Nest building Behavior als Frühindikator für Verhaltensdefizite bei Mäusen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Quantifizierung des Nestbauverhaltens bei Mäusen vor, das bekanntermaßen bei mehreren neurologischen Erkrankungen und Erkrankungen beeinträchtigt ist. Dieses Protokoll untersucht den Nutzen von vier Materialien und bietet die Möglichkeit, die Rater-Vereinbarung bei der Bewertung zu quantifizieren, wodurch die Gültigkeit und Zuverlässigkeit des Assays verbessert wird.

Zusammenfassung

Nestbau ist ein angeborenes Verhalten bei männlichen und weiblichen Nagetieren, auch wenn sie im Labor aufgewachsen sind. Als solche liefern viele Forscher Nagetiere synthetische und/oder natürliche Materialien (wie Bindfäden, Gewebe, Baumwolle, Papier und Heu) als Gradmesser für ihr allgemeines Wohlbefinden und als Nebenbewertung, um den möglichen Rückgang der Kognition vorherzusagen. In der Regel weisen Änderungen im Verschachtelungsverhalten, z. B. das Nichterstellen eines Nests, auf eine Änderung der Gesundheit oder des Wohlbefindens hin. Darüber hinaus ist das Nistverhalten empfindlich auf viele ökologische und physiologische Herausforderungen sowie auf viele genetische Mutationen, die pathologischen Krankheitszuständen zugrunde liegen. Das folgende Protokoll beschreibt ein Verschachtelungsverhaltensparadigma, das die Verwendung von vier Arten von Verschachtelungsmaterial untersucht. Darüber hinaus verwendet das Protokoll klasseninterne Korrelationen, um zu zeigen, dass die Zuverlässigkeit von Interratern höher ist, wenn Nester aus geschreddertem Papier gebaut werden, im Vergleich zu anderen gängigen Nistmaterialien wie Baumwollquadraten, Papierverdrehungen und Soft cob. Bettwäsche. Die gewählte Methodik und die statistischen Erwägungen (d. h. die intraklassale Korrelation) für diesen Test können für diejenigen von Interesse sein, die Experimente durchführen, die die Lebensqualität von Mäusen bewerten.

Einleitung

Nestbau ist ein angeborenes Verhalten bei vielen Tieren wie Vögeln, Fischen, Nagetieren und Menschenaffen, und es zieht mehr Aufmerksamkeit für seinen potenziellen Nutzen in der Untersuchung von neurologischen Erkrankungen und Störungen, die durch vermindertes Wohlbefinden und beeinträchtigt eitern gekennzeichnet sind Aktivitäten des täglichen Lebens¹. Mäuse, sowohl männliche als auch weibliche, bauen ähnlich große Nester für Fortpflanzungszwecke, Wärmeerhaltung und Unterschlupf; noch wichtiger ist, dass sie dies auch dann tun, wenn sie in^{Laborumgebungen}2 angehoben werden. Hess, Petrovich und Goodwin³ argumentieren, dass biologisch geeignete Reize von größter Bedeutung sind, um biologisch geeignete Verhaltensweisen wie Dasnestieren zu induzieren; jedoch, eine Vielzahl von natürlichen und künstlichen Materialien, wie Heu, Hanf, Baumwollgarn, Papierstreifen, Baumwolle Zahnbälle und gepresste Baumwolle Quadrate, wurden verwendet, um Nestgebäude Verhalten zu bewerten². Änderungen in diesen Verschachtelungsverhalten (d. h. das Versäumnis, aus dem bereitgestellten Material ein Nest zu erstellen) deuten im Allgemeinen auf eine Änderung der Gesundheit oder des Wohlbefindens hin. In den meisten Fällen wird der Mangel an Nestbau auf mehrere Faktoren zurückgeführt, die sich negativ auf das Wohlbefinden auswirken. Solche Beispiele, die alle effektiv die Qualität des Nestbaus bei Mäusen verringert haben, sind Temperaturextreme; schmerzhafte Stimulation; induzierte Krankheit und Infektion; genetische Mutationen; und Hirnläsionen in den medialen voroptischen Bereichen, Septum und Hippocampus^4,5,6.

