      8. אמת את קטעי ה-PCR באמצעות רצף.

2. ביטוי של גן היעד (AtBAT1) ב E. coli מוטציה

  1. להגביר את רצף באורך מלא של הגן היעד על ידי ה-PCR ולהכניס את הערך שער וקטור פנטר/D-TOPO29.
    הערה: במקרה זה ATBAT 1.1 היה מוגבר באמצעות פריימר הקדמי 5 ' CGGCGATCATGATCCT ו פריימר הפוך 5 ' GCTAAGAAGATGG, דנטורציה ראשונית ב 98 ° c עבור 2 דקות ולאחר מכן 30 מחזורים של דנטורציה ב 98 ° c עבור 0.1 min, ריפוי בשעה 59 ° c עבור 0.3 min, הארכה ב 72 ° c עבור 0.40 מינימום והארכה סופית ב 72 ° c עבור 10 דקות. מוצר ה-PCR היה מטוהר באמצעות ערכת ניקוי של ה-PCR, המכמת באמצעות ספקטרומטר. החדרת מוצר ה-PCR לווקטור השער נעשתה לאחר כיווני manufactrurers.
    1. הפוך את הווקטור כניסה לתאים Top10 E. coli המוסמכת על ידי הלם חום ובחר עבור recombinants מוצלחת על LB מדיה עם 50 Μg/mL kanamycin בעקבות פרוטוקולים שיבוט מולקולרי סטנדרטי30.
    2. לחלץ את ה-DNA באמצעות ערכת החילוץ פלמיד, בעקבות כיווני היצרן, רצף כדי לאשר את ההכנסה הנכונה.
  2. העבר את גן היעד לווקטור היעד של E. coli , pbad-DEST49 על-ידי שיבוט Gateway LR כדי ליצור ביטוי וקטור29.
    1. הפוך את וקטור הביטוי לתאים Top10 E. coli המוסמכת על ידי הלם חום עבור 30 s ובחר מוצלחת recombinants במדיה LB עם 100 μg/mL אמפיצילין30.
    2. לחלץ את ה-DNA30 ורצף כדי לאשר את ההכנסה הנכונה.
  3. שינוי צורה של וקטור לתוך E. coli ΔpotE740 (del):: Kan, ΔcadB2231:: Tn10 ולבחור על צלחות LB עם אמפיצילין, kanamycin, ו טטרציקלין30.
  4. כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי של אראבינוז עבור אינדוקציה, לבטא את הגן היעד תחת שליטתה של המקדם arabad במדיה LB עם ריכוזי הדרגתי של אראבינוז כמתואר29.
  5. לאסוף את כדורי התא ולהעריך חלבון ביטוי על ידי SDS-דף ויזואליזציה של להקות חלבונים כמתואר במדריך המוצר29.
    הערה: E. coli ΔpotE740 (del):: Kan, ΔcadB2231:: Tn10 שימש כמדגם שליטה ללא BAT1 ביטוי. E. coli כפול להפיל תאים מוטציה עם ריק pbad-DEST49 וקטור לא היה בשימוש כפקד בשל נוכחותו של הגן ccdb בווקטור.

