קוונפיקציה של מתרבים ותאים מתים ב Enteroids

Summary

הפרוטוקול המוצג משתמש cy, לנסות לכמת את מספר התאים מתרבים ומתים בתוך העכבר התרבותי enteroids. שיטה זו שימושית להערכת ההשפעות של טיפול תרופתי בשגשוג והישרדות של אורגנואיד.

Abstract

אפיתל המעי משמש מחסום המונע תוכן הלומיאלי, כגון מיקרוביוטה פתוגניים ורעלים, מלהיכנס לשאר הגוף. תפקוד המכשול אפיתל דורש שלמות של תאים אפיתל המעי. בעוד התפשטות התא אפיתל שומרת על שכבה רציפה של תאים המהווה מחסום, נזק אפיתל מוביל לתפקוד המכשול. כתוצאה מכך, תוכן הלומיאל יכול לחצות את מחסום המעי דרך מסלול בלתי מוגבל. התפקוד של מחסום המעיים נקשר למחלות מעיים רבות, כגון מחלות מעי דלקתיות. מבודד עכבר מעיים קריפטים יכול להיות תרבותי ומתוחזק כמו קריפטה-villus מבנים כמו, אשר מכונים אורגנואידים מעיים או "enteroids". בידור הם אידיאליים ללמוד את התפשטות ומוות התאים של תאי אפיתל המעי בתוך מבחנה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה פשוטה לכמת את מספר התאים המתרבים והמתים בידור תרבותי. 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ו propidium יודיד משמשים לתווית תאים מתרבים ומתים ב-enteroids, ושיעור של תאים מתרבים ומתים מנותח לאחר מכן על ידי מנתחים cy, לנסות. זהו כלי שימושי כדי לבדוק את ההשפעות של טיפול תרופתי על התפשטות תא אפיתל המעי הישרדות התא.

Introduction

פונקציה יסודית של תאים אפיתל המעי היא להגן על כניסת תוכן הלומיאל כגון חיידקים פתוגניים ורעלים^1,2. כדי לבצע פונקציה כזו, תאי גזע המעיים ברציפות מתרבים ולהבדיל למגוון של תאים אפיתל, כולל בידור תאים הפרשה, אשר יוצרים מכשול על ידי יצירת קשרים הדוקים³. התחדשות מהירה של תאים אפיתל המעי דורש תיאום מחמיר של התפשטות התא, בידול התא, ואת המוות התאים^4,5. הפצת תאים מופחתת או מוות מופרז של תאים מוביל נזק אפיתל ופגיעה בתפקוד המכשול^1,6. תפקוד של מכשול המעיים שויך מחלות מעיים דלקתיות^7,8.

שיטה לקריפטטים מעיים תרבותי פותחה בעבר. באמצעות טכניקה זו, עכבר מבודד קריפטים לגדול לתוך מעיים אורגנואידים (enteroids), אשר יש קריפטה-villus כמו מבנים ומכילים את כל השושלת האפיתל המעי תא^9,10. 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) הוא אנלוגי תימידין כי הוא מסוגל להחליף תימין (T) ב-DNA כי עובר שכפול במהלך הפצת תאים. התאים הניתנים להתרבות יכולים להיות מסומנים במהירות ובדייקנות על-ידי EdU מכתים. Propidium יודיד (PI) הוא אנלוגי של אתידיום ברומיד המשחרר את הזריחה האדומה בעת הכניסה לתוך ה-DNA התקוע כפול. PI מזהה באופן ספציפי תאים מתים, שכן הוא עובר רק דרך קרום התא ניזוק.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים תחילה כיצד לבודד קריפטטים מן המעי הקטן מורטין ואז לתרבות אותם כמו בידור בתוך מבחנה. לאחר מכן נתאר כיצד לנתח את התאים המתרבים והמתים ב-enteroids על ידי EdU ו-PI התאגדות וזרימה cy, לנסות.

Protocol

פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה טיפול בעלי חיים והשתמש של קיימברידג '-Suda מרכז משאבים גנומית (CAM-SU) באוניברסיטת Soochow.