Die Alzheimer-Krankheit ist eine progressive neurodegenerative Erkrankung, die durch den Verlust von Hirngewebe, die Ansammlung extrazellulärer Amyloid-Plaques und intrazelluläre neurofibrilläre Verwicklungen gekennzeichnet ist, die hyperphosphorylierte mikrotubuli-assoziierte Protein, tau⁷. Darüber hinaus ist die Alzheimer-Krankheit vor allem durch Lern- und Gedächtnisdefizite und Beeinträchtigungen der Aktivitäten des täglichen Lebens gekennzeichnet. Bei Mäusen werden Aktivitäten des täglichen Lebens häufig über zirkadianes Radlaufen^8,9,10,11, untersucht, obwohl neue Alternativen, wie Zistern, immer beliebter werden. Es hat sich gezeigt, dass die Verschachtelung empfindlich gegenüber Manipulationen (z. B. genetischen Mutationen, Umweltstressoren) ist, die als Risikofaktoren und/oder Ursachen der Alzheimer-Krankheit identifiziert wurden. Als solche, Verschachtelung kann als zusätzlicher oder ergänzender Test in vielen Mausstämmen verwendet werden, die diese Eigenschaften der Alzheimer-Krankheit modellieren. Zum Beispiel, Diakon und Kollegen¹² gemessen Nest Gebäude von Tg2576 Mäuse mit dem schwedischen Amyloid-Vorläuferprotein (APPswe) und Presenilin 1 (PS1) genetische Mutationen. Die Qualität der Nester, die von gruppengehausten Tg2576-Mäusen gebaut wurden, war sowohl im Alter von 3- als auch im 12-Monats-Alter deutlich schlechter als bei Wildtypkontrollen. In Übereinstimmung mit diesen Befunden berichteten Filali et al.^13, dass singly untergebrachtapPswe/PS1 männliche Mäuse mit zwei Stücken von 5 x 5 cm Baumwolle bauten deutlich ärmere Nester wie auf einer Skala von 1 - 5 bewertet (1 = nestlet nicht berührt, 5 = ein fast perfektes Nest). Transgene Mäuse bauten im Alter von 6-, 9- und 12-Monaten im Vergleich zu ihren Wildtyp-Pendants immer schlechtere Nester, und in einigen Fällen gelang es den Appswe/PS1-Mäusen völlig nicht, aus der bereitgestellten Baumwolle ein Nest zu bauen.

Frühere Untersuchungen aus unserem Labor haben gezeigt, dass Wildtyp C57BL/6J Mäuse deutlich bessere Nester aus Baumwollquadraten bauen als CRND8- und CRND8/E4-Mäuse⁹. Die meisten Experimente mit gepressten Baumwollquadraten scheinen jedoch variabel zu sein, wobei Wildtypmäuse im Vergleich zu transgenen Mäusen, von denen erwartet wird, dass sie sehr niedrige Werte in^derVerschachtelung 2 aufweisen, keine erwarteten hohen Werte aufweisen. Unterschiede bei den geschätzten Parametern (d. h. mittlere Unterschiede) und der statistischen Signifikanz. Der Mangel an Unterschieden kann zum Teil auf unzureichende Alterung von Mäusen oder Zeit für die Verschachtelung zugewiesen. Alternativ kann Dasnistmaterial eine zusätzliche Herausforderung darstellen, was aufgrund der methodischen Vorlieben der Forscher in Dermenge und Materialart zu einer stärkeren Variabilität führen kann, die sogar mit Mausstämmen interagieren können. So stellten Robinson-Junker und Kollegen¹⁴ verarbeitetes oder unverarbeitetes Einstreumaterial unterschiedlicher Größe (d. h. kleine oder große Flocken) an C3H/HeNCrl-Mäuse und BALB/cAnNCrl-Mäuse zur Verfügung, die häufig als arm und stark beobachtet werden. Nestbauer. Bei unverarbeiteter Bettwäsche bauten C3H-Mäuse weniger komplex, aber ähnlich in Qualitätsnestern im Vergleich zu BALB/c-Mäusen.  Ebenso verglichen Martin und Kollegen¹⁵ die Nestkomplexität verschiedener Nistmaterialien, die Hirschmäusen gegeben wurden, einem entfernten Verwandten der Mus-Mus-Musculus-Arten, die deutliche evolutionäre Unterschiede aufweisen (d. h. eher in Bäumen graben und Underbrush und sind aktiver in Gefangenschaft), aber erhalten ähnliche Haltungpflege wie gemeinsame Labormäuse und bauen Nester aus jedem verfügbaren weichen, faserigen Material^16,17,18.  Weibchen und Züchter mit Welpen im Hauskäfig bauten komplexere Nester als Männchen, und die Autoren vermuten, dass diese Verhaltensunterschiede auf die damit verbundenen Veränderungen der Progesteronkonzentrationen bei Hirschmäusen zurückzuführen sein können¹⁵. Noch wichtiger ist, dass Mäuse komplexere Nester aus braunem Papier bauten, gefolgt von Baumwollquadraten und Baumwollzylindern, und die am wenigsten komplexen Nester wurden aus weißem Papier und verteilten Mini-Baumwollquadraten gebaut.

Trotz der wachsenden Popularität von Verschachtelungen werden Überlegungen zu wissenschaftlich validen, kostengünstigen und zeitkritischen Praktiken minimal diskutiert. Angesichts der oben genannten methodischen und wirtschaftlichen Herausforderungen untersucht dieses Protokoll den Nutzen verschiedener Nistmaterialien – Baumwollquadrate, Papierverdrehungen, geschreddertes Papier und verarbeitete Bettwäsche – im Nistverhalten. Insbesondere stellten wir alle Nistmaterialien sowohl für die Gealterungskontrollen c57BL/6J als auch für die Alzheimer-Krankheit APOE e4-Mäuse zur Verfügung, um mögliche Genotypen durch Materialwechselwirkungen in Nistqualität zu untersuchen. Darüber hinaus wurde das Experiment versucht, die Zuverlässigkeit von Nestern zwischen den Ratten zu bewerten, die aus verschiedenen Materialien gebaut wurden. Zusammengenommen zeigt dieses Protokoll die Überlegenheit eines Nistmaterials in dieser Probe – geschreddertes Papier – in Bezug auf Nestqualität und Scorer-Vereinbarung, mit der Absicht, die Gültigkeit und Zuverlässigkeit des Nesting-Assays zu verbessern.