3. הדור של הפנים-out ממברנה שלפוחיות

  1. תרבות ה -E. coli תאי מוטציה המבטא את חלבון היעד על ידי הגדלת מושבה אחת לילה ב 5 מ ל של מדיה ללא פוליאמין (2% גליצרול, 6 גרם של K2hpo4, 3 g של KH2PO4, 0.5 g של היום, NH4Cl, 50 mg של thiamine, 0.79 g שמרים להשלים מדיה סינתטית אדנין המיסולפט (10 מ"ג/ליטר), L-Arginine (50 mg/l), l-Aspartic חומצה (80 mg/l), l-היסטידין הידרוכלוריד מונומים (20 מ"ג/L), l-Leucine (100 mg/l), L-ליזין הידרוכללוריד (50 mg/l), מתיונין (20 מ"ג/l), L-פנילאלנין (50 mg/L), L-טראונין (100 mg/L), L-טריפטופן (50 mg/L), L-טירולך (50 mg/L), L-Valine (140 mg/L), Uracil (20 מ"ג/L)). להעביר את התרבות הזאת כדי 500 mL של מדיה חינם polyamine בתוספת 0.0002% אראבינוז ולגדול עד תרבות התא מגיע OD600 של 0.6-0.8 (בדרך כלל ~ 5 h).
  2. לאסוף את הגלולה התא על ידי צנטריפוגה ב 2,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c. להשעות מחדש את הגלולה ולשטוף שלוש פעמים עם 0.1 M אשלגן פוספט מאגר, pH 6.6, המכיל 10 מ"מ EDTA (מאגר 1). נפח התאים הסופי במאגר 1 לאחר הסיבוב השלישי צריך להיות 10 mL.
  3. צור הקרום הפנימי ושלפוחיות על ידי טיפול בעיתונות הצרפתית (10,000 p.s.i.) של תאים שלמים באמצעות מ35 mL תא לחץ צרפתי.
  4. לפני טעינת המדגם לתא הלחץ הצרפתי הסטנדרטי, לשמן את הבוכנה ו-O-טבעות כדי להקל על הכנס לתוך התא.
    הערההוראות אלה הן ספציפיות לשימוש בתאי הלחץ הסטנדרטיים31.
    1. הברג בזהירות את התקע הסגר בקצה התחתון של התא. ודא שהתא מימין כלפי מעלה בהתבסס על האותיות בצד התא. הכנס את הבוכנה לתוך התא והעבר אותו לתא, עד ששורת המילוי המרבית בבוכנה תגיע לחלק העליון של הבוכנה. הפוך את היחידה והניחו על העמדה המסופקת בין שלושת ההצבות.
    2. שופכים את ההשעיה התא לתוך הגוף של התא.
      הערה: היינו משתמשים רק 10 מ ל, כך יהיה הרבה מקום נשאר בתא הלחץ הצרפתי התא, אשר קיבולת של 35 mL.
    3. התקן את תא הלחץ הסטנדרטי. על יחידת תאי הלחץ הצרפתית
      1. . בדיקה ראשונה שהכוח כבוי בצד השמאלי של החלונית נמצא הבורר בורר היחס . יש לו שלוש תנוחות: למטה בסוף הריצה, נמוך באמצעות תא לחץ קטן יותר, וגבוה לשימוש עם התא הלחץ הצרפתי הסטנדרטי. אם העיתונות הצרפתית הייתה בשימוש בעבר עם התא הקטן יותר, הבוכנה לא תהיה במלואה. הגדר מעבר זה כלפי מטה.
    4. הפעל את המחשב עם המתג ב-RHS בחלק האחורי של היחידה והפעל את בורר ההשהיה- הפעלה לתנוחת ההפעלה . הדבר יגרום לבוכנה להיות מלאה לגמרי. הזז את המתג חזרה להשהיהוכבה את המחשב.
    5. שחרר את בורגי האגודל והזז את תפס הבטיחות המתפרס לשני עמודי נירוסטה לצד. . הוא יטלטל ימינה עם יד אחת מחזיק את הבסיס של תקע הסגר במקום, להרים את התא הלחץ הצרפתי למעלה עם שתי הידיים, ולסובב אותו 180 °, כך הבוכנה כעת במצב זקוף. הגדר אותה על הפלטפורמה, והעבר את מתפס הבטיחות במקום כך שהתפס יחזיק את תא הלחץ הצרפתי במקומו.