1. בידוד ותרבות אורגאיד מעיים

1. בידוד של קריפטטים מעיים ותרבות בידור
   1. המתת חסד בעכבר בן 8 שבועות בסוג פראי עם שאיפת CO₂ . השתמש מלקחיים רקמות ומספריים קשתית עדין כדי לנתח כ 8 ס מ של ileum.
   2. ריקון החוצה באמצעות מזרק עם gavage האכלה מחט עם כ 40 מ ל של מלוחים הקרח קר של Dulbecco של המלח (DPBS), ואז לחתוך לאורכו עם מספריים ולפתוח את ileum.
   3. חותכים את המעי העקום לחתיכות קטנות (0.5-1.0 ס מ). מניחים את החלקים ב 5 מ ל של DPBS קר קירור קרח ב 15 מ"ל שפופרת חרוט, ואז סלע עבור 5 דקות על הקרח.
   4. השתמש בבקר הצינורות כדי לבשל את DPBS ולהחליף אותו עם 10 מ ל של מאגר קר 1 (2mm EDTA ב DPBS). . רוק ל -30 דקות על הקרח
   5. השתמש בבקר הפיפטה כדי לבשל מאגר 1 ולהחליף עם 10 מ ל של מאגר קר 2 (54.9 מ"מ D-sorbitol, 43.4 mM סוכות ב DPBS). נענעי עבור 2-3 דקות ביד (~ 80 שייקים/דקות).
   6. קח את droplet 20 μL של מאגר 2 תוכן לאחר טלטול ולבדוק תחת מיקרוסקופ.
   7. מסנן מאגר 2 תוכן עם מסננת תא 70 יקרומטר מעוקר, ולאחר מכן לאסוף את המאגר המסונן עם צינור 50 mL חרוט.
   8. פיפטה 20 μl של פילטרט על השקופית כדי לספור את הקריפטטים. העבר נפח מספיק של מאגר 2 משלב 1.1.7 כדי להבטיח כי יש ~ 500 הקריפטטים/טוב.
   9. ספין למטה ב 150 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. , ברגע שמסתובב מסתובב. הוא מזהם את הסופרנטאנט בזהירות
   10. להשעות קריפטטים ב 50 μL של מטריצה מרתף ממברנה (g., מטריצות) לכל 500 קריפטטים, פיפטה למעלה ולמטה (להיות זהיר כדי למנוע בועות), ואז למקם 50 μL droplet של מטריצה קרום מרתף/קריפטה לערבב במרכז של אחד טוב בצלחת 24. מודדת במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפולימלמטריקס מטריצות קרום מרתף.
   11. לאחר 30 דקות של פולימוניזציה, בקפידה להוסיף 600 μL של מדיה מיניגוט (מתקדם בינונית הנשר המתוקן של החברה [DMEM]/F12, 2 מ"מ L-alanine-L-גלוטמין, עט/דלקת [100 יחידות/mL], 10 מ"מ Hepes, תוספת N2 [1:100], B27 תוספת [1:50] עם פקטור גידול עוריות [EGF; 50 ng/mL], הראש [100 ng/mL], R-החתן [500 ng/mL], ו Y27632 [10 μM]) לכל באר, ואז להחזיר את הצלחת לחממה 37 ° c. שימו לב תחת מיקרוסקופ כל יום, והחליפו את התקשורת כל שניים-שלושה ימים.
2. הבעת ההתיישנות
   הערה: בתרבויות ארוכות יש לפצל את המרכנואידים בקירוב בכל שבוע.
   1. , כדי לעבור את המרכנואידים. הניחו את צלחת תרבות הרקמה על הקרח ולהוסיף 1 מ ל של DPBS קר לכל טוב. השתמש בטיפ P1000 לפיפטה למעלה ולמטה עד שלא יישארו נתחי מטריצות מוצקים של קרום המרתף.
   2. מעבר למעלה ולמטה פעם אחת באמצעות מזרק אינסולין 1 מ ל (27 גר') ולתוך צינורית חרוט של 15 מ ל. ספין למטה עבור 5 דקות ב 150 x g ב 4 ° c.
   3. השתמש בפיפטה כדי להסיר את DPBS. השהה מחדש ב-50 μL של מטריצת קרום המרתף/ובכן.
   4. מניחים את הצלחת בחממה 37 ° c עבור 30 דקות כדי לאפשר מטריצת קרום מרתף פולימלזציה. כיסוי כל טוב עם 600 μL של מדיה ENR (מיניגוט מדיה, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL ראש, 500 ng/mL R-החתן), ואז להחזיר את הצלחת לחממה.

2. הזרימה Cy, ניתוח של תאים EdU-חיוביים ב-Enteroids

הערה: איור 1 מציג את זרימת העבודה עבור ניתוח cy, המנסה של תאים של EdU-חיוביים ב-enteroids.

1. דגירה של בידור עם EdU
   1. לגדול enteroids משלב 1.2.4 עבור 5 – 7 ימים. מעבר בידור לתוך צלחת חדשה 24 טוב ביחס מפצל של 1:2. הוסף 600 μL של מדיום ENR לכל באר. מיכל הדגירה 4-5 ימים בחממה 37 ° c.
   2. הגדר את קבוצת הביקורת (בידור לא מטופל) ואת הקבוצה הניסיונית (בידור שטופלו עם 5 ng/mL באינטרלוקין 22 [IL-22]). הכינו לפחות שלוש משכפל עבור כל קבוצה.
   3. הוסף את EdU למדיום ENR כדי להכין את מדיום EdU עם ריכוז של 50 μM. הוסף 600 μL של EdU מדיום לכל טוב ומארג עבור 2 h בחממה 37 ° c. הגדר באר אחת של בידור ללא הטיפול ב-EdU כפקד שלילי לחיסור הרקע.
2. קציר של בידור מתוך מטריצת קרום המרתף
   1. השתמש בבקר פיפטה לאספירין בינונית EdU ולשטוף 1x עם DPBS. הוסף 1 מ ל של DPBS.
   2. השתמש בP1000 הקצה ובפיפטה למעלה ולמטה עד שאין נתחי מטריצות מוצקים של קרום המרתף יישארו. העבר לצינור 15 מ"ל ו ספין למטה ב 300 x g עבור 5 דקות. לבטל את הסופרנטאנט.
   3. הוסף 500 μL של אנזימי תא-דיסוציאציה (טבלת חומרים) ו-דגירה עבור 15 דקות ב 37 ° c. השתמש בP200 הקצה ובפיפטה למעלה ולמטה כדי לשבור את הenteroids תאים בודדים.
   4. הוסף 3 מ ל של מדיום DMEM בינונית המכילה 10% סרום של שור עוברי (FBS) ו פיפטה שוב ושוב עם טיפ P1000.
   5. ספין למטה ב 300 x g עבור 5 דקות ומכה את המדיום supernatant. השהה מחדש את התאים באמצעות 1 מ ל של DPBS.
3. קיבעון וחדירות של תאים
   1. העבר את ההשעיה התא לצינור 1.5 mL, ספין למטה ב 300 x g עבור 5 דקות, ולהיפטר supernatant.
   2. להשעות את התאים עם 1 מ ל של 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית), לתקן עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT), ו ספין למטה ב 300 x g עבור 5 דקות. מרוב הסופרנטאנט עם טיפ פיפטה, לשטוף 1X עם dpbs, ו ספין למטה כדי להסיר את הסופרנטאנט.
   3. השהה מחדש תאים עם 1 מ ל של 0.5% nonionic. דגירה עבור 10 דקות ב RT.
   4. ספין למטה ב 300 x g עבור 5 דקות ומכה את הסופרנטאנט. שטוף 1x עם DPBS ו ספין למטה כדי להסיר את הסופרנטאנט.
4. זיהוי של EdU
   1. הכנת פתרונות מניות עבור כל רכיב מראש: 1) פתרון עבודה של מאגר התגובות אלקסה Fluor, 2) פתרון עבודה של 1 x EdU התגובה במאגר, ו 3) מניות 10x פתרון של התוסף מאגר של EdU.
   2. הכינו את תוסף המאגר של 1x EdU על-ידי דילול הפתרון ה1:10 של 10x במים מאוהים. . הכינו את התמיסה הזו רעננה
   3. הכינו קוקטייל תגובה לפי שולחן 1.
      הערה: הוסף את המרכיבים בסדר המפורט בטבלה. השתמש בקוקטייל התגובה בתוך 15 דקות של הכנה.
   4. הוסף 100 μL של קוקטיילים התגובה לכל שפופרת 1.5 mL. להשעות מחדש את התאים, להגן מפני אור, הדגירה עבור 30 דקות ב RT.
   5. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ומכה את פתרון התגובה עם טיפ פיפטה בעדינות.
   6. הוסף 0.5% nonionic חומרים פעילי שטח החדירה לצינור כל לשטוף 1 x ב RT. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות, מטפי את supernatant עם טיפ בעדינות, ולהשעות מחדש את התאים 1 מ ל של dpbs.
5. ניתוח תאים על ידי הציטוקימטריה
   1. סנן את התאים שהושעו מחדש עם מסננת מ40 יקרומטר, ולאחר מכן אסוף את התאים המסוננים באמצעות צינורית חרוט של 15 מ"ל. בצע זיהוי של FACS במחשב בהקדם האפשרי.
      הערה: אם התנאים מוגבלים, יש לאחסן את הדגימות המוכתמת בתא בחשיכה ב-4 ° c ובדיקת זרימה תוך 3 ימים.
   2. בחר את הערוץ המתאים (בהתאם לסוג של אלקסה fluor אזיד ב-EdU kit; כאן, ערוץ אדום) ומתח (כאן, ~ 150 – 350 V) עבור הניתוח cy, מנסה להזרים.
   3. אסטרטגיית מדון
      1. ציירו מזימה מדומה של FSC-A (ציר x) לעומת מדינת מדינת-מדינת-מדינת-מדינת-מדינת-התחתית (ציר y) והפיצו את רוב התאים לטווח הגלוי של מפת הנקודות על-ידי התאמת המתח. בחר את אוכלוסיית התא (R1) והוצא את הריסות התאים בפינה השמאלית התחתונה.
      2. מאוכלוסיית התאים R1, צור FSC-A (ציר x) vs. מגרש צבע מדומה FSC-H (ציר y) והגדר את השער כדי לבחור תאים בודדים (R2) כדי לכלול את האפשרות של קיבוץ תאים.
      3. מאוכלוסיית התאים R2, צור את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית (ציר x) לעומת מספר תא (ציר y), והשתמש בפקד השלילי כדי להגדיר את השער. האזור של אות הפלורסנט הוא אזור תא חיובי (R3). השוואת היחס של תאים EdU-חיוביים (R3) בין קבוצות הניסוי והבקרה.

3. הזרמת Cy, ניתוח של תאי PI-חיוביים במרכנואידים

הערה: איור 2 מציג את זרימת העבודה עבור הניתוח cy, מנסה הזרימה של תאים PI-חיוביים ב-enteroids.

1. דגירה של תאים enteroid עם PI
   1. לגדול enteroids משלב 1.2.4 עבור 5 – 7 ימים. מעבר בידור לתוך צלחת חדשה 24 טוב ביחס מפצל של 1:2. הוסף 600 μL של מדיום ENR לכל באר. מיכל הדגירה 4-5 ימים בחממה 37 ° c.
   2. הגדר את קבוצת הפקדים (לא מטופלת) והקבוצה הניסיונית (IL-22 שטופלו), תוך שימוש בשלוש משכפל עבור כל קבוצה לפחות.
   3. הוסף PI למדיום ENR כדי להכין מדיום PI עם ריכוז של 3 μM.
   4. הוסף 600 μL של מדיום PI לכל טוב ומארג עבור 30 דקות בחממה 37 ° c. להגדיר היטב אחד של בידור ללא טיפול PI כפקד שלילי לחיסור הרקע.
2. קציר בידור מתוך מטריקס קרום המרתף בעקבות צעדים 2.2.1-2.2.5.
3. ניתוח תאים על ידי הציטוקימטריה
   1. סנן את התאים שהושעו מחדש עם מסננת מ40 יקרומטר ואסוף את התאים המסוננים באמצעות צינורית חרוט של 15 מ ל.
   2. בצע זיהוי של FACS במחשב בהקדם האפשרי.
      הערה: אם התנאים מוגבלים, יש לאחסן את הדגימות המוכתמת בתא בחשיכה ב-4 ° c ובדיקת זרימה תוך 3 ימים.
   3. בחר את הערוץ המתאים (כאן, ערוץ אדום) ומתח (כאן, ~ 150 – 350 V) לצורך הזרמת הניתוח cy,.
   4. השתמש באותה אסטרטגית העליה כמתואר בסעיף 2.5.3.

תוצאות

קריפטטים מעיים קטנים היו מבודדים ומתורבתים כמו בידור בתוך מטריצת קרום המרתף. בידור החל ליצור ניצנים 2 ימים לאחר בידוד. ביום 6, enteroids היו ניצנים רבים עם המון פסולת (תאים מתים) ב לומן. המונונואידים היו מוכנים להיות בשלב זה (איור 3).

מחקרים רבים הראו כי ציטוקינים דל?...

Discussion

פרוטוקול זה מפרט את הצעדים הנחוצים לתרבות של בידור באמצעות מבחנה וכימות של תאים של EdU ו-PI-חיוביים ב-enteroids על ידי הזרמת cy, try. יש מספר יתרונות של אסטרטגיה זו. ראשית, התוויות של EdU משמשות לזיהוי תאים מתרבים ב-enteroids. בהשוואה לשיטת BrdU המסורתית, שיטת התיוג של EdU היא מהירה יותר, רגישה יותר ומדויקת יותר....

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml centrifuge tube	Corning	430791
22 G gavage needle	VWR	20068-608
24-well plate	Nunc	142475
40 mm sterile cell strainer	BD	352340
50 ml centrifuge tube	Corning	430829
70 mm sterile cell strainer	BD	352350
Advanced DMEM/F-12	GIBCO	12634010
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer	Invitrogen	A24863
B-27 Supplement	GIBCO	17504044
Buffer 1			2 mM EDTA in DPBS
Buffer 2			54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS
C57/B6 mice	Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University
Cell-dissociation enzymes (TrypLE)	Life technologies	12605-010
Centrifuge	Eppendorf	5424
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit	Life technologies	C10639
CO2 incubator	Panasonic	MCO-18AC
DPBS	GIBCO	14190144
D-sorbitol	BBI	SB0491
EDTA	BBI	EB0185
ENR media			Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106
Fine Iris Scissors	Tansoole	2037454
Fluorescence microscope	Olympus	FV1000
GlutaMAX Supplement	GIBCO	35050-061
Goat Serum	Life technologies	16210-064
HDMEM	Hyclone	SH30243.01B
HEPES	Sigma	H4034
Matrigel	Corning	356231
Minigut media			Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50)
N2 supplement	R&D	AR009
Nonionic surfactant (Triton X)	BBI	TB0198-500ML
Operating Scissor (12.5 cm)	Tansoole	2025785
Paraformaldehyde (PFA)	sigma	158127-500g
Penn/Strep	Invitrogen	15140-148
Phase contrast microscope	Nikon	TS1000
Propidium iodide	Sigma	P4170-25MG
Recombinant EGF	PeproTech	315-09
Recombinant Mouse Noggin	PeproTech	250-38
Recombinant Mouse R-Spondin 1	R&D	3474-RS-050
Recombinant Murine IL-22	PeproTech	210-22-10
Sucrose	BBI	SB0498
Tissue Forceps	Tansoole	2026704
Y-27632 2HC1	Selleck	S1049