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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Verfahren zur Charakterisierung von protonengetriebenen Membrantransportern in Membranvesikelpräparaten, die durch heterologe Expression in E. coli und Lyse von Zellen mit einer französischen Presse hergestellt werden.

Zusammenfassung

Mehrere Methoden wurden entwickelt, um neuartige Membrantransporter funktionell zu charakterisieren. Polyamine sind in allen Organismen allgegenwärtig, aber Polyaminaustauscher in Pflanzen wurden nicht identifiziert. Hier skizzieren wir eine Methode zur Charakterisierung von Polyamin-Antiportern mit Membranvesiken, die aus der Lyse von Escherichia coli-Zellen erzeugt werden, die heterolog einen Pflanzenantiporter exemitzen. Zunächst haben wir AtBAT1 heterolog in einem E. coli-Stamm mangelhaft in Polyamin- und Argininaustauschtransportern exprimiert. Vesikel wurden mit einer französischen Presse hergestellt, die durch Ultrazentrifugation gereinigt und in einem Membranfiltrationstest von markierten Substraten verwendet wird, um die Substratspezifität des Transporters zu demonstrieren. Diese Assays zeigten, dass AtBAT1 ein Proton-vermittelter Transporter von Arginin, Aminobuttersäure (GABA), Putrescin und Spermidin ist. Der mutierte Stamm, der für den Test von AtBAT1 entwickelt wurde, kann für die funktionelle Analyse anderer Familien von Pflanzen- und Tierpolyaminaustauschern nützlich sein. Wir gehen auch davon aus, dass dieser Ansatz verwendet werden kann, um viele andere Arten von Antiportern zu charakterisieren, solange diese Proteine in der bakteriellen Zellmembran exprimiert werden können. E. coli ist ein gutes System für die Charakterisierung neuartiger Transporter, da es mehrere Methoden gibt, die eingesetzt werden können, um einheimische Transporter zu mutagenisieren.

Einleitung

Proteine, die am Handel mit Metaboliten beteiligt sind, stellen ein wesentliches Maß an physiologischer Regulation dar, aber die überwiegende Mehrheit der Pflanzenmembrantransporter ist noch nicht funktionell charakterisiert. Mehrere Strategien wurden implementiert, um neuartige Transportproteine zu charakterisieren. Heterologe Expression in Modellorganismen wie E. coli und eukaryotischen Zellen wie Hefe, Xenopus Oozyten, Säugetierzellen, Insektenzellen und Pflanzenzellen wurden alle verwendet, um ihre Transportaktivität zu bestimmen1. Eukaryotische Zellen werden für die Expression von eukaryotischen Proteinen bevorzugt, da die grundlegende zelluläre Zusammensetzung, Signaltransducing-Pfade, Transkription und Übersetzungsmaschinen mit den nativen Bedingungen kompatibel sind.

Hefe war ein wichtiger Modellorganismus für die Charakterisierung neuartiger Transportproteine in Pflanzen. Das erste Pflanzentransportprotein, das erfolgreich in Hefe exprimiert wurde (Saccharomyces pombe) war der Hexose-Transporter HUP1 von Chlorella2. Seitdem wurden viele Pflanzentransportproteine funktionell mit einem Hefeexpressionssystem charakterisiert. Dazu gehören Pflanzenzuckertransporter (SUC1 und SUC23, VfSUT1 und VfSTP14) und die Auxin-Transporter (AUX1 und PIN5). Nachteile der Verwendung von Hefe, um pflanzliche Proteine auszudrücken, können eine beeinträchtigte Aktivität von plastid-lokalisierten Proteinen umfassen, da Hefe diese Organelle fehlt, Fehlausrichtung6, und Bildung von falsch gefalteten Aggregaten und Aktivierung von Stressreaktionen in Hefe aufgrund der Überexpression von Membranproteinen7,8,9.

Heterologe Expression von Transportproteinen in Xenopus Oozyten wurde häufig für die elektrophysiologische Charakterisierung von Transportern10verwendet. Die ersten pflanzentransportinochig charakterisierten Pflanzentransportproteine, die mit heterologer Expression in Xenopus oocyten charakterisiert wurden, waren der Arabidopsis Kaliumkanal KAT110 und der Arabidopsis Hexose Transporter STP111. Seitdem wurden Xenopus Oozyten eingesetzt, um viele Pflanzentransportproteine wie Plasmamembrantransporter12, Vacuolar-Saccharosetransporter SUT413 und Vacuolar-Malattransporter ALMT914zu charakterisieren. Eine wichtige Einschränkung von Xenopus Oozyten für Transporttests ist, dass die Konzentration von intrazellulären Metaboliten nicht manipuliert werden kann1. Darüber hinaus sind professionelle Kenntnisse erforderlich, um Xenopus Oozyten vorzubereiten, und die Variabilität der Eizellenchargen ist schwer zu kontrollieren.

Heterologe Expression im Modellorganismus E. coli ist ein ideales System in Bezug auf die Charakterisierung neuartiger Pflanzentransportproteine. Mit einem vollständig sequenzierten Genom15sind die molekularen und physiologischen Eigenschaften von E. coli bekannt. Molekulare Werkzeuge und Techniken sind gut etabliert16. Darüber hinaus stehen verschiedene Expressionsvektoren, nichtpathogene Stämme und Mutanten zur Verfügung17,18,19. Darüber hinaus hat E. coli eine hohe Wachstumsrate und kann leicht unter Laborbedingungen angebaut werden. Viele Proteine können leicht in hohen Mengen in E. coli9exprimiert und gereinigt werden. Wenn Proteine nicht direkt in zellulären Systemen untersucht werden können, war die Rekonstitution von Proteinen zu Liposomen auch eine erfolgreiche, wenn auch herausfordernde Innovation für die Charakterisierung gereinigter Membranproteine. Die funktionelle Charakterisierung der mitochondrialen Transportproteine der Pflanze einschließlich gelöster Transporter wie Phosphattransporter in Sojabohnen, Mais, Reis und Arabidopsis, Dicarboxylat-Tricarboxylatträger in Arabidopsis wurde mit diesem Modellsystem20,21erreicht. Jedoch, rekombinante Proteine des Tomatenproteins SICAT9 wurden festgestellt, dass nicht funktional in Rekonstitutionsexperimente, und andere Mitglieder der CAT-Transporter-Familie wurden gefunden, um nicht funktional in Xenopus Oozyten-Assays22. Daher werden zusätzliche molekulare Werkzeuge für die Charakterisierung von Membrantransportern benötigt.

Fünf Polyamin-Transportsysteme sind in E. coli23zu finden. Dazu gehören zwei ABC-Transporter, die die Aufnahme von Spermidin und Putrescin vermitteln, einen Putrescine/Ornithin-Austauscher, einen Kadaverin/Lysinaustauscher, einen Spermidinexporteur und einen Putrescine-Importeur. Der Putrescine-Austauscher PotE wurde ursprünglich mit einem Vesikel-Assay charakterisiert, bei dem von innen nach außen Vesikel durch Lysingzellen mit einer französischen Presse hergestellt und die Aufnahme von radioaktiv markiertem Putrescin in die Vesikel im Austausch gegen Ornithin24gemessen wurden. Vesikel-Assays wurden auch verwendet, um einen Kalziumtransporter zu charakterisieren, der den Transport von Kalzium als Reaktion auf einen Protonengradientenvermittelte 25. Diese Experimente veranlassten uns, eine Strategie für die Charakterisierung anderer Polyaminaustauscher zu entwickeln. Wir haben zuerst einen Stamm von E. coli-Mangel an PotE- und CadB-Austauschern entwickelt. Hier zeigen wir die funktionelle Charakterisierung eines Pflanzenpolyamin-Antiporters durch heterlogen Ausdruck im modifizierten E. coli-Stamm, die Erzeugung von Membranbläschen mit einer französischen Presse und radioaktiv markierte Assays.

Protokoll

1. Erzeugung des E. coli Double Knock Out Mutant mit P1-Transduktion

  1. Beziehen Sie die E. coli Single-Knockout-Mutantenstämme "PotE" und "CadB" vom E. coli Genetic Stock Center (http://cgsc.biology.yale.edu).
    HINWEIS: Die Sorte "PotE" ist kanamycinbeständig26 und die Sorte "CadB" tetracyclinbeständig27.
  2. Konstruieren Sie die PotE/CadB Double Knockout (DKO) Dehnung mit dem P1-Transduktionsprotokoll28.
    1. Lysat-Vorbereitung
      1. Verdünnen Sie eine Übernachtkultur von "PotE" in frischem LB (1:100), ergänzt mit 10-25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2und 0,1-0,2% Glukose.
      2. Bei 37 °C für 1-2 h wachsen.
      3. Fügen Sie der Kultur 40 l P1-Phagenlysat hinzu und wachsen Sie bei 37 °C weiter. Monitor für 1-3 h, bis die Kultur lysiert hat
        HINWEIS: Wenn die Kultur lysiert wird, werden zelluläre Trümmer in der Röhre sichtbar und die Kultur wird einen signifikanten Verlust an Trübung haben.
      4. Fügen Sie dem Lysat und dem Wirbel mehrere Tropfen Chloroform (50-100 l) hinzu. Zentrifuge bei 12.000 x g für 2 min, um Zellablagerungen zu entfernen und den Überstand in ein frisches Rohr zu übertragen.
    2. Transduktion
      1. Wachsen Sie die CadB-Sorte über Nacht in LB-Medium.
      2. Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 4.000 x g für 2 min und resuspendieren in 1/5-1/3 das geerntete Kulturvolumen in frischem LB ergänzt mit 100 mM MgSO4 und 5 mM CaCl2.
      3. Fügen Sie die Zellenaufhängung von CadB mit Phagen ab Schritt 1.2.1.4 in das Rohr ein und mischen Sie sie schnell.
      4. Fügen Sie 200 l von 1 M Na-Citrat (pH5.5) hinzu, dann fügen Sie 1 ml LB hinzu. Bei 37 °C für 1 h inkubieren, um die Expression des antibiotikaresistenten Markers zu ermöglichen.
      5. Spin-Zellen bei 4000 x g für 5 min.
      6. Resuspend in 100 L LB mit 100 mM Na-Citrat (pH 5.5) und Wirbel gut, um Zellen zu dispergieren.
      7. Wählen Sie die rekombinanten Dehnungen auf LB-Agarplatten mit 50 g/ml Kanamycin und 10 g/ml Tetracyclin aus und bestätigen Sie dann durch Polymerase Chain Reaction (PCR) mit geeigneten Primern26,27.
      8. Überprüfen Sie die PCR-Fragmente durch Sequenzierung.

2. Expression des Zielgens (AtBAT1) in E. coli Mutant

  1. Verstärken Sie die Sequenz des Zielgens in voller Länge durch PCR und fügen Sie sie in den Gateway-Eintragsvektor pENTR/D-TOPO29ein.
    HINWEIS: In diesem Fall wurde ATBAT1.1 mit Vorwärtsgrundierung 5'CGGCGATCAATCCTTTGTT und Reverse Primer 5'GCTAAGAATGTTGGAGATGG verstärkt, eine anfängliche Denaturierung bei 98 °C für 2 min und dann 30 Denaturierungszyklen bei 98 °C für 0,1 min, Glühen bei 59 °C für 0,3 min, Verlängerung bei 72 °C für 0,40 min und Endverlängerung bei 72 °C für 10 min. Das PCR-Produkt wurde mit einem PCR-Reinigungskit gereinigt, quantifiziert mit einem Spektrometer. Das Einfügen des PCR-Produkts in den Gateway-Vektor erfolgte nach den Anweisungen der Manufakturierer.
    1. Verwandeln Sie den Einstiegsvektor durch Hitzeschock in kompetente Top10 E. coli-Zellen und wählen Sie erfolgreiche Rekombinanten auf LB-Medien mit 50 g/ml Kanamycin nach Standard-Molekularklonprotokollen30aus.
    2. Extrahieren Sie Plasmid-DNA mit einem Plasmid-Extraktionskit, nach den Anweisungen des Herstellers, und Sequenz, um die korrekte Einfügung zu bestätigen.
  2. Übertragen Sie das Zielgen in den E. coli-Zielvektor pBAD-DEST49 durch Gateway LR-Klonen, um einen Expressionsvektor29zu erstellen.
    1. Verwandeln Sie den Expressionsvektor in kompetente Top10 E. coli-Zellen durch Hitzeschock für 30 s und wählen Sie erfolgreiche Rekombinanten auf LB-Medien mit 100 g/ml Ampicillin30.
    2. Extrahieren Sie Plasmid DNA30 und Sequenz, um die korrekte Insertion zu bestätigen.
  3. Verwandeln Sie den Expressionsvektor in E. coli-PotE740(del)::kan, cadB2231::Tn10 und wählen Sie auf LB-Platten mit Ampicillin, Kanamycin und Tetracyclin30.
  4. Um die optimale Konzentration von Arabinose für die Induktion zu bestimmen, drücken Sie das Zielgen unter der Kontrolle des araBAD-Promotors in LB-Medien mit Gradientenkonzentrationen von Arabinose wiebeschrieben 29aus.
  5. Sammeln Sie die Zellpellets und bewerten Sie die Proteinexpression durch SDS-PAGE und die Visualisierung von Proteinbändern, wie im Produkthandbuch29beschrieben.
    HINWEIS: Als Kontrollbeispiel ohne BAT1-Expression wurde die E. coli-PotE740(del)::kan, cadB2231::Tn10 verwendet. E.coli Doppel-Knock-out-Mutationszellen mit dem leeren pBAD-DEST49-Vektor wurde aufgrund des Vorhandenseins des ccdB-Gens im Vektor nicht als Kontrolle verwendet.

3. Erzeugung von Inside-Out-Membranvesiken

  1. Kultur die E. coli-Mutantenzellen, die das Zielprotein exemiten, indem sie über Nacht eine einzige Kolonie in 5 ml Polyamin-freien Medien (2% Glycerin, 6 g K2HPO4, 3 g KH2PO4, 0,5 g NaCl, NH4Cl, 50 mg Thiamin, 0,79 g Hefe vollständig synthetische Medien Adenin Hemisulfat (10 mg/L), L-Arginin (50 mg/L), L-Assigsäure (80 mg/L), L-Histi Hydrochlorhydrat (20 mg/L), L-Leucin (100 mg/L), L-Lysinhydrochlorid (50 mg/L), L-Methionin (20 mg/L), L-Phenylalanin (50 mg/L), L-Threonin (100 mg/L), L-Tryptophan (50 mg/L), L-Tyrosin (50 mg/L), L-Valin (140 mg/L), Uracil (20 mg/L)). Übertragen Sie diese Kultur auf 500 ml Polyamin-freie Medien, ergänzt mit 0,0002% Arabinose, und wachsen Sie, bis die Zellkultur eine OD600 von 0,6-0,8 erreicht (in der Regel 5 h).
  2. Sammeln Sie das Zellpellet durch Zentrifugation bei 2.000 x g für 15 min bei 4 °C. Das Pellet wieder aufsetzen und dreimal mit 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 6,6, mit 10 mM EDTA (Puffer 1) waschen. Das endgültige Volumen der Zellen in Puffer 1 nach der dritten Drehung sollte 10 ml betragen.
  3. Generieren Sie inside-out Membranvesikdurch behandlung von French Press (10.000 p.s.i.) der intakten Zellen mit einer 35 ml französischen Druckzelle.
  4. Bevor Sie die Probe in die französische Standarddruckzelle laden, schmieren Sie Kolben und O-Ringe, um das Einlegen in die Zelle zu erleichtern.
    Hinweis:Diese Anweisungen sind spezifisch für die Verwendung der Standard-Druckzelle31.
    1. Schrauben Sie den Verschlussstecker vorsichtig in das untere Ende der Zelle. Stellen Sie sicher, dass die Zelle auf der Grundlage des Schriftzugs auf der Seite der Zelle rechts oben ist. Setzen Sie den Kolben in die Zelle ein und bewegen Sie ihn in die Zelle, bis die maximale Fülllinie auf dem Kolben die Oberseite des Kolbens erreicht. Drehen Sie das Gerät um und platzieren Sie es auf dem mitgelieferten Ständer zwischen den drei Pfosten.
    2. Gießen Sie die Zellsuspension in den Körper der Zelle.
      HINWEIS: Wir haben nur 10 ml verwendet, so dass in der französischen Druckzellenkammer, die eine Kapazität von 35 ml hat, noch viel Platz vorhanden sein wird.
    3. Montieren Sie die Standarddruckzelle auf der französischen Druckzelleneinheit.
      1. Überprüfen Sie zunächst, ob der Strom ausgeschaltet ist. Auf der linken Seite des Panels befindet sich der Ratio Selector Schalter. Es hat drei Positionen: unten am Ende des Laufs, Niedrig für die Verwendung einer kleineren Druckzelle und Hoch für die Verwendung mit der Standard-französischen Druckzelle. Wenn die französische Presse zuvor mit der kleineren Zelle verwendet wurde, kann der Kolben nicht vollständig eingefahren werden. Stellen Sie diesen Schalter auf Downein.
    4. Schalten Sie die Maschine mit dem Schalter am RHS auf der Rückseite des Geräts ein und schalten Sie den Pause-Run-Schalter in die Run-Position. Dies führt dazu, dass der Kolben vollständig zurückgezogen wird. Bewegen Sie den Schalter zurück zu Pause, und schalten Sie die Maschine aus.
    5. Lösen Sie die Daumenschrauben und bewegen Sie die Sicherheitsklemme, die sich auf zwei Edelstahlsäulen zur Seite spannt. Es wird nach rechts schwingen. Mit einer Hand, die die Basis des Verschlusssteckers an Ort und Stelle hält, nehmen Sie die französische Druckzelle mit beiden Händen auf und drehen Sie sie um 180°, so dass sich der Kolben nun in der aufrechten Position befindet. Stellen Sie sie auf die Plattform und bewegen Sie die Sicherheitsklemme wieder an Ort und Stelle, so dass diese Klemme die französische Druckzelle in Position hält.
    6. Beachten Sie, dass die Durchflussventil-Baugruppe am Verschlussstecker für den Bediener zugänglich und so positioniert sein muss, dass das Ventil frei gedreht werden kann. Öffnen Sie die Durchflussventilbaugruppe mit einigen Gegendrehungen im Uhrzeigersinn. Positionieren Sie die Arme des Kolbens so, dass sie in einer Zwei- und Achter-Position ausgerichtet sind. Ziehen Sie die Daumenschrauben so an, dass die Standarddruckzelle an Ort und Stelle gehalten wird.
    7. Setzen Sie das Probenauslaufrohr in den Verschlussstecker ein, und schließen Sie ein kurzes Stück flexibler Schläuche an, damit die gebrochenen Zellreste in einem Falkenrohr gesammelt werden können. Normalerweise verwenden wir einen 300 ml eisgefüllten Becher, um das Falkenrohr aufrecht zu halten und die Zellablagerungen gekühlt zu halten.
    8. Stellen Sie sicher, dass der Pause-Run-Schalter auf Pauseeingestellt ist und sich die Ventilbaugruppe in der offenen Position befindet. Drehen Sie die Maschine wieder auf, adust die Ratio Selector Schalter auf Hoch, und drehen Sie die Druckerhöhung Ventil auf der Frontplatte auf der Vorderseite nach rechts etwa eine halbe Runde.
    9. Der Kolben beginnt, von der Basis zu steigen, um die Luft in der Kammer zu verdrängen. Richten Sie die Luft, die aus dem Ambeispielauslassrohr befestigten Tygon-Schläuchen kommt, an das Rohr im Becher.
    10. Wenn die ersten Flüssigkeitstropfen herauskommen, schließen Sie die Durchflussventilbaugruppe, indem Sie sie im Uhrzeigersinn drehen. Dadurch entsteht eine Metall-Metall-Dichtung, mit der Druckzelle, also nicht zu verengen.
    11. Die Vorderseite der französischen Presse hat ein Diagramm auf der Vorderseite, um den richtigen Druck auf die biologischen Zellen innerhalb der Druckzelle zu erzeugen. Erhöhen Sie in diesem Fall den Druck, indem Sie das Druckerhöhungsventil im Uhrzeigersinn drehen, bis das Messgerät 640 psi erreicht. Dadurch entsteht ein interner Druck von 10.000 psi.
    12. Sobald die Zelle den Zieldruck erreicht hat, öffnen Sie die Durchflussventilbaugruppe leicht, indem Sie sie gegen den Uhrzeigersinn drehen. Stellen Sie die Öffnung des Ventils so ein, dass eine Durchflussrate von nur etwa 10 Tropfen pro min möglich ist.
    13. Wenn die Stopplinie am Kolbenkörper die Oberseite der Durchflusszelle erreicht. Wechseln Sie den Pause-Run-Schalter zu Pause. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da der Kolben weiter in die Zelle eingeführt wird, um das Gerät zu beschädigen. Öffnen Sie die Durchflussventilbaugruppe und sammeln Sie die restlichen Tropfen.
    14. Drehen Sie den Schalter Ratio Selector auf Down, und legen Sie dann den Schalter Pause Run auf Ausführenfest. Wenn die untere Platte vollständig eingefahren ist, stellen Sie den Run-Schalter auf Pauseein, und schalten Sie das Gerät aus.
    15. Entfernen Sie die französische Druckzelle aus der französischen Presse und zerlegen Sie sie zur Reinigung. Alle Teile trocken mit einer leichten Abdeckung von Glycerin lagern. Entfernen und ersetzen Sie Dichtungen oder Dichtungen durch Verschleißerscheinungen.
  5. Ungebrochene Zellen und Zellablagerungen der französischen Presse durch Zentrifugation bei 10.000 x g für 15 min bei 4 °C entfernen. Entsorgen Sie das Pellet und übertragen Sie überlagert auf Ultrazentrifugenrohre.
  6. Pelletmembranbläschen aus dem resultierenden Überstand durch Ultrazentrifugation bei 150.000 g für 1 h bei 4 °C.
  7. Waschen Sie die Membranbläschen einmal, ohne Resuspension, in 1 mM Tris-Maleat, pH 5,2 mit 0,14 M KCl, 2 mM 2-Mercaptoethanol und 10% Glycerin und setzen Sie sich im gleichen Puffer (Puffer 2)23 mit einem Dounce-Gewebeschleifer aus. Typischerweise würde die Membranfraktion von 500 ml Kultur in 5 ml Puffer und einer Konzentration von 5-10 mg Membranprotein/ml mit dem Biochinic Acid Assay32aufgehängt.
  8. Lagern Sie 100 L Aliquots von Membranpräparaten bei -80 °C in 1,5 ml Mikrozentrifugenrohren.

4. Western Blot und Orientierung des Transporter-Assays

  1. Vesikel ab Schritt 3,7 in 30 mM Tris pH 7,8 + 0,1 mM CoCl2waschen und wieder aufhängen.
  2. Auf 100 L-Proben 1 l von 2 mg/ml Carboxypeptidase A in 0,1 M NaCl, 30 mM Tris, 0,2 mM CoCl2 pH 7,8 hinzufügen.
  3. 20 min bei 20 °C beule. Beenden Sie die Verdauung durch Zugabe von 5 l von 0,5 M NaEDTA, 0,5 M 2-Mercaptoethanol pH 7,5.
  4. Um das Enzym vollständig zu inaktivieren, inkubieren Sie die Lösung für 1 h bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Vesikel ohne catboxypeptidase A Behandlung wurden als Kontrolle verwendet.
  5. Analysieren Sie Proben durch Elektrophorese in Gegenwart von Lithium-Dodecylsulfat. Fügen Sie 5-10 l mit 150 mg/ml Lithium-Dodecylsulfat, 450 mg/ml Glycerin, 0,1 mg/ml Bromphenolblau, 0,4 M Tris pH-PH-Gehalt von 7,5 bis 100 l Probe hinzu.
  6. Durchführung der Immunoblotting durch Verlegung eines Nitrozellulosefilters, der mit 25 mM Natriumhydrogenphosphat pH 7.5 auf das Polyacrylamidgel befeuchtet ist. Platzieren Sie diese zwischen zwei befeuchteten Zellulosefiltern und schließlich zwischen zwei befeuchteten Kunststoff-Scheuerpads. Platzieren Sie diese Assemblage zwischen den Elektroden einer Kammer, die 25 mM Natrium-Wasserstoff-Phosphat-pH-PH 7,5 bei 2-4 °C enthält.
  7. Elektrotransfer von Proteinen für 3 h bei 20 V und 2-3 A ablaufen lassen.
  8. Blockieren Sie die Nitrocellulosemembran über Nacht bei 2 °C in einem Blockierpuffer von 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 und 0,5 mg/ml Tween 2033.
  9. Inkubieren Sie den Nitrozellulosefilter für 2 h mit einer 1:5000 Verdünnung des Anti-His (C-Klemmen)-HRP-Antikörpers im Sperrpuffer (20 ml) und waschen Sie zweimal mit 50 ml Puffer für insgesamt 60 min.
  10. Um den Immunoblot zu visualisieren, lösen Sie 6 mg 4-Chlor-1-Naphthol in 20 ml denaturiertem Alkohol auf und fügen Sie 80 ml 15 mM Tris pH 7,5 und 50 l von 30%H2O2hinzu. Das Filterpapier 20 min in der Substratlösung baden. Das Reagenz reagiert mit dem Antikörper, um einen blauen Niederschlag auf der Nitrocellulosemembran zu bilden. Wenn sich genügend Farbe entwickelt hat, spülen Sie die Membran mit Wasser ab und lassen Sie sie trocknen.

5. Transport Assay

  1. Inkubieren Sie 100 L Aliquots von Membranbläschen bei 12 °C für 5 min.
  2. Initiieren Sie den Transport, indem Sie den Membranvesikeln radioaktiv markierte Polyamine in einer Endkonzentration von 50 M (sofern nicht anders angegeben) hinzugefügt werden. Herstellung von 3H-Substrat-Lösungen (Spermidin oder Putresin) in einem Assaypuffer bestehend aus 10 mM Tris-HCl, 10 mM Kaliumphosphat, pH 8,0 und 0,14 M KCl23 (Puffer 3) mit Modifikationen je nach Assay.
  3. Transporttests für 1 min bei 12 °C in 1,5 ml Mikrofugenrohren durchführen.
  4. Nach 1 min die Reaktionsgemische auf Filtrationskrümmer übertragen und durch einen 0,45 m Nitrocellulose-Membranfilter filtern.
    1. Fügen Sie 3 ml eiskalten Assaypuffer hinzu, der eine 10-fach höhere Konzentration von nicht beschrifteten Polyaamen enthält, gefolgt von 3 ml Assaypuffer ohne die Polyame, um die unspezifische Bindung zu reduzieren.
    2. Übertragen Sie die gewaschenen Filter auf 20 ml Einweg-Szintillationsfläschchen mit 10 ml Szintillationsflüssigkeit und bestimmen Sie die Radioaktivität mit einem flüssigen Szintillationszähler. Der Szintillationszähler misst die Radioaktivität in der Probe und meldet sie als Disintegrationen pro min (dpm).
  5. Berechnen Sie die Netto-Polyaminaufnahme als Differenz zwischen der Aufnahme bei 1 min durch Vesikel, die bei 12 °C inkubiert werden, und der Aufnahme bei 0 min durch Vesikel, die auf Eis bebrütet werden.
    HINWEIS: Die Masse des substrats, das in die Vesikel importiert wird, wird wie folgt berechnet. Wenn das Probenvolumen im Mikrofuge-Rohr 0,2 l beträgt und die Anfangskonzentration des Substrats 100 m beträgt, beträgt die Gesamtmasse des Substrats im Mikrofugerohr 20 x 10-12 M. Aufgrund der sehr hohen spezifischen Aktivität von kommerziell gekennzeichneten Substraten (oft 2,22 x 109 dpm/mM) kann die Masse des zugesetzten Isotops bei der Berechnung ignoriert werden. Wenn also die Gesamtmenge des Isotopen, das dem Mikrofugenrohr zugesetzt wurde, 100 x 106 dpm betrug und die Vesikel eine Nettoaufnahme von 1.000 dpm hatten, dann betrug die Gesamtmasse des substrats, das von den Vesikeln aufgenommen wurde, 1% der Gesamtzahl der Maulwürfe des Substrats oder 2 x 10-13 M.
    1. Bestimmen Sie Km für das Substrat, indem Sie die Aufnahme von 10, 25, 50, 250 und 500 m Radioradioaktivsubstrat in Vesikel messen, die das Zielprotein exemitenken. Berechnen Sie die Michaelis-Menten-Kinetik mit einer nichtlinearen Regressionsmethode mit dem Michaelis Menton-Modell des statistischen Softwarepakets34.
  6. Für die Wettbewerbsexperimente fügen Sie dem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr, das 100 l Vesikel bei 12 °C enthält, 100 m, 1 mM, 1,5 mM oder 2 mM, nicht gekennzeichnetes Wettbewerbssubstrat, das im Assaypuffer hergestellt wird, 100 m, 50 m, 1,5 mM, 1,5 mM oder 2 mM.
    1. Radioaktiv-Polyamin (50 M) gleichzeitig in das Mikrozentrifugenrohr geben.
    2. Messen Sie die Radioaktivität, die in den Bläschen gefangen ist, wie oben erwähnt, indem Sie die Schritte 5 bis 5.4.2 wiederholen.
    3. Bestimmen Sie die sichtbare Km (Km,app) für die wettbewerbsfähigen Substrate, indem Sie die Aufnahme von 10, 25, 50, 250 und 500 m m radioaktiv markierten Polyaminen in Gegenwart von 100 m oder höher nicht gekennzeichnetem Substrat messen und eine nichtlineare Regressionsmethode zur Darstellung der Kurve verwenden.

Ergebnisse

Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll sind bildlich in Abbildung 1zusammengefasst. Kurz gesagt, E. coli-Zellen, die in allen Polyaminaustauschern einen Mangel haben und AtBAT1 exprimieren, werden kultiviert, zentrifugiert, mit einem Puffer gewaschen und mit einer französischen Presse einer Zelllyse unterzogen. Lyse neigt dazu, Vesikel zu produzieren, die meist innen nach außen sind und den Puffer außerhalb der Zellen fangen. Zellab...

Diskussion

In der vorliegenden Studie skizzieren wir eine Methode zur Charakterisierung eines Antiporters, indem wir zuerst das Protein in E. coli exprimieren und dann Membranbläschen erzeugen, so dass das heterologös exprimierte Protein in einem zellfreien System untersucht werden kann. Zusätzlich zu den Geräten, die in den meisten molekularbiologischen Labors zu finden sind, erfordert diese Strategie den Einsatz einer französischen Presse, einer Ultrazentrifuge und zugang zu einer Einrichtung zur Durchführung von R...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Unterstützung für dieses Projekt kam vom BGSU Graduate College und dem BGSU Office of Sponsored Programs and Research.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mercaptoethanolSigma-AldrichM6250
3H-putrescinePerkinElmerNET185001MC
3H-spermidinePerkinElmerNET522001MC
4-chloro-1-naphtholSigma-AldrichC8890
14C arginineMoravek Inc.MC137
ArginineSigma-AldrichA-5006
Anti-His (C-term)-HRP antibodyThermoFisherR931-25Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl
group for detection
ArabinoseSigma-AldrichA3256
BCA protein assay kitThermoFisher23227Pierce BCA protein asay kit.
Bromophenol blueBio-Rad161-0404
Carboxypeptidase BSigma-AldrichC9584-1mg
CentrifugeSorvallSS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor
Dounce tissue grinderLabGenome7777-7Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout.
Ecoscint-HNational DiagnosticsLS275scintillation cocktail
EDTASigma-Aldrich
Filtration manifoldHoeferFH225V
French Pressure CellGlen MillsFA-080A120
GABASigma-AldrichA2129
GlutamateSigma-AldrichG6904
Glycerol
GraphPad Prism softwarehttp://www.graphpad.com/prism/Prism.htm
Hydrogen peroxideKROGER
Potassium ChlorideJ.T. Baker3040-01
Liquid scintillation counterBeckmanLS-6500
MaleateSigma-AldrichM0375
NanodropThermoFisher
Nitrocellulose membrane filtersMerck Milliporehawp025000.45 µM
PCR clean up kitGenscriptQuickClean II
Potassium Phosphate dibasicThermoFisherP290-500
putrescinefluka32810
Potassium Phosphate monobasicJ.T.Baker4008
SpermidineSigma-aldrichS2501
Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10This manuscriptAvailable upon request.Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers.
Tris-baseResearch ProductsT60040-1000
UltracentrifugeSorvall MTX 15046960Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor
Ultracentrifuge tubesThermoFisher45237Centrifuge tubes for S150-AT rotor
Vector: pBAD-DEST49ThermoFisherGateway expression vector for E. coli

Referenzen

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