Protokoll

Alle Verfahren wurden vom Institutionellen Tierpflege- und Nutzungsausschuss der George Mason University genehmigt und entsprechen den Richtlinien der Bewertung und Akkreditierung von Labortierpflege.

1. Tiere und Überlegungen vor der Bewertung

1. Verwenden Sie für dieses Protokoll Erwachsene, 9 - 12 Monate alte C57BL/6J (n = 10) (Bestand nr. 000664) Wildtypmäuse und APOE e4-Mäuse (n = 11) aus einem hemizygoten J20 (Bestand #006293) x homozygotes APOE e4 (Bestand #012307) Kreuz.
2. Im Wohnraum wurden Mäusen ein Laufrad, ein Iglu und ein kleines Nylon-Kauspielzeug zur Verfügung gestellt). Gruppenhaus 4 - 6 weibliche Mäuse und 4 Männchen in einem 356 mm L x 485 mm B x 218 mm H Hauskäfig.
   HINWEIS: Forscher können die Umsetzung von Strategien vor und/oder nach der Verschachtelung in Betracht ziehen, um Aggressionen mit Käfigpaaren zu vermeiden, wenn Mäuse nach Nistversuchen wieder eingeführt werden. Solche Strategien können, aber nicht beschränkt auf, tägliche Handhabung vor Verhaltenstests, um Mäuse besser an den Umgang mit Verhaltenstests, Forscher, und Haltungspersonal¹⁹, Trennen und individuell Unterbringung aggressivemäuse, oder Verringerung der Anzahl der Mäuse im Hauskäfig²⁰, abhängig von der Schwere der Kämpfe im Käfig, beobachtete Wunden²¹usw.

2. Raum- und Nistplatz

1. Stellen Sie sicher, dass jede Maus vier Versuche (1 Material pro Versuch) abschließt. Randomisieren Sie die Reihenfolge des Verschachtelungsmaterials für jede Maus, um einen Auftragseffekt zu vermeiden.
2. Bereiten Sie die Käfige in einem separaten Testraum vor. Zeichnen Sie Umgebungsbedingungen (z. B. 22,2 – 22,3°C, 45-47% Luftfeuchtigkeit, Licht an 9:00 Uhr – 21:00 Uhr) so auf, dass sie versuchsübergreifend konsistent sind und mit dem Gehäuseraum identisch sind. Geben Sie Essen und Wasser ad libitum.
   1. Weisen Sie jeder Maus eine zufällige Identifikationsnummer (ID) oder einen Buchstaben zu. Befestigen Sie die Zufällige Kennungskarte an einen 29,2 x 18,4 cm großen Käfig.
   2. Zeichnen Sie die ursprüngliche Tier-ID/-Tag und andere erforderliche Identifizierung in einem Kolonie-Datensatz auf, um sicherzustellen, dass Assistenten und Tierhaltungspersonal blind für Bedingungen bleiben.
3. Nach dem Zufallsprinzip Käfigplatzierung im Testraum so bestellen, dass Wildtyp- und transgene Mäuse nicht unangemessen getrennt sind (d. h. auf gegenüberliegenden Seiten des Raumes, in separaten Regalen usw.).
4. Bereiten Sie die Nistmaterialien vor, indem Sie den Boden des Käfigs ausreichend abdecken. Verwenden Sie ca. 100 g Trockengewicht maiscob Bettwäsche für die quadratischen, twist, und geschreddert Papier Versuche, und ca. 100 g der weichen Kopfbett bettwäsche für die Soft cob Studie.
5. Wenn Sie ein Becherglas verwenden, um das Nistmaterial zu zerstreuen, dann füllen Sie den Becher nicht mehr als 100 ml mit Maiskolben-Bettwäsche oder weichem Kolbeneinstreu.
6. Legen Sie das erste Nistmaterial in die Sequenz, bevor Sie die Maus in den Käfig einführen. Dieses Protokoll verwendet (1) ein einzelnes gepresstes Baumwollquadrat, (2) einen einzigen Papiertwist, (3) 100g Soft-Cob-Bettwäsche (d. h. keine zusätzliche Bettwäsche oder Nistmaterial hinzugefügt) und (4) 2,5 g saubere (keine Tinte), geschreddertes weißes Druckerpapier in 5 – 7cm Streifen geschnitten. Dispergieren von Verschachtelungsmaterialien, wie in Abbildung 1 (Baseline) dargestellt.

Abbildung 1:Käfigeinrichtung für jedes Material. Alle Mäuse absolvierten eine Studie mit jedem Materialtyp für insgesamt vier Versuche. Maiskolbenbetten säumten den gesamten Boden der Käfige mit einem Papiertwist, einem gepressten Baumwollquadrat und zerfetztem Papier. Weiche Stäbchen-Bettwäsche wurde gleichmäßig über den Käfig verteilt, um Mäuse zu ermutigen, die kleinen Baumwollquadrate vom Maiskolben zu trennen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Verschachtelungsversuch

1. Beginnen Sie die erste Nistversuchsversuch zur gleichen Tageszeit zu Beginn des Lichtzyklus (z. B. 9:00 Uhr).
2. Bringen Sie den Hauskäfig mit den Mäusen in den Testraum. Entfernen Sie jede Maus aus dem Hauskäfig und legen Sie sie in den zugewiesenen Nistkäfig, wobei das Material bereits im Käfig platziert ist. Bringen Sie die Hauskäfige in den Wohnraum zurück.
3. Lassen Sie Mäuse 1 Versuch für 24 h ungestört abschließen.
4. 24 h nach Beginn des ersten Versuchs, kehren Sie in den Testraum zurück.
5. Entfernen Sie vorsichtig den Deckel des Käfigs und fotografieren Sie das Nest jeder Maus, erfassen Sie die zugewiesene ID auf dem Foto und minimieren Sie das Aussehen von Materialien außerhalb des Käfigs.
   HINWEIS: Warten Sie, bis sich die Maus aus dem Nest bewegt, bevor Sie versuchen, es aus dem Käfig zu entfernen. Es wird dringend empfohlen, das Nest zu fotografieren, während sich die Maus im Käfig, aber außerhalb des Nestes befindet. Der Versuch, die Maus vor dem Fotografieren aus dem Käfig zu entfernen, kann dazu führen, dass die Maus erschreckt wird, und sich somit auf die Verschachtelungsmaterialien bewegt und sie verteilt.
6. Entfernen Sie die Maus vorsichtig aus dem Nistkäfig und legen Sie sie in einen temporären Haltekäfig. Entsorgen Sie die Bettwäsche und alle Nistmaterialien, ersetzen Sie die Bettwäsche und stellen Sie das nächste Nistmaterial in der Sequenz bereit, und geben Sie die Maus in den Nistkäfig zurück.
7. Wiederholen Sie dies bei Bedarf, um Punkte für alle 4 Versuche zu erhalten. Es wird empfohlen, geschreddertes Papier und die damit verbundenen Bewertungskriterien zu verwenden, obwohl Die Forscher an der Verwendung der in diesem Protokoll diskutierten alternativen Materialien interessiert sein könnten.
8. Wenn alle Versuche abgeschlossen sind, bringen Sie Mäuse in ihre heimischen Käfige zurück. Beobachten Sie die Mäuse auf ein mögliches aggressives Verhalten. Aggression kann bei älteren WildtypMännchen auftreten.
   HINWEIS: Für die Zwecke dieses Protokolls wurden Mäuse einmal im Alter von etwa 9 – 12 Monaten getestet. Die Verschachtelung sollte in mehreren Altersgruppen (d. h. in einem früheren Alter, abhängig vom gewählten Stamm, vor dem Beginn der phänotypischen Merkmale) durchgeführt werden, um den Rückgang der Nistfähigkeit im Laufe der Zeit zu dokumentieren und die wahrscheinliche ursächliche Rolle der Neurodegeneration zu demonstrieren.

4. Bewertung und Bewertung der Zuverlässigkeit von Inter-Ratern

1. Stellen Sie Für jedes Verschachtelungsmaterial Grundbilder für mindestens 2 Personen bereit, die für die Studie blind sind. Obwohl nicht erforderlich, stellen Sie sicher, dass die Torschützen mit dem Konzept der Verschachtelung vertraut sind. Wenn Sie Scorer trainieren, stellen Sie eine Reihe von Beispielnestern (z. B. Abbildung 2 für geschreddertes Papier) bereit, um die Scorer mit jeder Materialart (falls zutreffend) und den Bewertungskriterien vertraut zu machen.
   1. Bewerten Sie jedes Nest auf einer Skala von 1 – 5 anhand der folgenden Skaleninformationen (angepasst von Deacon, 2006)². Siehe Abbildung 2 als Beispiel bewertung mit geschreddertem Papier.
   2. Weisen Sie eine Punktzahl von 1 zu, wenn das zerfetzte Papier oder kleine Quadrate im Käfig verstreut blieben oder das Baumwollquadrat oder die Drehung unberührt blieb;
   3. Weisen Sie eine Punktzahl von 2 zu, wenn ein Teil des Materials in ein Nest gebaut wurde, aber über 50% des Materials wurde nicht für den Nestbau verwendet (d.h. blieb verstreut oder der Großteil des ursprünglichen Materials blieb unberührt);
   4. Weisen Sie eine Punktzahl von 3 zu, wenn ein auffälliges Nest gebaut wurde, aber mehrere Stücke waren noch verstreut;
   5. Weisen Sie eine Punktzahl von 4 zu, wenn fast das gesamte Material für das Nest verwendet wurde, aber nur wenige Materialstücke blieben verstreut oder befanden sich in der Nähe des Nestes;
   6. Weisen Sie eine Punktzahl von 5 zu, wenn das gesamte Material verwendet wurde, um ein identifizierbares Nest zu erstellen.
      HINWEIS: Scorer sollten Pausen einlegen und Basisfotos erneut ansehen, um Ermüdung und Voreingenommenheit während des Scoring-Vorgangs zu vermeiden. Scorer sollten nicht miteinander diskutieren, um Voreingenommenheit zu vermeiden. Scorer sollten Punkte besprechen, nachdem die Punktzahl abgeschlossen ist, oder wenn weitere Diskussionen erforderlich sind, um die Punktzahlen zu ändern, die möglicherweise Probleme mit intraclass Korrelationen (ICC) lösen können. Die intraklassierenden Korrelationen werden mit den in Abschnitt 4.2 aufgeführten Schritten durchgeführt.

Abbildung 2:Beispiel für die Bewertung anhand der Kriterien für geschreddertes Papier, das bevorzugte Material. Von links nach rechts: 1 – das geschredderte Papier blieb unberührt; 2 – ein Teil des Papiers wurde zu einem Nest gebaut, aber die meisten Stücke blieben verstreut; 3 – ein auffälliges Nest wurde gebaut, aber mehrere Stücke waren noch verstreut; 4 – die meisten Stücke wurden für das Nest verwendet, aber einige Stücke wurden in der Nähe des Nestes verstreut; 5 – alle Stücke wurden verwendet, um das Nest zu machen. Beachten Sie, dass auf den Fotos die zugewiesene Nummer des Tieres angezeigt wird, um eine Entblindung zu vermeiden. Die Farbe der Karte ist zufällig. Die Forscher sollten die Maus im Käfig bleiben lassen, um zu vermeiden, dass die Maus erschreckt wird, was das Nest möglicherweise zerstreuen könnte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Sammeln und eingeben Von scores und formatieren Sie die Datendatei so, dass sich die Punktzahlen jedes Scorers für jedes Material in separaten Spalten befinden.
   HINWEIS: Wenn Sie Supplementary File 1verwenden, beachten Sie bitte, dass das Codierungsskript für diese Analyse kostenlose Open-Source-Software erfordert (z. B. irr-Paket in RStudio)^22,23. Das Skript entfernt Header und Subjectsvariablen (d. h. die oberste Zeile und Tier-IDs), um die intraclass Korrelation (ICC) durchzuführen. Führen Sie das Skript aus, um eine zweiseitige Vereinbarung durchzuführen, misst ICC, indem Sie den abgegrenzten Abschnitt des Codes hervorheben und Strg+Enter oder Befehl+Enter drücken.
3. Vergleichen Sie den ICC mit den bestehenden Kriterien^24,25,26. In der Regel entsprechen ICC-Werte über 0,80 einer starken Inter-Rater-Zuverlässigkeit, was rechtfertigt, dass die Werte zu einem bestimmten Zeitpunkt gemittelt werden (Zusatzdatei 2).
4. Verwenden Sie dieselben ICC-Kriterien für die Zuverlässigkeit innerhalb von Ratern, die für diejenigen, die zum ersten Mal Scoring durchführen, von Interesse sein können.
   VORSICHT: Die Torschützen sollten innerhalb einer Woche nach der ersten Bewertung die gleichen fotografierten Nester punkten. Gehen Sie mit Vorsicht mit Mittelungsdaten vor, wenn ICC niedrig ist, da dies Daten verzerren oder Nullergebnisse erzeugen kann. Wenn die ICC-Werte niedrig sind, kann (1) eine zusätzliche Schulung für Scorer erforderlich sein, (2) Die Torschützen müssen möglicherweise ihre Begründung für Nest-Scores besprechen, (3) ein anderer unabhängiger Gutachter kann erforderlich sein, um einen Beurteilungsaufruf über die Punktzahlen zu machen, oder (4) Intra-Rater Zuverlässigkeit muss möglicherweise bewertet werden. Wenn die Zuverlässigkeit des Unternehmens mangelhaft ist, kann ein zusätzliches Training oder ein anderer Scorer erforderlich sein.

5. Statistische Erwägungen

1. Führen Sie gegebenenfalls statistische Analysen durch. Verwenden Sie für Daten, die nicht gegen Normalitätsannahmen verstoßen, sondern für jede Maus mehrere Materialien verwenden (d. h. einen Effekt innerhalb der Subjekte), eine gemischte Varianzanalyse (ANOVA).
   1. Wenn Sie Codes als zusätzliche Dateien verwenden, laden Sie bitte zusätzliche Add-on-Pakete herunter, die im Skript^27,28,29,30angegeben sind.
   2. Wenn Sie eine gemischte ANOVA mithilfe des bereitgestellten Skripts durchführen, führen Sie das Skript aus, um alle Datendateien im breiten Format in ein Langformat zu konvertieren (d. h. anstelle von Variablen, die in Spalten wiederholt werden, konvertieren Sie die Zellen, um sie zeilenübergreifend zu wiederholen). In diesem Manuskript ist eine Beispieldatendatei enthalten, um zu veranschaulichen, wie eine Datendatei vom Großformat in ein Langformat konvertiert wird.
   3. Führen Sie die gemischte ANOVA, wie im Skript angegeben, durch. Beachten Sie, dass, wenn Mauchlys Sphericity-Test verletzt wird, dann Korrekturfaktoren wie Die Greenhouse-Geisser-Korrektur implementieren.
   4. Führen Sie alle erforderlichen Posthoc-Tests durch, um Unterschiede zwischen Faktoren mit mehr als 2 Ebenen zu untersuchen, wie im Codierungsskript angegeben. Führen Sie in diesem Beispiel Bonferroni-Posthoc-Tests durch, um die verschiedenen Arten von Verschachtelungsmaterial zu vergleichen.
      HINWEIS: Wenn Sie nur ein Verschachtelungsmaterial verwenden, sollten Sie keinen Faktor innerhalb der Subjekte berücksichtigen. Wenn das Sammeln von Daten jedoch zu mehreren Zeitpunkten diese wiederholten Messgrößen als Ebenen eines Subjektfaktors einbezieht.
      HINWEIS: In einigen Fällen können Wildtypmäuse perfekte Noten haben und somit einen Deckeneffekt aufweisen, der zu einer nicht-normalen Verteilung führt². Berücksichtigen Sie geeignete statistische Tests (z. B. nichtparametrische Tests mit alternativen Messgrößen der zentralen Tendenz und Dispersion), Normalisierungsmethoden oder robuste Ansätze (Gemischte Effektmodellierung für wiederholte Messgrößen) bei der Datenanalyse.

Ergebnisse

Die Ergebnisse der vier verschiedenen Nistmaterialien, die Wildtyp- und APOE e4-Mäusen zur Verfügung gestellt werden, werden wie folgt erklärt. Basierend auf bestehenden Kriterien zeigte der ICC eine starke Übereinstimmung zwischen allen drei Codern für alle vier Nistmaterialien (geschreddertes Papier ICC = 0,94; Quadrat ICC = 0,91; Bettwäsche ICC = 0,87; Twist ICC = 0,87); Daher wurden die drei Partituren zusammen gemittelt, um für jedes bereitgestellte Material eine einzige Punktzahl zu erstellen. A 2 x 4 gemischte ANOVA ergab einen signifikanten Haupteffekt des Genotyps, F(1, 19) = 31,30, p < 0,01, sp² = 0,62. In allen vier bereitgestellten Materialien schnitten Wildtypmäuse bei der Nestqualität (3,18 x 0,20) besser ab als APOE e4-Mäuse (1,98 x 0,16). Darüber hinaus lieferte die gemischte ANOVA eine signifikante Hauptwirkung des Materials, F(3, 57) = 57,48, p < 0,01, sp² = 0,75. Paarweise Vergleiche mit der Bonferroni-Korrektur zeigten, dass das geschredderte Papier (4,11 x 0,20) in der Qualität signifikant höher bewertet wurde(p < 0,05) in der Qualität als die quadratischen (1,95 x 0,21), Die Bettwäsche (2,21 x 0,21) oder die Unterschiede zwischen Quadrat-, Bettzeug- und Twist-Materialien (alle p > 0,99). Es gab keine signifikante Wechselwirkung zwischen Genotyp und Material. Die Daten sind in Abbildung 3dargestellt.

Andere Experimente aus unserem Labor haben ähnliche Ergebnisse in frühen Modellmodellen der Alzheimer-Krankheit ergeben. Wie in Abbildung 4gezeigt, bauten beispielsweise 5,5 Monate alte P301L rTg4510 (htau) Mäuse aus geschreddertem Papier deutlich schlechtere Nester als ihre altersgerechten Wildtyp-Pendants³¹. Ebenso bauten Zwei-J20-Mäuse (hAPP)/htau und einzelne Htau-Mäuse ärmere Nester aus geschreddertem Papier im Vergleich zu ihrem Wildtyp und CAMKIIa-Promoter nur Gegenstücke, beide im Alter von 3,5 und 7 Monaten³² Jahre alt (Daten nicht dargestellt).

Abbildung 3:Bewertete Qualität der Nester, die aus verschiedenen Materialien für Wildtyp- und APOE e4-Mäuse hergestellt werden. Ein Haupteffekt des Genotyps (*p < 0.01) zeigte, dass Wildtypmäuse konsequent bessere Nester aus geschreddertem Papier, gepressten Baumwollquadraten, Papierverdrehung und weicher Stockbettwäsche bauten als APOE e4-Mäuse. Der Haupteffekt des Materials (**p < 0.01) zeigte auch, dass Nester, die aus dem geschredderten Papier gebaut wurden, in der Qualität höher bewertet wurden als die drei anderen Materialien. Das geschredderte Papier hatte die höchste interraterierte Zuverlässigkeitsmaßnahme, wie vom ICC bewertet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Geschredderte Papiernester, die von Wildtyp- und Htaumäusen gebaut wurden, auf oder aus Zinkwasser. (A) Repräsentative Nester, die von 5,5 Monate alten Wildtyp- und Htaumäusen gebaut wurden, auf Kontrolle (Tap) Wasser oder Wasser, ergänzt mit 10 Teilen pro Million Zink (ein Biometall, das an der Alzheimer-Krankheit beteiligt ist). Nester wurden auf der Skala 1 - 5 nach den angegebenen Kriterien bewertet. Von links nach rechts: Wildtyp + Zinkwasser (4,54 x 0,52); Wildtyp + Kontrollwasser (4,15 x 0,80); htau + Steuerwasser (3,08 x 0,64); htau + Zinkwasser (2,46 x 0,97). (B) Eine Genotyp*Wasser-Wechselwirkung zeigte, dass Htau-Mäuse auf Zinkwasser im Vergleich zu den anderen Gruppen deutlich schlechtere Nester errichteten (*); Darüber hinaus zeigten einfache Effekte, dass Htau-Mäuse auf Zinkwasser schlechtere Nester bauten als Htau-Mäuse auf Kontrollwasser. Wildtypmäuse auf Kontrollwasser und Zinkwasser gebaut Nester von höherer und ähnlicher Qualität, im Vergleich zu ihren htau Pendants. Nachdruck aus Journal of Alzheimer es Disease, Vol 64, Craven, KM, Kochen WR, Hernandez CM, Flinn JM, Zink Exacerbates Tau Pathologie in einem Tau Mouse Modell, 671-630, Copyright (2018), mit Genehmigung von IOS Press³¹. Die Publikation ist bei IOS Press unter http://dx.doi.org/10.3233/JAD-180151 abrufbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Datei 1: Ergänzende Codierungsdatei – Verschachtelung. R Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: AD Studie verschachteln scores.csv Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Nesting ist ein evolutionär wichtiges Nagetierverhalten und wurde verwendet, um die Aktivität des täglichen Lebens und des allgemeinen Wohlbefindens bei Mäusen zu bewerten². Die Leichtigkeit, den Test durchzuführen, seine Zuverlässigkeit und seine Gesichtsgültigkeit machen das Verschachteln zu einer praktischen Ergänzung zu vielen Verhaltenstests wie Graben, zirkadianem Rhythmus und Pflege. Aber, wie Dienisten im Labor häufiger verwendet werden, die verschiedenen Kombinationen zu führen, zu quantifizieren, und interpretieren Verschachtelung erhöhen. Daher sind weitere Untersuchungen erforderlich, um die besten methodisch und praktisch einwandfreien Verfahren für die Verschachtelung zu untersuchen, so dass die Gültigkeit und Zuverlässigkeit des Tests nicht für Kosten, Zeit der Tests und andere Verfahren geopfert werden, die den Prüfaufwand verringern. .

NestGebäudequalität ist in der Tat empfindlich auf die Art der Bettwäsche zur Verfügung gestellt sowie Genotyp. Insgesamt bauten Wildtypmäuse im Vergleich zu APOE e4-Mäusen unabhängig vom Nistmaterial deutlich bessere Nester; Sowohl Wildtyp- als auch APOE e4-Mäuse bauen jedoch aus geschreddertem Papier deutlich höhere Qualität als die drei anderen Nistmaterialien. Andere Studien liefern bestätigende Beweise für das geschredderte Papier: Mäuse konstruierten komplexere Nester aus zerfetzten Papierstreifen als mit gepressten Baumwollquadraten, Gewebe und Espenbetten³³. Darüber hinaus wurden Nester, die aus zerkleinerten Papierstreifen gebaut wurden, qualitativ als "naturalistischer" bewertet als die aus anderen Materialien, die sich durch die Form des Nestes selbst und die Höhe der Wände um die Nesthöhle in um eine Kuppel zu bilden^6,33. Daher ist die Auswahl des geeigneten Materials für diesen Test entscheidend, um das natürliche Verhalten in einer relativ kontrollierten Umgebung, d.h. der Laborumgebung, besser zu beobachten. Noch wichtiger ist, dass, obwohl dieses Protokoll die Verschachtelung einmal im Alter von 9 bis 12 Monaten bewertet, betonen wir, dass die Verschachtelung in mehreren Altersgruppen durchgeführt werden sollte. Die Einfachheit dieses Protokolls erlaubt es mehrmals durchgeführt werden, idealerweise vor dem Beginn von Defiziten, die Neurodegeneration begleiten. Wiederholte Messungen bieten die Möglichkeit, die wahrscheinliche ursächliche Rolle der Neurodegeneration bei verminderter Verschachtelungsfähigkeit zu dokumentieren.

Es hat sich gezeigt, dass sich der natürliche Nestbau zwischen Mäusen unterschiedlicher Hintergrundstämme³⁴unterscheidet, und als solche kann sich die Gesamtqualität und Form des Nestes nicht aufgrund der Transgene des Interesses unterscheiden, sondern aufgrund der Hintergrundbelastung. Zum Beispiel wurden die Vorfahren von C57BL/6 Mäusen als "Loch"-Nester betrachtet, während die Vorfahren von BALB/C-Mäusen als "Oberflächen"-Nester³⁵betrachtet wurden. Mäuse auf dem C3H-Hintergrund oder Kreuze mit diesem Stamm, wie die Hybrid-C3H/He-C57BL/6 mit E4 in Graybeal et al.⁹ verwendet werden auch als schlechte Nester; Daher sollten die Forscher die Verwendung von Kontrollmäusen auf dem gleichen Hintergrund wie transgene Mäuse in Betracht ziehen, was insgesamt die direkte, ursächliche Rolle des Transgens und nicht des Hintergrunds bei der Neurodegeneration und nachfolgenden Defiziten im Nest verbessern würde. Gebäudeverhalten.

Einige Experimente verwenden oft einen einzelnen Scorer, um die Komplexität des Nestes qualitativ zu beurteilen; wir argumentieren jedoch, mehr Torschützen und vor allem Torschützen aufzunehmen, die blind für experimentelle Bedingungen sind. Durch diesen Ansatz nutzten wir drei unabhängige, blinde Scorer und eine intraklassale Korrelation, um die Übereinstimmung unter den Torschützen zu bewerten, die mit der Grundausbildung hohe intraklassale Korrelationen ergaben, die auf eine hohe Inter-Rater-Zuverlässigkeit hindeuteten. und starke Übereinstimmung in Bezug auf die Nestqualität. Darüber hinaus hatten viele Nester aus geschreddertem Papier und Baumwollquadraten die höchsten innerklasslichen Korrelationen, was auf eine stärkere Übereinstimmung und größere Konsistenz unter den Torschützen hindeutet. Die starke Vereinbarung rechtfertigt auch, die Multiplikatoren zusammen zu durchschnittlich zu durchschnittlich, eine Strategie, die zufällig in der Verhaltensforschung umgesetzt wird. Obwohl diese Strategie mehr Individuen und vermutlich mehr Zeit benötigt, um Nester zu punkten, reduziert sie effektiv Voreingenommenheit bei qualitativen Bewertungen wie Verschachtelung.

Die bei diesem Test verwendeten Nistmaterialien waren mit Ausnahme der Weichenbetten ungefähr gleich preisgleich. Kommerzielle Bettwäsche für die Verschachtelung kann für einige Experimentatoren wirtschaftlich einfallsreich sein; Martin et al.¹⁵ weisen jedoch darauf hin, dass Baumwollquadrate im Vergleich zu anderen Materialien wie zerknittertem Papier eines der teuersten Materialien zum Kauf sind. Dies kann auf eine einfache Verfügbarkeit, Lagerung und Verwaltung zurückzuführen sein, aber andere Forscher können sich für ähnlich gültige und zuverlässige Materialien entscheiden, insbesondere wenn sie von einer großen Anzahl von Tieren in einer Anlage herausgefordert werden, die Anzahl der Nistversuche, Zeitbeschränkungen für Bewertungsnester und hohe Käfigkosten. Daher kann geschreddertes Papier eine praktikablere und geeignete Option sein. Darüber hinaus kann die Datenerfassung für unsere Methode sofort durchgeführt werden (d. h. die Bewertung in Person), obwohl Fotos hoch angesehen werden sollten, um Nester aufzuzeichnen, zu speichern und neu zu quantifizieren, falls dies für die Beurteilung von Inter- und Intra-Rater gewünscht wird. Zuverlässigkeit zu späteren Zeiten. Wie bereits erwähnt, betonen wir nachdrücklich die Einbeziehung von mehreren Scorern für "Test-, Re-Test"-Praktiken, um eine Einigung zu erzielen, da diese methodisch fundierten Verfahren oft übersehen werden.

Zusammenfassend sind wir der Meinung, dass die Methodik und die statistischen Erwägungen (d. h. die intraklassale Korrelation) für diesen Test für Experimente von Interesse sein können, die die Lebensqualität, das allgemeine Wohlbefinden und die Aktivitäten des täglichen Lebens bei Mäusen bewerten.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corncob bedding	Envigo	7092	1/8 in bedding for cotton squares, shredded paper, and paper twist trials
Cotton Squares	Envigo	Iso-Blox
Diamond Twists	Envigo	7979C.CS	Paper twists used in protocol
Mouse - APOE4 e4	Jackson Laboratories	#012307	Homozygous APEO4 e4 mouse bred with hemizyous J20 mouse
Mouse - C57BL/6J	Jackson Laboratories	#000664	Wildtype mouse for controls
Mouse - J20	Jackson Laboratories	#006293	Hemizygous mouse bred with the homozygous APOE e4 mouse to generate cross
Rstudio	R Core Team	V1.1.463	Run with R version 3.5.3 (2019-03-11) -- "Great Truth". Note: additional R Packages are included in provided code and can be installed from CRAN
Soft Cob	Envigo	7087C