קן התנהגות בניין כאינדיקציה מוקדמת של התנהגות בעכברים

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת התנהגות בניין בעכברים, אשר ידוע כי לקויי מספר הפרעות נוירולוגיות ומחלות. פרוטוקול זה בוחן את כלי השירות של ארבעה חומרים ומציע את ההזדמנות לכמת את הסכם ה-דרג בניקוד, שיפור התוקף והאמינות של השיטת.

Abstract

בניית הקן היא התנהגות מולדת אצל מכרסמים זכריים ונקביים, גם כאשר הם גדלים במסגרות מעבדה. משום כך, חוקרים רבים מספקים מכרסמים סינתטיים ו/או חומרים טבעיים (כגון חוט, רקמה, כותנה, נייר וחציר) כאמוד של הרווחה הכללית שלהם וכהערכה מרובה לחיזוי הירידה האפשרית בהכרה. בדרך כלל, שינויים בהתנהגויות קינון, כגון כשל ביצירת הקן, מציינים שינוי בתקינות או ברווחה. בנוסף, התנהגות מקננת רגישה לאתגרים סביבתיים ופיסיולוגיים רבים, כמו גם מוטציות גנטיות רבות המשמשות כבסיס למצבי מחלה פתולוגיים. הפרוטוקול הבא מתאר פרדיגמה של התנהגות קינון החוקרת את השימוש בארבעה סוגים של חומר קינון. בנוסף, הפרוטוקול מנצל את מערכת היחסים התאיים כדי להדגים כי האמינות הבין-מתקדמת גבוהה יותר כאשר הקנים בנויים מתוך נייר מגורר בהשוואה לחומרים מקוננים אחרים, כגון ריבועים כותנה, מסובב נייר, ותירס רך מצעים. המתודולוגיה שנבחרה ושיקולים סטטיסטיים (כלומר, המתאם התאיים) לצורך שיטה זו עשויה להיות עניין של הניסויים האלה הערכה את איכות החיים של עכברים.

Introduction

בניית הקן היא התנהגות מולדת בעלי חיים רבים כגון ציפורים, דגים, מכרסמים, וקופים גדולים, והוא מושך יותר תשומת לב עבור השירות הפוטנציאלי שלה במחקר של מחלות נוירולוגיות והפרעות המאופיינת ברווחה מופחתת ולקויי פעילויות של היומיום¹. עכברים, זכר ונקבה, בונים קינים בגודל דומה למטרות הרבייה, שימור חום ומקלט; חשוב יותר, הם ממשיכים לעשות זאת גם כאשר גדל בהגדרות מעבדה². הס, פטרוביץ וגודווין³ טוענים שגירויים מתאימים לבחינה ביולוגית הם בעלי חשיבות עליונה לגרום להתנהגויות מתאימות ביולוגית כגון קינון; עם זאת, מגוון של חומרים טבעיים ומלאכותיים, כגון חציר, קנבוס, חוטי כותנה, מפצלי נייר, כדורי שיניים כותנה, וריבועים לחצה כותנה, שימשו כדי להעריך את התנהגות בניין הקן². שינויים בהתנהגויות הקינון הללו (כלומר, כשל ביצירת קן מחוץ לחומר המסופק) מצביעים בדרך כלל על שינוי בבריאות או ברווחה. ברוב המקרים, חוסר בניית הקן מיוחס למספר גורמים המשפיעים לרעה על רווחתם. דוגמאות כאלה, כי כל הצטמצמה באופן יעיל את האיכות של בניין הקן בעכברים כוללים הקיצוניויות טמפרטורה; גירוי מכאיב; מחלות וזיהומים מזורזת; מוטציות גנטיות; ונגעים במוח באזורים המדיאופטיים, מחיצת, והיפוקמפוס^4,5,6.

מחלת אלצהיימר היא מחלה ניווניות מתקדמת המאופיינת באובדן של רקמת המוח, הצטברות של הפלאק עמילואיד בβ, ו neurofibrillary התאיים סבך הלחין מיקרוטובית הקשורים היפרזרחנת חלבון, טאו⁷. בנוסף, מחלת האלצהיימר מתאפיינת, בעיקר, ליקויי למידה וזיכרון וליקויים של פעילויות של היומיום. בעכברים, פעילויות של היומיום נבדקים בדרך כלל באמצעות גלגל אחראי^8,9,10,11, למרות חלופות חדשות, כגון קינון, גדלים בפופולריות. קינון הוכח להיות רגיש למניפולציות (למשל, מוטציות גנטיות, לחצים סביבתיים) כי זוהו כגורמי סיכון ו/או גורם למחלת האלצהיימר. ככזה, ניתן להשתמש בקינון כערך נוסף או משלים בזנים רבים של העכבר המודל המאפיינים של מחלת אלצהיימר. לדוגמה, דיקון ועמיתיו¹² מדדו בניין הקן של עכברים Tg2576 עם חלבון עמילואיד שוודי מקודמן (appswe) ונוכחות 1 (PS1) מוטציות גנטיות. האיכות של קנים שנבנו על ידי הקבוצה שוכנו עכברים Tg2576 היה גרוע באופן משמעותי מאשר שולטת הסוג בשני 3-ו 12 חודשים של גיל. בהסכם עם ממצאים אלה, Filali ואח '¹³ דיווח כי שוכנו באופן ברור PS1 עכברים זכר שניתנו שתי חתיכות של כותנה 5 x 5 ס מ שנבנו קנים עניים משמעותית כפי שדורג בקנה מידה של 1-5 (1 = נסטלה לא נגע, 5 = כמעט קן מושלם). עכברים טרנסגניים הקימו בעקביות קינים גרועים יותר בשש-, 9-, ו -12 חודשים של גיל לעומת עמיתיהם מסוג wildtype להם, ובמקרים מסוימים, העכברים Appswe/נכשלו לחלוטין לבנות קן מתוך כותנה שסופקו.

המחקר הקודם מהמעבדה שלנו הוכיחה כי wildtype C57BL/6J עכברים לבנות באופן משמעותי קינים טוב יותר מריבועים כותנה לעומת CRND8 ו CRND8/E4 עכברים⁹. עם זאת, רוב הניסויים באמצעות לחצה ריבועים כותנה להיראות משתנה, עם עכברים ומסוג להיכשל להראות ציונים גבוהים צפויים לעומת עכברים טרנסגניים כי צפויים להראות ציונים נמוכים מאוד קינון², אשר עשוי חלק להוביל ל חוסר הבדלים בפרמטרים מוערכים (דהיינו, הבדלים משמעותם) ומשמעות סטטיסטית. העדר הבדלים עשויים להיות מגיע בחלקו להזדקנות מספקת של עכברים או זמן המוקצב לקינון. לחילופין, חומר קינון עשוי להיות אתגר נוסף, וכתוצאה מכך השתנות יותר בשל ההעדפות מתודולוגיים של החוקרים בכמות וסוג של חומר, אשר עשוי אפילו לתקשר עם מאמץ העכבר. לדוגמה, רובינסון-ג'ונקר ועמיתיו¹⁴ סיפקו חומר מיטה או מצעים לא מעובדים בגדלים שונים (כלומר, שבבים קטנים או גדולים) לעכברים C3H/hencrl ועכברים balb/קניובים, הנצפים בדרך כלל, בהתאמה, כעניים וחזקים קן בונים. כאשר סיפקה מצעים לא מעובד, עכברים C3H נבנו פחות מורכבים, אך דומים בקני איכות לעומת אלה של עכברים BALB/c.  כמו כן, מרטין ועמיתיו¹⁵ מורכבות הקן לעומת המורכבות של חומרי קינון שונים שניתנו עכברים צבאים, קרוב מאוד של מינים Mus מוסקולוס כי יש הבדלים האבולוציה ברורים (כלומר, סביר יותר לחפור בעצים ו מברשת התחתונה הם פעילים יותר בשבי), אבל לקבל טיפול בגידול דומה כמו עכברים מעבדה נפוצים ולבנות קנים מתוך כל חומר רך, סיבי,^16,17,18.  נשים ומגדלים עם כלבלבים בכלוב הבית מבנה קנים מורכבים יותר מאשר הזכרים, והמחברים מראים כי הבדלים אלה התנהגותיים עשויים להיות עקב שינויים הקשורים ריכוזי פרוגסטרון בעכברים צבאים¹⁵. וחשוב מכך, עכברים בנו קנים מורכבים יותר המורכבים מנייר חום ולאחריו משבצות כותנה וצילינדרים, והקנים הפחות מורכבים נבנו מנייר לבן וריבועים מפוזרים מיני כותנה.

למרות הפופולריות הגוברת של קינון, שיקולים בדבר חוקי באופן מדעי, חסכוני, ונהלים רגישים לזמן הם דנים מינימלית. בהינתן האתגרים המתודולוגיים והחסכוניים לעיל, פרוטוקול זה חוקר את כלי העזר של חומרי קינון שונים – ריבועי כותנה, מסובב נייר, נייר מגורר ומצעים מעובדים – בהתנהגות מקננת. באופן ספציפי, סיפקנו את כל חומרי הקינון לשני C57BL/6J בקרות wildtype ומחלת אלצהיימר APOE e4 עכברים כדי לחקור כל גנוטיפ פוטנציאלי על ידי אינטראקציות חומרים באיכות קינון. בנוסף, הניסוי ביקש להעריך את האמינות הבין-ממדי של קנים שנבנו מחומרים שונים. יחד עם זאת, פרוטוקול זה ממחיש את עליונותה של חומר קינון אחד במדגם זה – נייר מגורר-במונחים של איכות הקן והסכם השערים, במטרה לשפר את התוקף והאמינות של הקינון.

Protocol

כל ההליכים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת ג'ורג ' מייסון ולהשתמש בהתאם להנחיות המפורטות על ידי הערכה והסמכה של טיפול בבעלי חיים במעבדה.

1. בעלי חיים ושיקולים לפני ההערכה

1. עבור פרוטוקול זה, להשתמש במבוגר, 9-12-month-C57BL/6J (n = 10) (מניות 000664) עכברים מסוג ועכברים E4 apoe (n = 11) מ hemizygous J20 (מניות #006293) x homozygous apoe e4 (מניות #012307) צלב.
2. בחדר המגורים, עכברים בבית הקבוצה עם כוכבים של אותו המין עם העשרה הולמים (למשל, עבור פרוטוקול זה, העכברים סופקו גלגל פועל, איגלו, ו צעצוע ללעוס ניילון קטן). קבוצה-בית 4-6 נקבה עכברים, ו 4 זכרים ב 356 מ"מ L x 485 mm W x 218 מ"מ בבית כלוב.
   הערה: החוקרים עשויים לשקול ליישם אסטרטגיות לפני ו/או לאחר הקינון כדי למנוע תוקפנות של כלוב-mate כאשר העכברים מוצגים מחדש לאחר משפטי קינון. אסטרטגיות כאלה עשויות לכלול, אך אינם מוגבלים, הטיפול היומי לפני בדיקות התנהגותיות לעכברים הטוב יותר התאקלם לטיפול במהלך בדיקות התנהגותיות, חוקרים, צוות הגידול¹⁹, הפרדה בנפרד הדיור עכברים אגרסיביים, או להקטין את מספר העכברים בתוך²⁰, בהתאם לחומרת הלחימה בכלוב, הבחין פצעים²¹, וכו '.

2. הגדרת חדר וקינון

1. ודא שכל אחד משני העכברים משלים ארבעה מבחנים (חומר אחד לכל ניסיון). באקראי את סדר החומר הקינון עבור כל עכבר כדי למנוע אפקט הזמנה.
2. הכן את הכלובים בחדר בדיקה נפרד. שיא תנאי הסביבה (g., 22.2 – 22.3 ° c, 45-47% לחות, אורות ב 9:00 AM – 9:00 PM) כך שהם עקביים באמצעות מבחנים וזהים לחדר המגורים. לספק מזון ומים libitum המודעה.
   1. הקצה לכל עכבר מספר זיהוי אקראי (ID) או מכתב. חבר את כרטיס המזהה האקראי לכלוב של 29.2 x 18.4 ס מ.
   2. הקלט את מזהה החיה המקורי/תג וזיהוי הכרחי אחר ברשומת המושבה כדי להבטיח כי עוזרים וצוות הגידול בעלי חיים יישארו עיוורים לתנאים.
3. הזמנת באופן אקראי מיקום כלוב בחדר הבדיקות כגון אלה מסוג wildtype עכברים הטרנסגניים אינם מופרדים במקום (כלומר, בצדדים מנוגדים של החדר, על מדפים נפרדים, וכו ').
4. הכן את חומרי הקינון על-ידי כיסוי מספיק לתחתית הכלוב. השתמש כ 100 g יבש במשקל של מצעים תירס עבור הכיכר, טוויסט, ומבחנים נייר מגורר, ו כ 100 g של מצעים קלח רך עבור המשפט קלח רך.
5. אם משתמשים בגביע כדי לפזר את החומר הקינון, לאחר מכן למלא את הגביע לא יותר מ 100 mL עם מצעים תירס או מצעים התירס רך.
6. מניחים את החומר הקינון הראשון ברצף לפני החדרת העכבר לתוך הכלוב. פרוטוקול זה מנוצל (1) ריבוע כותנה אחת לחצה, (2) טוויסט נייר אחד, (3) 100 גרם של מצעים תירס רך בלבד (כלומר, אין מצעים נוספים או חומר קינון נוסף), ו (4) 2.5 g של נקי (ללא דיו), נייר מדפסת לבן מגורר לחתוך 5 – 7cm רצועות. פזר חומרי קינון כמוצג באיור 1 (קו בסיס).

איור 1: הגדרת כלוב עבור כל חומר. כל העכברים השלימו משפט אחד עם כל סוג של חומר עבור סך של ארבעה מבחנים. מצעי קורקוב מסודרים בתחתית הכלובים כולה, המכילה טוויסט נייר, ריבוע כותנה מכבישה ונייר מגורר. מצעי תירס רכים התפזרו באופן שווה על פני הכלוב כדי לעודד עכברים להפריד את ריבועי הכותנה הקטנה מקלח התירס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

3. משפט קינון

1. התחל את המשפט הקינון הראשון באותו הזמן של היום בתחילת מחזור האור (למשל, 9:00 AM).
2. הביאו את החומה המכילה את העכברים לחדר הבדיקות. הסר כל עכבר מתוך הבית ומניחים אותו לתוך כלוב הקינון המוקצה לו עם החומר שכבר הוצב בכלוב. . החזר את החומה לחדר המגורים
3. אפשר לעכברים להשלים משפט 1 עבור 24 שעות הפרעה.
4. 24 שעות אחרי תחילת המשפט הראשון חזרו לחדר הבדיקות.
5. הסר בזהירות את המכסה של הכלוב ולצלם את הקן של כל עכבר, לכידת את המזהה המוקצה בתמונה ולמזער את המראה של כל החומרים מחוץ לכלוב.
   הערה: המתן לעכבר כדי להזיז את הקן לפני שהוא מנסה להסיר אותו מהכלוב. מומלץ מאוד לצלם את הקן בזמן שהעכבר נמצא בכלוב אך מחוץ לקן. ניסיון להסיר את העכבר מהכלוב לפני הצילום יכול לגרום לעכבר להיות מבוהל, ובכך לנוע על גבי, ולהתפזר, חומרים מקוננים.
6. הסר בעדינות את העכבר מכלוב הקינון ומקם אותו בכלוב מחזיק זמני. היפטר מהמצעים ומכל חומרי הקינון, החליפו את המצעים וספקו את חומר הקינון הבא ברצף, והחזר את העכבר לכלוב הקינון.
7. חזור על הנדרש כדי לקבל ציונים עבור כל 4 הנסיונות. מומלץ להשתמש בנייר מגורר ובקריטריוני הניקוד הנלווים, למרות שייתכן שחוקרים מעוניינים להשתמש בחומרים החלופיים הנדונים בפרוטוקול זה.
8. כאשר כל הניסויים הושלמו, להחזיר עכברים לכלובים הבית שלהם. צפו בעכברים להתנהגות. תוקפנית פוטנציאלית תוקפנות עלולה להתרחש אצל זכרים ישנים יותר מסוג wildtype
   הערה: לצורך פרוטוקול זה נבדקו עכברים פעם אחת בגיל 9 עד 12 חודשים. קינון יש להתנהל בגילאים שונים (כלומר, בגיל מוקדם יותר, תלוי המתח הנבחר, לפני תחילת התכונות גמישות פנוטיפית) כדי לתעד את הירידה ביכולת קינון לאורך זמן ולהדגים את תפקיד סיבתי סביר של ניוון נוירו.

4. הניקוד והערכה של אמינות בין-מדרג

1. לספק תמונות בסיסיות עבור כל חומר קינון לפחות 2 אנשים עיוורים למחקר. למרות שאין צורך בכך, ודא שהscorers מכירים את הרעיון של קינון. כאשר האימונים מספקים סדרה של קינים לדוגמה (למשל, איור 2 עבור נייר מגורר) כדי להכיר את ההדרים עם כל סוג של חומר (אם רלוונטי) וקריטריוני הניקוד.
   1. הערכת כל הקן בקנה מידה של 1 – 5 באמצעות מידע בקנה מידה הבא (המותאם מדיקון, 2006)². ראה איור 2 כניקוד לדוגמה באמצעות נייר מגורר.
   2. הקצאת ציון של 1 כאשר הנייר המגורר או הריבועים הקטנים נותרו פזורים בכלוב, או כיכר הכותנה או פיתול נשארו ללא שינוי;
   3. להקצות ציון של 2 כאשר חלק מהחומר נבנה בקן, אבל מעל 50% של החומר לא היה שימש בנייה הקן (כלומר, נשאר מפוזרים או רוב החומר המקורי נותרו ללא שינוי);
   4. להקצות ציון של 3 כאשר הקן מורגש נבנה, אבל כמה יצירות עדיין היו מפוזרים;
   5. להקצות ציון 4 כאשר כמעט כל החומר שימש את הקן, אבל כמה חתיכות של חומר נותרו מפוזרים או היו ליד הקן;
   6. הקצה ניקוד של 5 כאשר כל החומרים שימשו כדי ליצור קן הניתן לזיהוי.
      הערה: מומלץ לקחת הפסקות ולבקר בתמונות בסיסיות כדי למנוע עייפות והטיה במהלך הליך הניקוד. הם לא צריכים לדון בציונים אחד עם השני כדי למנוע הטיה. מומלץ לדון בציונים לאחר שהניקוד יושלם, או אם יש צורך בדיון נוסף כדי לשנות את התוצאות, דבר שעלול לפתור בעיות ביחסים בין-תאיים (ICC). היחסים התאיים יתנהלו באמצעות השלבים המפורטים בסעיף 4.2.

איור 2: דוגמה של הבקיע באמצעות הקריטריונים של נייר מגורר, החומר המועדף. משמאל לימין: 1 – הנייר הגרוס נשאר ללא שינוי; 2 – חלק מהנייר נבנה לקן אך רוב החלקים נותרו מפוזרים; 3 – קן מורגש נבנה, אבל כמה יצירות עדיין היו מפוזרים; 4 -רוב החלקים שימשו לקן, אבל כמה חלקים היו פזורים ליד הקן; 5 – כל החלקים שימשו כדי להפוך את הקן. שים לב כי בתמונות, מספר מוקצה של בעל החיים מוצג כדי למנוע הסרת מסנוור. הצבע של הכרטיס הוא אקראי. החוקרים צריכים לאפשר לעכבר להישאר בכלוב כדי למנוע את העכבר המדהים, אשר עלול לפזר את הקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

2. לאסוף ולקבל קלט ולעצב את קובץ הנתונים כך שכל הציונים של כל השערים עבור כל חומר הם בעמודות נפרדות.
   הערה: אם נעשה שימוש בקובץ משלים 1, הינכם מתבקשים לשים לב כי קוד הקידוד עבור ניתוח זה דורש חינם, תוכנות קוד פתוח (g., החבילה Irr ב rstudio)^22,23. קובץ ה-script מסיר כותרות עליונות ומשתני נושאים (כלומר, השורה העליונה ומזהי בעלי החיים) כדי לבצע את הקורלציה התאיים (ICC). הפעל את קובץ ה-script כדי לנהל דו-כיוון, הסכמה, ממוצעים מדדים את ICC על-ידי סימון המקטע התחום של הקוד ופגיעה ב-Ctrl + Enter או Command + Enter.
3. השווה את ICC לקריטריונים קיימים^24,25,26. בדרך כלל, ערכי ICC מעל 0.80 מתאימים למהימנות בין-מדרג חזקה, המצדיקים את הניקוד לפי הממוצע בנקודת זמן נתונה (קובץ משלים 2).
4. השתמש באותם קריטריוני ICC עבור אמינות פנים-מאטר, שעשוי להיות מעניין עבור הניקוד המבצע בפעם הראשונה.
   התראה: מומלץ להבקיע את הקנים המצלמים בתוך שבוע של ההערכה הראשונית. המשך בזהירות בחישוב ממוצע נתונים כאשר ICC נמוך, מאחר שפעולה זו עשויה להטות נתונים או להפיק ממצאים ריקים. אם ערכי ICC נמוכים, אז (1) הכשרה נוספת עבור הגבוהים יכול להיות נדרש, (2) הגבוהים אולי צריך לדון ההיגיון שלהם עבור ציונים, (3) בודק עצמאי אחר עשוי להיות צורך לבצע שיקול דעת לגבי הציונים, או (4) פנים-מרובע ייתכן שיהיה צורך להעריך את המהימנות. אם מהימנות פנים-שונות נמוכה, ייתכן שתידרש הכשרה נוספת או הוספת משערים שונים.

5. שיקולים סטטיסטיים

1. בצע ניתוחים סטטיסטיים בהתאם לצורך. עבור נתונים שאינם מפרים הנחות נורמליות, אלא משתמשים בחומרים מרובים עבור כל עכבר (כלומר, אפקט בתוך הנושאים), השתמש בניתוח מעורב של סטיה (ANOVA).
   1. אם השימוש בקודים המסופקים כקבצים משלימים, אנא הורד חבילות תוספת נוספות המצוינות ב-script^27,28,29,30.
   2. אם ביצוע של ANOVA מעורב באמצעות הסקריפט שסופק, הפעל את ה-script כדי להמיר קבצי נתונים בתבנית רחבה לתבנית ארוכה (כלומר, במקום משתנים החוזרים על-פני עמודות, המר את התאים כך שיחזרו על-פני שורות). קובץ נתונים לדוגמה נכלל בכתב יד זה כדי להדגים כיצד להמיר קובץ נתונים מתבנית רחבה לתבנית ארוכה.
   3. נהל את ה-ANOVA המעורב, כפי שצוין בקובץ ה-script. שים לב שאם מבחן הספרוגניות של מאוולי מופר, ולאחר מכן ליישם גורמי תיקון כגון תיקון חממה-Geisser.
   4. לנהל את כל המבחנים הנחוצים כדי לבחון הבדלים בין גורמים עם יותר מ 2 רמות, כפי שצוין בסקריפט קידוד. בדוגמה זו, התנהלות בדיקת בונפררוני באמצעות מבחנים כדי להשוות בין סוגים שונים של חומר קינון.
      הערה: אם תשתמש רק בחומר קינון אחד, לא תכלול פקטור פנימי. עם זאת, אם איסוף נתונים בנקודות זמן מרובות, שילוב פעולות חוזרות אלה כאילו רמות של פקטור בתוך הנושאים.
      הערה: במקרים מסוימים, עכברים שעשויים להיות מושלמים הציונים ובכך יהיה להפגין אפקט התקרה, המוביל התפלגות לא נורמלית². שקול בדיקות סטטיסטיות מתאימות (לדוגמה, בדיקות לא פרמטרית עם אמצעים חלופיים של נטייה ופיזור מרכזיים), שיטות נורמליזציה או גישות חזקות (מידול אפקטים מעורבים לפעולות חוזרות) בעת ניתוח נתונים.

תוצאות

תוצאות מארבעת חומרי קינון שונים שסופקו wildtype ו-APOE e4 עכברים מוסברים כדלקמן. בהתבסס על הקריטריונים הקיימים, ICC הראו הסכמה חזקה בין שלושת השחקנים לכל ארבעת חומרי הקינון (נייר מגורר icc = 0.94; מרובע ICC = 0.91; מצעים Icc = 0.87; טוויסט icc = 0.87); לכן, שלושת הציונים היו יחד בממוצע כדי ליצור ניקוד אחד עבור כל חומר המסופק. A 2 x 4 מעורב ANOVA הניב השפעה עיקרית משמעותית של גנוטיפ, F(1, 19) = 31.30, p < 0.01, המשך² = 0.62. על פני כל ארבעת החומרים שסופקו, עכברים מסוג wildtype הבקיע גבוה יותר על איכות הקן (3.18 ± 0.20) לעומת העכברים e4 APOE (1.98 ± 0.16). בנוסף, ANOVA מעורב הניב השפעה עיקרית משמעותית של חומר, F(3, 57) = 57.48, p < 0.01, המשך² = 0.75. השוואות זיווגים וחכמות עם תיקון Bonferroni הראה כי נייר מגורר (4.11 ± 0.20) דורג גבוה באופן משמעותי (p < 0.05) באיכות מאשר הכיכר (1.95 ± 0.21), מצעים (2.21 ± 0.21), או טוויסט (1.94 ± 0.20) חומרים, ללא הבדלים הנראים בין הכיכר, מצעים, החומרים טוויסט (כל p > 0.99). לא הייתה כל אינטראקציה משמעותית בין הגנוטיפ והחומר. הנתונים מוצגים באיור 3.

ניסויים אחרים מהמעבדה שלנו הניבו תוצאות דומות בתחילת מודלים של מחלת אלצהיימר. לדוגמה, כפי שמתואר באיור 4, 5.5-Month P301L rTg4510 (htau) עכברים שנבנו קינים גרוע באופן משמעותי מתוך נייר מגורר בהשוואה לגיל שלהם בהתאמה מקבילים מסוג³¹. כמו כן, dual J20 (hAPP)/hטאו ועכברים בודד h, בנתה קנים עניים מתוך נייר מגורר בהשוואה לסוג wildtype להם, CAMKIIa-יזם רק עמיתיהם, הן ב 3.5-ו-7-חודשים של גיל³² (נתונים לא מוצגים).

איור 3: מדורג איכות של קינים עשוי מחומרים שונים הניתנים wildtype ו-apoe e4 עכברים. ההשפעה העיקרית של גנוטיפ (* p < 0.01) הראו כי עכברים מסוג wildtype בעקביות בנוי באופן עקבי קינים שנעשו מן הנייר מגורר, לחצה ריבועים כותנה, טוויסט נייר, ו מצעים קלח רך לעומת APOE e4 עכברים. ההשפעה העיקרית של החומר (* * p < 0.01) גם הוכיחה כי קנים שנבנו מנייר מגורר היו מדורגים גבוה יותר באיכות לעומת שלושת החומרים האחרים. הנייר הגרוגרס היה מידת האמינות הגבוהה ביותר של האינטר-מאטר כפי שמוערך על ידי ICC. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: קיני נייר מגורר שנבנה על ידי מסוג והעכברים htau, על או ביטול של מים אבץ. (א) מייצגיםקנים שנבנו על ידי ה5.5 בן החודש, מסוג wildtype עכברים, על השליטה (ברז) מים או מים בתוספת 10 חלקים לכל מיליון אבץ (ביוטל מעורב במחלת האלצהיימר). הקינים הבקיע בסולם 1-5 באמצעות הקריטריונים שצוינו. משמאל לימין: ווילסוג + מים אבץ (4.54 ± 0.52); wildtype + מי בקרה (4.15 ± 0.80); htau + מים שליטה (3.08 ± 0.64); htau + מים אבץ (2.46 ± 0.97). (ב) יחסי המים של ה-גנוטיפ הראו כי העכברים הללו על מי האבץ שנבנו קינים גרועים באופן משמעותי בהשוואה לקבוצות אחרות (*); בנוסף, ההשפעות הפשוטות הראו כי עכברים htau על מי אבץ הקימו קינים גרוע יותר מאשר עכברים htau על מי שליטה. עכברים מסוג wildtype על מי שליטה ומים אבץ קנים מובנה של גבוה, ואיכות דומה, לעומת עמיתיהם htau שלהם. הודפס מתוך כתב העת של מחלת אלצהיימר, Vol 64, קרייבן, ק מ, Kochen WR, הרננדז ס מ, פלירן JM, אבץ בייטס מחלות באוניברסיטת טאו מודל, 671-630, זכויות יוצרים (2018), עם אישור של IOS Press³¹. הפרסום זמין ב-IOS Press באמצעות http://dx.doi.org/10.3233/JAD-180151. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: קובץ קידוד משלים – קינון. R אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: מחקר לספירה מקננים ציונים. csv נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

קינון הוא התנהגות מכרסם חשובה ואבולוציונית והוא שימש כדי להעריך את הפעילות של חיי היומיום ורווחה כללי בעכברים². הקלות לביצוע הבדיקה, אמינותו, ותוקף הפנים שלו מבצעים קינון כהשלמה מעשית לבדיקות התנהגותיות רבות, כגון: החופרים, קצב החוגה והטיפוח. אבל, כפי שקינון הופך להיות נפוץ יותר במעבדה, צירופים שונים כדי לנהל, לכמת, ולפרש להגדיל את הקינון. ככזה, יש צורך במחקר נוסף כדי לחקור את ההליכים הmethodologically הטובים ביותר והנשמעים כמעט לקינון, כך שתוקפו ואמינותו של הבחינה אינם מוקרבים עבור עלויות, זמן בדיקה והליכים אחרים המפחיתים את העומס בבדיקות .

איכות בנייה הקן הוא אכן רגיש לסוג של מצעים סיפק כמו גם גנוטיפ. באופן כללי, עכברים מסוג wildtype נבנו קינים טוב יותר לעומת e4 APOE עכברים ללא קשר לחומר הקינון; עם זאת, מסוג wildtype ו-APOE e4 עכברים לבנות באיכות גבוהה משמעותית קינים מתוך נייר מגורר בהשוואה לשלושת החומרים האחרים קינון. מחקרים אחרים מספקים ראיות מתואם לגבי נייר מגורר: עכברים שנבנו קנים מורכבים יותר מתוך רצועות נייר מגורר מאשר עם כותנה ריבועים לחצה, רקמות, ו אספן מצעים³³. יתר על כן, קינים שנבנו מתוך מפצלי נייר מגורר כבר הוערך בצורה יותר "naturalistic" מאשר אלה שנעשו של חומרים אחרים, אשר מאופיינים בצורת הקן עצמו ואת גובה הקירות סביב חלל הקן ב כדי ליצור כיפת^6,33. ככזה, בחירת חומר נאות לצורך שיקול זה היא קריטית כדי להתבונן טוב יותר באופן טבעי בסביבה מבוקרת יחסית, כלומר, הגדרת המעבדה. חשוב מכך, למרות שפרוטוקול זה העריך קינון פעם אחת בגיל 9 עד 12 חודשים, אנו מדגישים כי יש לנהל את הקינון במספר גילאים. הפשטות של פרוטוקול זה מאפשרת לו להתנהל מספר פעמים, באופן אידיאלי לפני התחלתה של החסרונות המלווים נוירוניוון. מדידות חוזרות להרשות לעצמם את ההזדמנות לתעד את תפקיד סיבתי סביר של ניוון מוחי ביכולת קינון ירידה.

בניין קן טבעי הוכח להיות שונה בין עכברים של זנים רקע שונים³⁴, וככזה, את האיכות והצורה הכוללת של הקן עשוי להיות שונה לא בשל הטרנסגנים של עניין, אבל בשל זן הרקע. לדוגמה, אבותיהם של C57BL/6 עכברים נחשבו "חור" nesters, ואילו אבותיהם של BALB/C העכברים נחשבו "משטח" nesters³⁵. עכברים על רקע C3H או צלבים עם זן זה, כגון C3H היברידית/הוא-C57BL/6 עם E4 בשימוש בגרביל ואח '⁹ נחשבים גם להיות נסטרס עני; לכן, החוקרים צריכים לשקול בחריפות באמצעות עכברים שליטה על אותו הרקע כמו עכברים טרנסגניים, אשר הכולל לשפר את התפקיד הישיר, סיבתי של הטרנסגנים (ים), ולא את הרקע, ב ניוון נוירולוגי והחסרונות הבאים בקן התנהגות בנייה.

ניסויים מסוימים מנצלים לעתים קרובות את השערים היחידים כדי לשפוט את המורכבות של הקן; עם זאת, אנו מחייבים את הטיעון לכלול יותר התסטרים, וחשוב מכך, הופכים עיוורים לתנאים ניסיוניים. באמצעות גישה זו, אנו משתמשים שלושה בלתי תלויים, הניקוד העיוור ומתאם תאיים כדי להעריך את ההסכם בין הגבוהים, אשר, עם הכשרה בסיסית, הניב הקשרים הגבוהים תאיים שהיו מעידים על אמינות גבוהה בקרב הבין והסכמה חזקה לגבי איכות הקן. יתר על כן, עשרות קנים מורכב של נייר מגורר וריבועים כותנה היו הקשרים הגבוהים ביותר תאיים, אינדיקציה של הסכמה חזקה יותר ועקביות יותר בקרב הגדולים. ההסכם החזק מספק גם הצדקה לממוצע הציונים המרובים יחד, ושיע אסטרטגיה המיושמת במחקרים התנהגותיים. למרות שאסטרטגיה זו דורשת יותר אנשים, וככל הנראה, יותר זמן להבקיע קנים, היא מפחיתה באופן יעיל את ההטיה בהערכות איכותניות כגון קינון.

חומרי הקינון המשמשים באותו הסדר היו שווים בערך במחיר, פרט למצע התירס הרך. תשתית מסחרית לקינון עשויה להיות בעלת תושייה מבחינה כלכלית עבור ניסויים מסוימים; עם זאת, מרטין ואח '¹⁵ שים לב כי ריבועים כותנה, כאשר לעומת חומרים אחרים כגון נייר crinkled, הוא אחד החומרים היקרים ביותר הזמינים לרכישה. זה עשוי להיות בגלל זמינות קלה, אחסון, וניהול, אבל חוקרים אחרים רשאים לבחור בחומרים חוקיים ואמינים באופן דומה, במיוחד כאשר מאותגרים על ידי מספר רב של בעלי חיים במתקן, מספר משפטי קינון, הגבלות זמן עבור קנים הבקיע, ועלויות כלוב גבוהות. כך, נייר מגורר עשוי להיות אופציה יותר ריאלי ומתאים. בנוסף, לכידת נתונים עבור השיטה שלנו יכול להתבצע באופן מיידי (כלומר, הבקיע אדם), למרות התמונות צריך להיות מוערך מאוד כדי להקליט, לשמור, ומחדש לכמת קנים, אם תרצה לצורך הערכה בין ובין-בתוך-מדרג אמינות בזמנים מאוחרים יותר. כפי שצוין, אנו מדגישים בחוזקה את ההכללה של מספר רב של מבחנים עבור "מבחן, מבחן מחדש" שיטות להעריך את ההסכם, כמו אלה הליכים קוליים methodologically לעתים קרובות להתעלם.

לסיכום, אנו מאמינים כי המתודולוגיה ושיקולים סטטיסטיים (כלומר, מתאם תאיים) לצורך שיטה זו עשויה להיות עניין לניסויים בהערכת איכות החיים, כללי, ופעילויות של חיי היומיום בעכברים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corncob bedding	Envigo	7092	1/8 in bedding for cotton squares, shredded paper, and paper twist trials
Cotton Squares	Envigo	Iso-Blox
Diamond Twists	Envigo	7979C.CS	Paper twists used in protocol
Mouse - APOE4 e4	Jackson Laboratories	#012307	Homozygous APEO4 e4 mouse bred with hemizyous J20 mouse
Mouse - C57BL/6J	Jackson Laboratories	#000664	Wildtype mouse for controls
Mouse - J20	Jackson Laboratories	#006293	Hemizygous mouse bred with the homozygous APOE e4 mouse to generate cross
Rstudio	R Core Team	V1.1.463	Run with R version 3.5.3 (2019-03-11) -- "Great Truth". Note: additional R Packages are included in provided code and can be installed from CRAN
Soft Cob	Envigo	7087C