    6. הערה מכלול שסתום הזרימה על תקע הסגר צריך להיות נגיש לאופרטר וממוקם כך שהשסתום יכול להיות מתהפך בחופשיות. פתח את מכלול שסתום הזרימה עם כמה כיוון השעון פונה. מקם את הזרועות של הבוכנה כך שהם מכוונים בשעה שתיים ושמונה בעמדה השעה. הדק את בורגי האגודלים כך שהתא הלחץ הסטנדרטי יתקיים במקומו.
    7. הכנס את צינור שקע לדוגמה לתוך תקע הסגר, ולחבר פיסת קצר של אבובים גמיש כך את פסולת התא שבור ניתן לאסוף בצינור הבז. אנחנו בדרך כלל משתמשים בגביע 300 mL מלאה קרח כדי להחזיק את הצינור הבז זקוף, כדי לשמור על פסולת התא מקורר.
    8. ודא שמתג ההפעלה ההשהיה מוגדר להשהיה והרכבת השסתום נמצאת במצב פתיחה. הפעל את המכונה בחזרה, לאחר בורר היחס לעבור גבוה, ולהפעיל את שסתום להגדיל את הלחץ על הלוח הקדמי ימינה בערך חצי סיבוב.
    9. הבוכנה תתחיל לעלות מהבסיס. כדי לתפוס את האוויר בחדר לכוון את האוויר היוצא מצינור Tygon מחובר צינור שקע לדוגמה לצינור בגביע.
    10. כשטיפות הנוזל הראשונות מגיעות, סגרו את מכלול שסתום הזרימה על ידי הפיכתו לכיוון השעון. זה יוצר מתכת לחותם מתכת, עם תא הלחץ, כך לא להדק.
    11. החלק הקדמי של העיתונות הצרפתית יש תרשים בלוח הקדמי כדי ליצור את הלחץ הנכון על התאים הביולוגיים בתוך התא הלחץ. במקרה זה, להגביר את הלחץ על ידי הפיכת הלחץ להגדיל שסתום בכיוון השעון, עד מד מגיע 640 psi. זה ייצור לחץ פנימי של 10,000 psi.
    12. לאחר שהתא הגיע לחץ היעד לפתוח את ההרכבה שסתום הזרימה מעט על ידי הפיכתו נגד כיוון השעון. כוונן את פתיחת השסתום כדי לאפשר שיעור זרימה של כ-10 טיפות לדקה בלבד.
    13. כאשר קו העצירה על גוף הבוכנה מגיע לחלק העליון של תא הזרימה. החלף את הבורר הפעלת השהיה כדי להשהות. הדבר קריטי מכיוון שהצורך להוסיף את הבוכנה לתוך התא יגרום נזק ליחידה. פתח את מכלול שסתום הזרימה ואסוף את הטיפות הנותרות.
    14. החלף את בורר היחס כלפי מטהולאחר מכן הגדר את מפסק ההפעלה השהה להפעלה. כאשר הצלחת התחתונה היא באופן מלא לחזור להגדיר את מתג ההפעלה להשהות, ולכבות את המכונה.
    15. הסר את תא הלחץ הצרפתי מהעיתונות הצרפתית, והפרק לניקוי. לאחסן את כל החלקים יבש עם כיסוי אור של גליצרול. להסיר ולהחליף את כל אטמים או חותמות עם סימנים של ללבוש.
  5. הסרת תאים שעברו שברים ושרידים של תאים של העיתונות הצרפתית משחרב על ידי צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c. להיפטר הגלולה, ולהעביר supernatant כדי ultracentrifuge צינורות.
  6. גלולה קרום ושלפוחיות מן הסופרנטנט המתקבל על ידי הסופי ב 150,000 g עבור 1 h ב 4 ° c.
  7. לשטוף את שלפוחית הקרום פעם אחת, ללא השעיה, ב 1 מ"מ Tris-מלאט, pH 5.2 המכיל 0.14 M KCl, 2 מ"מ 2-mercaptoethanol ו 10% גליצרול ו-להשעות מחדש באותו מאגר (מאגר 2)23 באמצעות מטחנת הרקמה dounce. בדרך כלל שבריר ממברנה מ 500 mL של התרבות יהיה מושעה 5 מ ל של מאגר, וריכוז של 5-10 mg של חלבון ממברנה/mL באמצעות שיטת החומצה Biochinic32.
  8. חנות 100 μL התרופות של ההכנות הממברנה ב-80 ° צ' ב 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה.

התמצאות מערבית וכיוון השיגור

  1. לשטוף ולהשעות מחדש ושלפוחיות משלב 3.7 ב 30 mM Tris pH 7.8 + 0.1 mM CoCl2.
  2. כדי 100 μl דגימות, להוסיף 1 μl של 2 מ"ג/mL קרבוקסיפפטידאז A בתוך 0.1 M הנאל, 30 מ"מ Tris, 0.2 מ"מ ליטר cocl2 pH 7.8.
  3. חישוב של 20 דקות ב-20 ° c. להפסיק את העיכול על ידי הוספת 5 μL של 0.5 M NaEDTA, 0.5 M 2-mercaptoethanol pH 7.5.
  4. כדי לבטל את ההפעלה המלאה של האנזים, הפתרון עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
    הערה: שלפוחיות ללא שימוש בקטבוקטיפול שימשו כשליטה.
  5. לנתח דגימות על ידי אלקטרופורזה בנוכחות של ליתיום dodecyl סולפט. הוסף 5-10 μL של 150 mg/mL ליתיום dodecyl סולפט, 450 mg/mL גליצרול, 0.1 mg/mL בbromophenol כחול, 0.4 M טריס pH 7.5 כדי 100 μL של דגימה.
  6. לבצע בלוק חיסוני על ידי הנחת מסנן ניטרוצלולוזה עם 25 מ"מ נתרן-מימן פוספט pH 7.5 על ג'ל פוליאקרילאמיד. מניחים את זה בין שתי מסנני צלולוזה, ולבסוף בין שני מגינים שעברו התפשטות פלסטיק. מניחים מכלול זה בין האלקטרודות של תא המכיל 25 מ"מ נתרן-מימן פוספט pH 7.5 ב 2-4 ° c.
  7. אפשר העברה אלקטרול1 של חלבונים כדי להמשיך עבור 3 h ב 20 V ו 2-3 A.
  8. לחסום את קרום הניטרוצלולוזה לילה ב 2 ° c במאגר חוסם של 0.15 M הנאל, 10 מ"מ טריס, pH 7.5 ו 0.5 mg/mL רצף של 2033.
  9. מסנן הניטרוגליצרין של מסנני הצלולוזה עבור 2 h עם דילול 1:5000 של Anti-שלו (C מסוף)-הנוגדן HRP במאגר חסימת (20 מ ל) ולשטוף פעמיים עם 50 mL של מאגר עבור סך של 60 דקות.
  10. כדי להמחיש את האבן החיסונית, לפזר 6 מ"ג של 4-כלורו-1-נפתלי בתוך 20 מ ל של אלכוהול לאחר ולהוסיף 80 mL של 15 mM טריס pH 7.5 ו 50 μL של 30% H2O2. רחץ את נייר הסינון בפתרון המצע עבור 20 דקות. התגובה יגיב עם נוגדן כדי ליצור מזרז כחול על קרום הניטרוצלולוזה. כאשר מספיק צבע פיתח, לשטוף את הקרום עם המים, ולאפשר ייבוש.

5. שיטת התחבורה

  1. מודדת 100 μL של ממברנה שלפוחיות בגודל 12 ° c עבור 5 דקות.
  2. ליזום הובלה על ידי הוספת פוליאמינס polyamines הקרום שלפוחיות בריכוז הסופי של 50 μM (אלא אם נכתב אחרת). לעשות 3H-מצע (spermidine או ריקבון) פתרונות במאגר התשובה המורכבת של 10 mm טריס-HCl, 10 מ"מ אשלגן פוספט, pH 8.0 ו 0.14 M kcl23 (מאגר 3) עם שינויים בהתאם לאפשרות.
  3. העברת התחבורה אומר במשך 1 דקות ב 12 ° צ' ב 1.5 mL microfuge צינורות.
  4. לאחר 1 דקות, להעביר את תערובות התגובה לסינון סעפת ולסנן דרך מסנן ממברנה 0.45 יקרומטר ניטרוצלולוזה.
    1. הוסף 3 מ ל של מאגר בקרה קר הקרח המכיל 10-מתקפל ריכוז גבוה יותר של polyamines בלתי מסומן ואחריו 3 מ ל של מאגר שיטת הצורך ללא polyamines כדי להפחית את הכריכה הלא ספציפית.
    2. העבר את המסננים שטף ל 20 מ ל מבחנות חד פעמיות המכיל 10 מ ל של הנוזל ולקבוע את הרדיואקטיביות באמצעות מונה נוזל מצוי. הקונטרה-נצנוץ מודד את הרדיואקטיביות במדגם ומדווח עליה כ מתפורר לדקה (dpm).
  5. לחשב את ספיגת הרשת פוליאמין כמו ההבדל בין ספיגת ב 1 דקות על ידי שלפוחיות מודליות ב 12 ° צ' ו ספיגה ב 0 דקות על ידי שלפוחיות מודליות על קרח.
    הערה: המסה של המצע המיובא לתוך הוושלפוחיות מחושבת כדלקמן. אם הנפח לדוגמה בצינור microfuge הוא 0.2 μL ואת הריכוז ההתחלתי של מצע הוא 100 μM, אז מסה כוללת של מצע בצינור microfuge הוא 20 x 10-12 M. בגלל הפעילות הספציפית הגבוהה ביותר של מצעים מסחריים המוצגים (לעתים קרובות 2.22 x 109 dpm/mM) המסה של איזוטופ נוסף ניתן להתעלם בחישוב. אז אם הכמות הכוללת של איזוטופ שנוספו microfuge הצינור היה 100 x 106 dpm ו שלפוחיות היה ספיגה נטו של 1,000 dpm, אז מסה סך של המצע שנלקח על ידי הושלפוחיות היה 1% של המספר הכולל של שומות של מצע או 2 x 10-13 M.
    1. לקבוע Km עבור מצע על ידי מדידת ספיגת של 10, 25, 50, 250 ו 500 μm המצע לתוך ושלפוחיות להביע את חלבון היעד. חשב את הקינטיקה של מייקל-מנטה באמצעות שיטת רגרסיה לא לינארית המשתמשת במודל התוכנה הסטטיסטית34.
  6. עבור ניסויים בתחרות, להוסיף 100 μM, 500 μM, 1 מ"מ, 1.5 mM או 2 מ"מ המצע תחרותי שאינו מתויג שנעשו במאגר ה, לבין שפופרת מיקרוצנטריפוגה mL 1.5 המכיל 100 μL של שלפוחיות ב 12 ° c.
    1. הוסף רדיויניום (50 μM) לצינורית המיקרוצנטריפוגה בו.
    2. מדידת רדיואקטיביות לכוד בתוך שלפוחיות כאמור לעיל על ידי חוזר שלבים 5 דרך 5.4.2.
    3. קבע כנראה Km (km, app) עבור מצעים תחרותיים על ידי מדידת ספיגת של 10, 25, 50, 250 ו-500 μm radiolabeled בנוכחות של 100 μm או במצע שאינו מתויג גבוה יותר ובאמצעות שיטת רגרסיה לינארית להתוות את העקומה.

תוצאות

השלבים העיקריים בפרוטוקול זה מסוכמים תמונה באיור 1. בקצרה, E. coli תאים חסרים כל מחליפי פוליאמין והבעת AtBAT1 הם מתורבתים, centrifuged, שטף עם מאגר נתון לפירוק תאים באמצעות עיתונות צרפתית. לוליזיס נוטה לייצר שלפוחיות כי הם בעיקר בתוך החוצה ללכוד את המאגר מחו...

Discussion

במחקר הנוכחי, אנו מתווה שיטה לאפיון של האנטיפורטר על ידי הבעת הראשונה של החלבון ב -E. coli ולאחר מכן יצירת ממברנה ושלפוחיות, כך חלבון ביטא הטרוסקסואלים ניתן לקבל במערכת ללא תא. בנוסף לציוד שנמצא ברוב מעבדות הביולוגיה המולקולרית, אסטרטגיה זו דורשת שימוש בעיתונות הצרפתית, בultracentrifuge, ובגישה...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

התמיכה בפרויקט זה הגיעה ממכללת מוסמכים BGSU, ומשרד BGSU של תוכניות ומחקר ממומנים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mercaptoethanolSigma-AldrichM6250
3H-putrescinePerkinElmerNET185001MC
3H-spermidinePerkinElmerNET522001MC
4-chloro-1-naphtholSigma-AldrichC8890
14C arginineMoravek Inc.MC137
ArginineSigma-AldrichA-5006
Anti-His (C-term)-HRP antibodyThermoFisherR931-25Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl
group for detection
ArabinoseSigma-AldrichA3256
BCA protein assay kitThermoFisher23227Pierce BCA protein asay kit.
Bromophenol blueBio-Rad161-0404
Carboxypeptidase BSigma-AldrichC9584-1mg
CentrifugeSorvallSS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor
Dounce tissue grinderLabGenome7777-7Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout.
Ecoscint-HNational DiagnosticsLS275scintillation cocktail
EDTASigma-Aldrich
Filtration manifoldHoeferFH225V
French Pressure CellGlen MillsFA-080A120
GABASigma-AldrichA2129
GlutamateSigma-AldrichG6904
Glycerol
GraphPad Prism softwarehttp://www.graphpad.com/prism/Prism.htm
Hydrogen peroxideKROGER
Potassium ChlorideJ.T. Baker3040-01
Liquid scintillation counterBeckmanLS-6500
MaleateSigma-AldrichM0375
NanodropThermoFisher
Nitrocellulose membrane filtersMerck Milliporehawp025000.45 µM
PCR clean up kitGenscriptQuickClean II
Potassium Phosphate dibasicThermoFisherP290-500
putrescinefluka32810
Potassium Phosphate monobasicJ.T.Baker4008
SpermidineSigma-aldrichS2501
Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10This manuscriptAvailable upon request.Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers.
Tris-baseResearch ProductsT60040-1000
UltracentrifugeSorvall MTX 15046960Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor
Ultracentrifuge tubesThermoFisher45237Centrifuge tubes for S150-AT rotor
Vector: pBAD-DEST49ThermoFisherGateway expression vector for E. coli

References

  1. Haferkamp, I., Linka, N. Functional expression and characterisation of membrane transport proteins. Plant Biology (Stuttgart). 14 (5), 675-690 (2012).
  2. Sauer, N., Caspari, T., Klebl, F., Tanner, W. Functional expression of the Chlorella hexose transporter in Schizosaccharomyces pombe. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (20), 7949-7952 (1990).
  3. Sauer, N., Stolz, J. SUC1 and SUC2: two sucrose transporters from Arabidopsis thaliana; expression and characterization in baker's yeast and identification of the histidine-tagged protein. The Plant Journal. 6 (1), 67-77 (1994).
  4. Weber, H., Borisjuk, L., Heim, U., Sauer, N., Wobus, U. A role for sugar transporters during seed development: molecular characterization of a hexose and a sucrose carrier in fava bean seeds. Plant Cell. 9 (6), 895-908 (1997).
  5. Huang, J. G., et al. GhDREB1 enhances abiotic stress tolerance, delays GA-mediated development and represses cytokinin signalling in transgenic Arabidopsis. Plant, Cell & Environment. 32 (8), 1132-1145 (2009).
  6. Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiology. 122 (4), 999-1001 (2000).
  7. Garcia-Mata, R., Bebok, Z., Sorscher, E. J., Sztul, E. S. Characterization and dynamics of aggresome formation by a cytosolic GFP-chimera. Journal of Cell Biology. 146 (6), 1239-1254 (1999).
  8. Liu, J., Sitaram, A., Burd, C. G. Regulation of copper-dependent endocytosis and vacuolar degradation of the yeast copper transporter, Ctr1p, by the Rsp5 ubiquitin ligase. Traffic. 8 (10), 1375-1384 (2007).
  9. Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).
  10. Schachtman, D. P., Schroeder, J. I., Lucas, W. J., Anderson, J. A., Gaber, R. F. Expression of an inward-rectifying potassium channel by the Arabidopsis KAT1 cDNA. Science. 258 (5088), 1654-1658 (1992).
  11. Boorer, K. J., Forde, B. G., Leigh, R. A., Miller, A. J. Functional expression of a plant plasma membrane transporter in Xenopus oocytes. FEBS Letters. 302 (2), 166-168 (1992).
  12. Miller, A. J., Zhou, J. J. Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters. Biochimica et Biophysica Acta. 1465 (1-2), 343-358 (2000).
  13. Reinders, A., Sivitz, A. B., Starker, C. G., Gantt, J. S., Ward, J. M. Functional analysis of LjSUT4, a vacuolar sucrose transporter from Lotus japonicus. Plant Molecular Biology. 68 (3), 289-299 (2008).
  14. Kovermann, P., et al. The Arabidopsis vacuolar malate channel is a member of the ALMT family. The Plant Journal. 52 (6), 1169-1180 (2007).
  15. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  16. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211-222 (2006).
  17. Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. Journal of Molecular Biology. 260 (3), 289-298 (1996).
  18. Wagner, S., et al. Consequences of membrane protein overexpression in Escherichia coli. Molecular & Cellular Proteomics. 6 (9), 1527-1550 (2007).
  19. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), e29191 (2011).
  20. Takabatake, R., et al. Isolation and characterization of cDNAs encoding mitochondrial phosphate transporters in soybean, maize, rice, and Arabidopis. Plant Molecular Biology. 40 (3), 479-486 (1999).
  21. Picault, N., Palmieri, L., Pisano, I., Hodges, M., Palmieri, F. Identification of a novel transporter for dicarboxylates and tricarboxylates in plant mitochondria. Bacterial expression, reconstitution, functional characterization, and tissue distribution. Journal of Biological Chemistry. 277 (27), 24204-24211 (2002).
  22. Snowden, C. J., Thomas, B., Baxter, C. J., Smith, J. A., Sweetlove, L. J. A tonoplast Glu/Asp/GABA exchanger that affects tomato fruit amino acid composition. The Plant Journal. 81 (5), (2015).
  23. Kashiwagi, K., Igarashi, K. Identification and assays of polyamine transport systems in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 720, 295-308 (2011).
  24. Kashiwagi, K., Miyamoto, S., Suzuki, F., Kobayashi, H., Igarashi, K. Excretion of putrescine by the putrescine-ornithine antiporter encoded by the potE gene of Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (10), 4529-4533 (1992).
  25. Tsuchiya, T., Rosen, B. P. Calcium transport driven by a proton gradient and inverted membrane vesicles of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 251 (4), 962-967 (1976).
  26. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
  27. Nichols, B. P., Shafiq, O., Meiners, V. Sequence analysis of Tn10 insertion sites in a collection of Escherichia coli strains used for genetic mapping and strain construction. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6408-6411 (1998).
  28. . P1vir phage transduction Available from: https://openwetware.org/wiki/Sauer:P1vir_phage_transduction (2011)
  29. . pBAD-DEST49 Gateway Destination Vector Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12283016 (2010)
  30. Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: a laboratory Manual. , (2012).
  31. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using biochinic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  32. Wright, J. K., Overath, P. Purification of the lactose: H+ carrier of Escherichia coli and characterization of galactoside binding and transport. European Journal of Biochemistry. 138 (3), 497-508 (1984).
  33. . GaphPad Software Available from: https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/ (2019)
  34. Kirchberger, S., et al. Molecular and biochemical analysis of the plastidic ADP-glucose transporter (ZmBT1) from Zea mays. Journal of Biological Chemistry. 282 (31), 22481-22491 (2007).
  35. Deniaud, A., et al. Expression of a chloroplast ATP/ADP transporter in E. coli membranes: behind the Mistic strategy. Biochimica et Biophysica Acta. 1808 (8), 2059-2066 (2011).
  36. Sze, H. H+-Translocating ATPases: Advances Using Membrane Vesicles. Annual Review of Plant Physiology. 36, 175-208 (1985).
  37. Bush, D. R. Proton-coupled sugar and amino acid transporters in plants. Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology. 44, 513-542 (1993).
  38. Futai, M. Orientation of membrane vesicle from Escherichea coli prepared by different procedures. Journal of Membrane Biology. 115, 15-28 (1974).
  39. Seckler, R., Wright, J. K. Sideness of native membrane vesicles of Escherichea coli and orientation of the reconstituted lactose: H+ carrier. European Journal of Biochemistry. 142 (2), 269-279 (1984).
  40. LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli. Methods in Enzymology. 326, 322-340 (2000).
  41. Goodman, D. B., Church, G. M., Kosuri, S. Causes and effects of N-terminal codon bias in bacterial genes. Science. 342 (6157), 475-479 (2013).
  42. Wacker, M., et al. N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

154assays

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved