JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

E. coli'de heterolog ekspresyon ve fransız presi kullanılarak hücrelerin lysis'inde üretilen membran vezikül preparatlarında proton-tahrikli membran taşıyıcılarının karakterizasyonu için bir yöntem tanımladık.

Özet

Yeni membran taşıyıcıları işlevsel olarak karakterize etmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Poliaminler tüm organizmalarda her yerde bulunur, ancak bitkilerdeki poliamin eşanjörleri tanımlanmamıştır. Burada, escherichia coli hücrelerinin lysis'inden üretilen membran vezikülleri kullanarak poliamin antiporterlarını karakterize eden bir yöntem inanışı bir bitki antiporterını heterologolarak ifade eder. İlk olarak, atbat1'i poliamin ve arginin değişim taşıyıcılarında eksik olan Bir E. coli süzmesinde heterolog olarak ifade ettik. Veziküller bir Fransız presi kullanılarak üretildi, ultrasantrifüj ile saflaştırılmış ve taşıyıcının substrat özgüllüğünü göstermek için etiketli substratların membran filtrasyon telinde kullanıldı. Bu tahliller AtBAT1 arginin bir proton aracılı taşıyıcı olduğunu gösterdi, γ-aminobutirik asit (GABA), putrescine ve spermidin. AtBAT1 tahlil için geliştirilen mutant suşu bitki ve hayvan poliamin eşanjörlerin diğer ailelerin fonksiyonel analizi için yararlı olabilir. Ayrıca bu proteinler bakteri hücre zarında ifade edilebildiği sürece, bu yaklaşımın diğer birçok antiporter türünü karakterize etmek için kullanılabileceğini de varsayız. E. coli, yerli taşıyıcıları susturmak için kullanılan birden fazla yöntem olduğundan, yeni taşıyıcıların karakterizasyonu için iyi bir sistemdir.

Giriş

Metabolitlerin ticaretinde rol oynayan proteinler fizyolojik düzenlemenin temel bir düzeyini oluşturmaktadır, ancak bitki zarı taşıyıcılarının büyük çoğunluğu henüz işlevsel olarak karakterize edilmemiştir. Yeni taşıma proteinlerini karakterize etmek için çeşitli stratejiler uygulanmıştır. E. coli gibi model organizmalarda heterolog ekspresyon ve maya, Kenopus oositleri, memeli hücreleri, böcek hücreleri ve bitki hücreleri gibi ökaryotik hücreler taşıma aktivitelerini belirlemek için kullanılmıştır1. Ökaryotik hücreler ökaryotik proteinlerin ekspresyonu için tercih edilir, çünkü temel hücresel bileşim, sinyal transducing yolları, transkripsiyon ve çeviri makineleri yerli koşullarla uyumludur.

Maya bitkilerde yeni taşıma proteinleri karakterizasyonu için önemli bir model organizma olmuştur. Başarıyla maya ifade edildi ilk bitki taşıma proteini(Saccharomyces pombe) Chlorella2heksoz taşıyıcı HUP1 oldu. O zamandan beri, birçok bitki taşıma proteinleri fonksiyonel bir maya ifade sistemi kullanılarak karakterize edilmiştir. Bunlar, bitki şekeri taşıyıcıları (SUC1 ve SUC23, VfSUT1 ve VfSTP14)ve auxin taşıyıcılar (AUX1 ve PIN5)içerir. Bitki proteinlerini ifade etmek için maya kullanmanın dezavantajları, mayanın bu organelden yoksun olması, yanlış hedeflenme6, yanlış katlanmış agregaların oluşumu ve membran proteinlerinin aşırı ekspresyonuna bağlı olarak mayadaki stres tepkilerinin aktivasyonu7,8,9.

Xenopus oositlerinde taşıma proteinlerinin heterolog ekspresyonu10taşıyıcıların elektrofizyolojik karakterizasyonu nda yaygın olarak kullanılmaktadır. Xenopus oositlerinde heterolog ekspresyon kullanılarak karakterize edilen ilk bitki taşıma proteinleri Arabidopsis potasyum kanalı KAT110 ve Arabidopsis heksoz taşıyıcısı STP111idi. O zamandan beri, Xenopus oositler plazma membran taşıyıcıları 12 gibi birçok bitki taşıma proteinleri karakterize etmek için istihdam edilmiştir12,vacuolar sakaroz taşıyıcı SUT413 ve vacuolar malate taşıyıcı ALMT914. Xenopus oositlerinin taşıma tahlilleri için önemli bir sınırlama hücre içi metabolitlerin konsantrasyonunun manipüle edilemeyeceğidir1. Ayrıca, profesyonel bilgi Xenopus oositler hazırlamak için gereklidir ve oosit toplu değişkenlik kontrol etmek zordur.

E. coli modelinde heterolog ifade, yeni bitki taşıma proteinlerinin karakterizasyonu açısından ideal bir sistemdir. Tam sekanslı genom15ile E. coli'nin moleküler ve fizyolojik özellikleri iyi bilinmektedir. Moleküler araçlar ve teknikler iyi16kurulmuştur. Buna ek olarak, farklı ekspresyon vektörleri, patojenik olmayan suşlar ve mutantlar mevcuttur17,18,19. Ayrıca, E. coli yüksek bir büyüme hızına sahiptir ve laboratuvar koşullarında kolayca yetiştirilebilir. Birçok protein kolayca ifade edilebilir ve E. coliyüksek miktarlarda saflaştırılmış9. Proteinler hücresel sistemlerde doğrudan titreşemediğinde, proteinlerin lipozomlara dönüştürülmesi de başarılı olmuştur, ancak saflaştırılmış membran proteinlerinin karakterizasyonu için zorlu bir yenilik olmuştur. Soya fasulyesi, mısır, pirinç ve Arabidopsis, Arabidosil-trikarboksilit taşıyıcı gibi soya, mısır, pirinç ve Arabidopsis, dikarboksilat-trikarboksilat taşıyıcı gibi solute taşıyıcılar da dahil olmak üzere bitki mitokondriyal taşıma proteinleri fonksiyonel karakterizasyonu bu model sistemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir20,21. Ancak, domates proteini SICAT9 rekombinant proteinlerreconstitution deneylerde fonksiyonel olmayan bulundu, ve CAT taşıyıcı ailesinin diğer üyeleri Xenopus oosit tahlilleri fonksiyonel olmayan bulundu22. Bu nedenle membran taşıyıcılarının karakterizasyonu için ek moleküler araçlara ihtiyaç vardır.

E. coli23'tebeş poliamin taşıma sistemi bulunur. Bunlar spermidin ve putrescine alımı aracılık iki ABC taşıyıcılar, bir putrescine / ornitin eşanjör, bir kadavra / lizin değiştirici, bir spermidin ihracatçısı ve putrescine ithalatçısı içerir. Putrescine değiştirici PotE başlangıçta bir vezikül titreği kullanılarak karakterize edildi, iç dış veziküller bir Fransız basın ıskarta hücreleri lysing tarafından hazırlanan ve ornithine karşılığında veziküller içine radiolabeled putrescine alımını ölçme24. Vezikül tahlilleri de bir proton gradyan25yanıt olarak kalsiyum taşıma aracılık bir kalsiyum taşıyıcı karakterize etmek için kullanılmıştır. Bu deneyler bizi diğer poliamin eşanjörleri karakterizasyonu için bir strateji geliştirmek için istenir. Biz ilk PotE ve CadB değiştiriciler E. coli eksik bir gerginlik oluşturdu. Burada, modifiye E. coli suşunda heterlogous ifade ile bir bitki poliamin antiporter fonksiyonel karakterizasyonu göstermek, bir Fransız basın kullanarak membran vezikülüretimi, ve radiolabeled tahliller.

Protokol

1. P1 Transdüksiyonlu E. coli Double Knock Out Mutant Üretimi

  1. E. coli Genetik Stok Merkezi'nden ΔPotE ve ΔCadB (http://cgsc.biology.yale.edu) e. coli tek nakavt mutant suşları edinin.
    NOT: ΔPotE suşu kanamisin edayanıklı26 ve ΔCadB suşu tetrasikline dayanıklıdır 27.
  2. P1 transdüksiyon protokolü28kullanarak PotE/CadB çift nakavt (DKO) gerilimi inşa edin.
    1. Lysate hazırlık
      1. Taze LB (1:100) δPotE bir gecede kültür seyreltmek 10-25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2ve 0.1-0.2% glikoz ile desteklenmektedir.
      2. 37 °C'de 1-2 saat büyütün.
      3. Kültüre 40 μL P1 faj lysate ekleyin ve 37 °C'de büyümeye devam edin. Kültür dinlenene kadar 1-3 saat monitör
        NOT: Kültür lysed zaman, hücresel enkaz tüp görünür olacak ve kültür bulanıklık önemli bir kayıp olacaktır.
      4. Lysate ve girdap kloroform (50-100 μL) birkaç damla ekleyin. Santrifüj 12.000 x g 2 dakika hücresel enkaz kaldırmak ve taze bir tüp için supernatant transfer.
    2. Iletim
      1. LB ortamda bir gecede ΔCadB zorlanma büyümek.
      2. 2 dk için 4.000 x g santrifüj ile hücreleri hasat ve 1/5-1/3 taze LB hasat kültür hacmi 100 mM MgSO4 ve 5 mM CaCl2ile takviye resuspend .
      3. ΔCadB hücre süspansiyonu adım 1.2.1.4'ten faj ile tüpe ekleyin ve hızla karıştırın.
      4. 200 μL 1 M Na-Sitrat (pH5.5) ekleyin, ardından antibiyotiğe dirençli belirteç ifadesini sağlamak için 37 °C'de 1 mL LB. Incubate ekleyin.
      5. Hücreleri 4000 x g'de 5 dk.
      6. 100 μL LB'de 100 mM Na-Sitrat (pH 5.5) ve girdap ile hücreleri dağıtmak için tekrar lanır.
      7. 50 μg/mL kanamisin ve 10 μg/mL tetrasiklin içeren LB agar plakaları üzerindeki rekombinant suşları seçin ve uygun astarlar26,27ile Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile onaylayın.
      8. PCR parçalarını sıralayarak doğrulayın.

2. E. coli Mutant'ta Hedef Genin (AtBAT1) İfadesi

  1. Hedef genin tam uzunluktadizisini PCR ile yükseltin ve Ağ Geçidi giriş vektörü pENTR/D-TOPO29'ayerleştirin.
    NOT: Bu durumda ATBAT1.1 ileri astar 5'CGGCGATCAATCCTTGTT ve ters astar 5'GCTAAGAATGTTGGAGATGG kullanılarak yükseltildi, 2 dk için 98 °C'de ilk denatürasyon ve sonra 98 °C'de 0,1 dk için 30 döngü denatürasyon, 0,3 dakika için 59 °C'de annealing, 72 °C'de 0,40 dakika uzatma ve 10 dk için 72 °C'de son uzatma. PCR ürünü bir PCR temizleme kiti kullanılarak saflaştırılmış, bir spektrometre kullanılarak ölçüldü. PCR ürününün Gateway vektörüne yerleştirilmesi, manufactrurers yönergelerini takip ederek yapıldı.
    1. Giriş vektörünü Heatshock ile yetkili Top10 E. coli hücrelerine dönüştürün ve standart moleküler klonlama protokollerini izleyerek 50 g/mL kanamisin ile LB medyasında başarılı rekombinantlar seçin30.
    2. Plazmid DNA'sını, üreticinin yönergelerini izleyerek plazmid ekstraksiyon kiti kullanarak ayıklayın ve doğru eklemeyi onaylamak için sıralayın.
  2. Hedef geni E. coli hedef vektörüne aktarın, pBAD-DEST49 Gateway LR klonlama ile bir ifade vektörü oluşturmak için29.
    1. İfade vektörünü 30 s'lik ısı şoku ile yetkili Top10 E. coli hücrelerine dönüştürün ve 100 μg/mL ampisilin30ile LB medyasında başarılı rekombinantlar seçin.
    2. Doğru eklemeyi onaylamak için plazmid DNA30 ve dizi ayıklayın.
  3. İfade vektörünü E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10'a dönüştürün ve lb plakaları üzerinde ampisilin, kanamisin ve tetrasiklin30ile seçin.
  4. İndüksiyon için arabinose optimal konsantrasyonunu belirlemek için, açıklandığı gibi arabinose gradyan konsantrasyonları ile LB medyada araBAD promotörü kontrolü altında hedef geni ifade29.
  5. Hücre peletlerini toplayın ve sds-PAGE ile protein ekspresyonunu değerlendirin ve ürün kılavuzunda açıklandığı gibi protein bantlarının görselleştirilmesi29.
    NOT: E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 BAT1 ifadesi olmadan kontrol örneği olarak kullanılmıştır. E.coli çift devre dışı mutant hücreleri boş pBAD-DEST49 vektörü ile vektörde ccdB geninin varlığı nedeniyle kontrol olarak kullanılmadı.

3. İç-Dış Membran Veziküllerin Üretimi

  1. Kültür E. coli mutant hücreleri poliamin içermeyen medya 5 mL gecede tek bir koloni büyüyerek hedef protein ifade (2% gliserol, K 6 g2HPO4, KH 3 g2PO4, NaCl 0.5 g, NH4Cl, 50 mg tiamin, 0.79 g maya komple sentetik media adenin hemisülfat (10 mg/L), L-Arginin (50 mg/L), L-Aspartik asit (80 mg/L), L-Histidin hidro klorür monohidrat (20 mg/L), L-L-Lösin (100 mg/L), L-Lizin hidroklorür (50 mg/L), L-Metiyonin (20 mg/L), L-Fenilalanin (50 mg/L), L-Treonin (100 mg/L), L-Triptofan (50 mg/L), L-Tirozin (50 mg/L), L-Valine (140 mg/L), Urasil (20 mg/L)). Bu kültürü %0,0002 arabinose ile desteklenen poliaminiçermeyen 500 mL'ye aktarın ve hücre kültürü 0,6-0.8'in OD600'ünü (genellikle ~5 saat) ulaşana kadar büyüyün.
  2. 4 °C'de 15 dakika boyunca 2.000 x g'de santrifüj ile hücre peletini toplayın. Peleti yeniden askıya alın ve 10 mM EDTA içeren 0,1 M potasyum fosfat tamponu, pH 6.6 ile üç kez yıkayın (Tampon 1). Üçüncü dönüşten sonra Tampon 1'deki hücrelerin son hacmi 10 mL olmalıdır.
  3. 35 mL Fransız basınç Hücresi kullanarak bozulmamış hücrelerin Fransız Basın tedavisi (10.000 p.s.i.) ile iç-dış membran veziküller oluşturun.
  4. Numuneyi standart Fransız basınç hücresine yüklemeden önce, hücreye daha kolay yerleştirilmesi için piston ve O-halkalarını yağlatın.
    Not:Bu talimatlar standart basınç hücresinin kullanımı için özeldir31.
    1. Kapatma fişini hücrenin alt ucuna dikkatlice vidaladı. Hücrenin yan tarafındaki harflere göre hücrenin sağ tarafta olduğundan emin olun. Pistonu hücreye takın ve pistondaki maksimum dolgu hattı pistonun üst kısmına ulaşana kadar hücreye taşıyın. Üniteyi ters çevirin ve sağlanan standın üzerine yerleştirin.
    2. Hücre süspansiyonu hücrenin vücuduna dökün.
      NOT: Biz sadece 10 mL kullanıyoruz, bu yüzden 35 mL kapasiteli Fransız basınç hücre odasında, oda bol kalacak.
    3. Standart basınç hücresini Fransız basınç hücresi ünitesine monte edin.
      1. Önce elektriğin kesişip kapandığını kontrol et. Panelin sol tarafında Oran Seçici anahtarı yer alan bir anahtar vardır. Üç pozisyonu vardır: Çalışma sonunda aşağı, daha küçük bir basınç hücresi kullanmak için düşük, ve yüksek standart Fransız basınç hücresi ile kullanılmak üzere. Fransız basını daha önce küçük hücreli olarak kullanılmışsa piston tamamen geri çekilmeyebilir. Bu anahtarı Aşağıolarak ayarlayın.
    4. Ünitenin arka tarafındaki RHS anahtarıyla makineyi açın ve Duraklat düğmesini Çalıştır konumuna getirin. Bu, pistonun tamamen geri çekilmesine neden olur. Anahtarı Duraklat'ageri taşıyın ve makineyi kapatın.
    5. Başparmak vidalarını gevşetin ve iki paslanmaz çelik kolona yayılan emniyet kelepçesini yana doğru hareket ettirin. Sağa doğru sallanacak. Bir elinizkapatma fişinin tabanını yerinde tutarak, Fransız basınç hücresini iki elinizle yukarı kaldırın ve 180° döndürün, böylece piston artık dik konumdadır. Platforma yerleştirin ve bu kelepçenin Fransız basınç hücresini pozisyonda tutması için güvenlik kıskacını yerine geri taşıyın.
    6. Kapatma fişindeki Akış Valfi tertibatının işletmeci tarafından erişilebilir olması ve valfin serbestçe çevrilebilmesi için konumlandırılması gerektiğini unutmayın. Akış valfi tertibatını saat yönünün tersine birkaç dönüşle açın. Pistonun kollarını iki ve sekiz yönünde yönlendirilen şekilde yerleştirin. Standart basınç hücresiyerinde tutulacak şekilde başparmak vidaları sıkın.
    7. Numune çıkış tüpünü kapatma fişe takın ve kırık hücre enkazının şahin tüpünde toplayabilmesi için kısa bir esnek boru parçası bağlayın. Biz genellikle şahin tüp dik tutmak için 300 mL buz dolu bir beher kullanın, ve hücre enkaz soğutulmuş tutmak için.
    8. Duraklatma anahtarının Duraklatolarak ayarlandıklarına ve valf tertibatının açık konumdaolduğundan emin olun. Makineyi tekrar açın, Oran Seçici'yi Yüksek'eçevirin ve ön paneldeki Basınç Artış Valfini yaklaşık yarım dönüşle sağa çevirin.
    9. Piston, odadaki havayı yerinden çıkarmak için üsten yükselmeye başlayacak. Örnek çıkış tüpüne bağlı Tygon borudan çıkan havayı kabın borusu yla yönlendirin.
    10. İlk sıvı damlaları çıktığında, akış valfi tertibatını saat yönünde çevirerek kapatın. Bu basınç hücresi ile metal mühür bir metal oluşturur, bu yüzden aşırı sıkmak yok.
    11. Fransız Basını'nın ön panelinde basınç hücresiiçindeki biyolojik hücreler üzerinde uygun basınç oluşturmak için bir grafik vardır. Bu durumda, Gösterge 640 psi'ye ulaşana kadar Basınç Artış Valfi'ni saat yönünde çevirerek basıncı artırın. Bu 10.000 psi bir iç basınç yaratacak.
    12. Hücre hedef basınca ulaştıktan sonra akış valfi tertibatını saat yönünün tersine çevirerek hafifçe açın. Vananın açılmasını, her dk başına sadece yaklaşık 10 damla akış hızı sağlayacak şekilde ayarlayın.
    13. Piston gövdesindeki stop çizgisi akış hücresinin tepesine ulaştığında. Duraklat-Çalıştır Anahtarını Duraklat'açevirin. Bu çok önemlidir, çünkü pistonun hücreye daha fazla yerleştirilmesi üniteye zarar verir. Akış valfi tertibatını açın ve kalan damlaları toplayın.
    14. Oran Seçici'yi Aşağı'yaçevir in ve ardından Çalıştır anahtarını Çalıştır'aayarlayın. Alt plaka tamamen geri çekildiğinde Çalıştır anahtarını Duraklatdüğmesine ayarlayın ve makineyi kapatın.
    15. Fransız basınç hücresini Fransız basınından çıkarın ve temizlik için sökün. Gliserol bir ışık kaplama ile kuru tüm parçaları saklayın. Herhangi bir conta veya contayı aşınma işaretleriyle çıkarın ve değiştirin.
  5. 4 °C'de 15 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüj ile Fransız basınının kırılmamış hücrelerini ve hücre enkazını çıkarın. Pelet atın ve ultracentrifuge tüpler için supernatant aktarın.
  6. 4 °C'de 1 saat için 150.000 g ultracentrifugationat tarafından ortaya çıkan supernatant pelet membran vezikülleri.
  7. Membran vezikülleri bir kez yıkayın, resuspension olmadan, 1 mM Tris-maleate, pH 5.2 içeren 0.14 M KCl, 2 mM 2-mercaptoetanol ve 10% gliserol ve aynı tampon resuspend (Tampon 2)23 bir Dounce doku öğütücü kullanarak. Tipik olarak 500 mL'lik kültürmembran fraksiyonu 5 mL tamponda, 5-10 mg membran protein/mL konsantrasyonu biokinik asit analizikullanılarak 32.
  8. -80 °C'de 100 μL membran preparatlarını 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde saklayın.

4. Batı Leke ve Taşıyıcı Tsay Oryantasyon

  1. 30 mM Tris pH 7.8 + 0.1 mM CoCl2'de3.7 adımdan vezikülleri yıkayın ve resuspend.
  2. 100 μL numuneye 0,1 M NaCl, 30 mM Tris, 0,2 mM CoCl2 pH 7,8'de 1 μL 2 mg/mL karboksipeptidaz ekleyin.
  3. 20 °C'de 20 dk kuluçkaya yatırın. 0,5 M NaEDTA 5 μL, 0,5 M 2-mercaptoetanol pH 7,5 ekleyerek sindirimi durdurun.
  4. Enzimi tam olarak inaktive etmek için, çözeltiyi oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.
    NOT: Catboxypeptidaz olmayan veziküller Kontrol olarak kullanıldı.
  5. Lityum dodecyl sülfat varlığında elektroforez ile örnekleri analiz edin. 150 mg/mL lityum dodecyl sülfat, 450 mg/mL gliserol, 0.1 mg/mL bromofenol mavisi, 0.4 M Tris pH 7.5 ila 100 μL numune ekleyin.
  6. Poliakrilamid jel üzerine 25 mM sodyum-hidrojen fosfat pH 7.5 ile nemlendirilmiş bir nitroselüloz filtre döşenerek immünoblotlama gerçekleştirin. İki nemlendirilmiş selüloz filtreler arasında ve son olarak iki nemlendirilmiş plastik ovma pedleri arasında yerleştirin. Bu ümyarayı 25 mM sodyum-hidrojen fosfat pH 7,5'i 2-4 °C'de içeren bir haznenin elektrotları arasına yerleştirin.
  7. Proteinlerin elektrotransferinin 20 V ve 2-3 A'da 3 saat boyunca devam etmesine izin verin.
  8. 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 ve 0,5 mg/mL Ara 2033blokaj tamponu ile nitroselüloz membranını gece boyunca 2 °C'de bloke edin.
  9. Nitroselüloz filtresini 2 saat boyunca 1:5000 adet Anti-His (C terminali)-HRP antikorunu bloke edici tamponda (20 mL) seyrelterek inkübe edin ve toplam 60 dakika boyunca 50 mL tamponla iki kez yıkayın.
  10. İmmünoblotu görselleştirmek için, 6 mg 4-kloro-1-naphthol'u 20 mL deatürayla çözün ve 80 mL 15 mM Tris pH 7.5 ve 50 μL %30 H2O2ekleyin. 20 dakika boyunca substrat çözeltisindeki filtre kağıdını yıka. Reaktif, nitroselüloz zarında mavi bir çökelti oluşturmak için antikorla reaksiyona girer. Yeterli renk geliştiğinde, membranı suyla durulayın ve kurumasını bekleyin.

5. Taşıma Tsası

  1. 12 °C'de 5 dakika boyunca 100 μL membran vezikülleri inkübün.
  2. Membran veziküllerine 50 μM'lik son konsantrasyonda radyoetiketli poliaminler ekleyerek taşımayı başlatın (aksi belirtilmedikçe). 10 mM Tris-HCl, 10 mM potasyum fosfat, pH 8.0 ve 0.14 M KCl23 (Tampon 3) modelini içeren bir hakem tamponunda 3H-substrat (spermidin veya putrescine) çözeltisi yapın.
  3. 1,5 mL mikrofuge tüplerinde 1 2 °C'de 1 dk taşıma tahlilleri gerçekleştirin.
  4. 1 dakika sonra reaksiyon karışımlarını filtrasyon manifolduna aktarın ve 0,45 μm nitroselüloz membran filtresinden süzün.
    1. Nonspesifik bağlamayı azaltmak için poliaminler olmadan 3 mL'lik bir arabellek ve ardından etiketlenmemiş poliaminlerin 10 kat daha yüksek konsantrasyonu içeren 3 mL buz gibi ar-sonuç tamponu ekleyin.
    2. Yıkanmış filtreleri 10 mL sintillasyon sıvısı içeren 20 mL tek kullanımlık sintillasyon şişelerine aktarın ve bir sıvı sintillasyon sayacı kullanarak radyoaktiviteyi belirleyin. Scintillation karşı örnekteki radyoaktiviteölçer ve min başına parçalanmaolarak raporlar (dpm).
  5. 12 °C'de kuluçkaya yatan veziküller tarafından 1 dk'daki alım arasındaki fark ve buzda kuluçkaya yatan veziküller tarafından 0 dk.'da alım arasındaki fark olarak net poliamin alımını hesaplayın.
    NOT: Veziküllere ithal substrat kütlesi aşağıdaki gibi hesaplanır. Mikrofuge tüpündeki numune hacmi 0.2 μL ve substrat başlangıç konsantrasyonu 100 μM ise, mikrofuge tüpündeki substrat toplam kütlesi 20 x 10-12 M'dir. Ticari olarak etiketlenmiş substratların (genellikle 2,22 x 109 dpm/mM) çok yüksek özgül aktivitesi nedeniyle, eklenen izotopun kütlesi hesaplamada göz ardı edilebilir. Yani mikrofuge tüpüne eklenen izotopun toplam miktarı 100 x 106 dpm ve veziküllerin net alımı 1.000 dpm ise, veziküller tarafından alınan substrat toplam kütlesi substrat veya 2 x 10-13 M'lik mol lerin toplam sayısının %1'i idi.
    1. Hedef proteini ifade eden veziküllere 10, 25, 50, 250 ve 500 μM radyoetiketli substrat alımını ölçerek substrat için Km'yi belirleyin. İstatistiksel yazılım paketi34Michaelis Menton modelini kullanarak doğrusal olmayan bir regresyon yöntemi kullanarak Michaelis-Menten kinetik hesaplayın.
  6. Yarışma deneyleri için, 100 μM, 500 μM, 1 mM, 1,5 mM veya 2 mM etiketsiz rekabetçi substrat ı 12 °C'de 100 μL vezikül içeren 1,5 mL mikrosentrifuge tüpüne deneme tamponuna ekleyin.
    1. Mikrosantrifüj tüpüne aynı anda radyoetiketli poliamin (50 μM) ekleyin.
    2. Yukarıda belirtildiği gibi veziküllerin içinde sıkışıp kalan radyoaktiviteyi 5 ile 5.4.2 adımlarını tekrarlayarak ölçün.
    3. 100 μM veya daha yüksek etiketsiz substrat varlığında 10, 25, 50, 250 ve 500 μM radyoetiketli poliaminalımalımını ölçerek ve eğriyi çizmek için doğrusal olmayan bir regresyon yöntemi kullanarak rekabetçi yüzeyler için belirgin Km (Km,app)belirleyin.

Sonuçlar

Bu protokoldeki önemli adımlar Şekil 1'deresimsel olarak özetlenmiştir. Kısaca, Tüm poliamin eşanjörleri eksik ve AtBAT1 ifade E. coli hücreleri kültürlü, santrifüj, bir tampon ile yıkanmış ve bir Fransız basın ıslatır tabi. Lysis çoğunlukla iç-dış veziküller üretmek ve hücrelerin dışında tampon tuzak eğilimindedir. Hücre enkazı santrifüj ile kaldırılır ve ikinci bir ultracentifugation adım bir membran...

Tartışmalar

Bu çalışmada, önce E. coli'deki proteini ifade ederek ve daha sonra membran vezikülleri üreterek bir antiporterın karakterizasyonu için bir yöntem özetleyilmiştir, böylece heterolog olarak ifade edilen protein hücresiz bir sistemde doğrulanabilir. Çoğu moleküler biyoloji laboratuvarında bulunan ekipmana ek olarak, bu strateji bir Fransız basını, ultracentrifuge ve radyoizotop tahlilleri yapmak için bir tesise erişim gerektirir.

Bu tekniğin temel gereksinimlerin...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu proje için destek BGSU Graduate College ve BGSU Ofis Sponsorprogramları ve Araştırma geldi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mercaptoethanolSigma-AldrichM6250
3H-putrescinePerkinElmerNET185001MC
3H-spermidinePerkinElmerNET522001MC
4-chloro-1-naphtholSigma-AldrichC8890
14C arginineMoravek Inc.MC137
ArginineSigma-AldrichA-5006
Anti-His (C-term)-HRP antibodyThermoFisherR931-25Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl
group for detection
ArabinoseSigma-AldrichA3256
BCA protein assay kitThermoFisher23227Pierce BCA protein asay kit.
Bromophenol blueBio-Rad161-0404
Carboxypeptidase BSigma-AldrichC9584-1mg
CentrifugeSorvallSS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor
Dounce tissue grinderLabGenome7777-7Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout.
Ecoscint-HNational DiagnosticsLS275scintillation cocktail
EDTASigma-Aldrich
Filtration manifoldHoeferFH225V
French Pressure CellGlen MillsFA-080A120
GABASigma-AldrichA2129
GlutamateSigma-AldrichG6904
Glycerol
GraphPad Prism softwarehttp://www.graphpad.com/prism/Prism.htm
Hydrogen peroxideKROGER
Potassium ChlorideJ.T. Baker3040-01
Liquid scintillation counterBeckmanLS-6500
MaleateSigma-AldrichM0375
NanodropThermoFisher
Nitrocellulose membrane filtersMerck Milliporehawp025000.45 µM
PCR clean up kitGenscriptQuickClean II
Potassium Phosphate dibasicThermoFisherP290-500
putrescinefluka32810
Potassium Phosphate monobasicJ.T.Baker4008
SpermidineSigma-aldrichS2501
Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10This manuscriptAvailable upon request.Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers.
Tris-baseResearch ProductsT60040-1000
UltracentrifugeSorvall MTX 15046960Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor
Ultracentrifuge tubesThermoFisher45237Centrifuge tubes for S150-AT rotor
Vector: pBAD-DEST49ThermoFisherGateway expression vector for E. coli

Referanslar

  1. Haferkamp, I., Linka, N. Functional expression and characterisation of membrane transport proteins. Plant Biology (Stuttgart). 14 (5), 675-690 (2012).
  2. Sauer, N., Caspari, T., Klebl, F., Tanner, W. Functional expression of the Chlorella hexose transporter in Schizosaccharomyces pombe. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (20), 7949-7952 (1990).
  3. Sauer, N., Stolz, J. SUC1 and SUC2: two sucrose transporters from Arabidopsis thaliana; expression and characterization in baker's yeast and identification of the histidine-tagged protein. The Plant Journal. 6 (1), 67-77 (1994).
  4. Weber, H., Borisjuk, L., Heim, U., Sauer, N., Wobus, U. A role for sugar transporters during seed development: molecular characterization of a hexose and a sucrose carrier in fava bean seeds. Plant Cell. 9 (6), 895-908 (1997).
  5. Huang, J. G., et al. GhDREB1 enhances abiotic stress tolerance, delays GA-mediated development and represses cytokinin signalling in transgenic Arabidopsis. Plant, Cell & Environment. 32 (8), 1132-1145 (2009).
  6. Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiology. 122 (4), 999-1001 (2000).
  7. Garcia-Mata, R., Bebok, Z., Sorscher, E. J., Sztul, E. S. Characterization and dynamics of aggresome formation by a cytosolic GFP-chimera. Journal of Cell Biology. 146 (6), 1239-1254 (1999).
  8. Liu, J., Sitaram, A., Burd, C. G. Regulation of copper-dependent endocytosis and vacuolar degradation of the yeast copper transporter, Ctr1p, by the Rsp5 ubiquitin ligase. Traffic. 8 (10), 1375-1384 (2007).
  9. Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).
  10. Schachtman, D. P., Schroeder, J. I., Lucas, W. J., Anderson, J. A., Gaber, R. F. Expression of an inward-rectifying potassium channel by the Arabidopsis KAT1 cDNA. Science. 258 (5088), 1654-1658 (1992).
  11. Boorer, K. J., Forde, B. G., Leigh, R. A., Miller, A. J. Functional expression of a plant plasma membrane transporter in Xenopus oocytes. FEBS Letters. 302 (2), 166-168 (1992).
  12. Miller, A. J., Zhou, J. J. Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters. Biochimica et Biophysica Acta. 1465 (1-2), 343-358 (2000).
  13. Reinders, A., Sivitz, A. B., Starker, C. G., Gantt, J. S., Ward, J. M. Functional analysis of LjSUT4, a vacuolar sucrose transporter from Lotus japonicus. Plant Molecular Biology. 68 (3), 289-299 (2008).
  14. Kovermann, P., et al. The Arabidopsis vacuolar malate channel is a member of the ALMT family. The Plant Journal. 52 (6), 1169-1180 (2007).
  15. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  16. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211-222 (2006).
  17. Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. Journal of Molecular Biology. 260 (3), 289-298 (1996).
  18. Wagner, S., et al. Consequences of membrane protein overexpression in Escherichia coli. Molecular & Cellular Proteomics. 6 (9), 1527-1550 (2007).
  19. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), e29191 (2011).
  20. Takabatake, R., et al. Isolation and characterization of cDNAs encoding mitochondrial phosphate transporters in soybean, maize, rice, and Arabidopis. Plant Molecular Biology. 40 (3), 479-486 (1999).
  21. Picault, N., Palmieri, L., Pisano, I., Hodges, M., Palmieri, F. Identification of a novel transporter for dicarboxylates and tricarboxylates in plant mitochondria. Bacterial expression, reconstitution, functional characterization, and tissue distribution. Journal of Biological Chemistry. 277 (27), 24204-24211 (2002).
  22. Snowden, C. J., Thomas, B., Baxter, C. J., Smith, J. A., Sweetlove, L. J. A tonoplast Glu/Asp/GABA exchanger that affects tomato fruit amino acid composition. The Plant Journal. 81 (5), (2015).
  23. Kashiwagi, K., Igarashi, K. Identification and assays of polyamine transport systems in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 720, 295-308 (2011).
  24. Kashiwagi, K., Miyamoto, S., Suzuki, F., Kobayashi, H., Igarashi, K. Excretion of putrescine by the putrescine-ornithine antiporter encoded by the potE gene of Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (10), 4529-4533 (1992).
  25. Tsuchiya, T., Rosen, B. P. Calcium transport driven by a proton gradient and inverted membrane vesicles of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 251 (4), 962-967 (1976).
  26. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
  27. Nichols, B. P., Shafiq, O., Meiners, V. Sequence analysis of Tn10 insertion sites in a collection of Escherichia coli strains used for genetic mapping and strain construction. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6408-6411 (1998).
  28. . P1vir phage transduction Available from: https://openwetware.org/wiki/Sauer:P1vir_phage_transduction (2011)
  29. . pBAD-DEST49 Gateway Destination Vector Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12283016 (2010)
  30. Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: a laboratory Manual. , (2012).
  31. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using biochinic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  32. Wright, J. K., Overath, P. Purification of the lactose: H+ carrier of Escherichia coli and characterization of galactoside binding and transport. European Journal of Biochemistry. 138 (3), 497-508 (1984).
  33. . GaphPad Software Available from: https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/ (2019)
  34. Kirchberger, S., et al. Molecular and biochemical analysis of the plastidic ADP-glucose transporter (ZmBT1) from Zea mays. Journal of Biological Chemistry. 282 (31), 22481-22491 (2007).
  35. Deniaud, A., et al. Expression of a chloroplast ATP/ADP transporter in E. coli membranes: behind the Mistic strategy. Biochimica et Biophysica Acta. 1808 (8), 2059-2066 (2011).
  36. Sze, H. H+-Translocating ATPases: Advances Using Membrane Vesicles. Annual Review of Plant Physiology. 36, 175-208 (1985).
  37. Bush, D. R. Proton-coupled sugar and amino acid transporters in plants. Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology. 44, 513-542 (1993).
  38. Futai, M. Orientation of membrane vesicle from Escherichea coli prepared by different procedures. Journal of Membrane Biology. 115, 15-28 (1974).
  39. Seckler, R., Wright, J. K. Sideness of native membrane vesicles of Escherichea coli and orientation of the reconstituted lactose: H+ carrier. European Journal of Biochemistry. 142 (2), 269-279 (1984).
  40. LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli. Methods in Enzymology. 326, 322-340 (2000).
  41. Goodman, D. B., Church, G. M., Kosuri, S. Causes and effects of N-terminal codon bias in bacterial genes. Science. 342 (6157), 475-479 (2013).
  42. Wacker, M., et al. N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyokimyaSay 154Membran ta y cantiporterpoliamin ta mapoliamin de i tiricimembran vezik llerFrans z bas nkinetik analizradyoizotop ta ma testleriGABA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır