Enteroidlerde Proliferatif ve Ölü Hücrelerin Sayısallaştırılması

Özet

Sunulan protokol, kültürlü fare enteroidlerinde çoğalan ve ölü hücrelerin sayısını ölçmek için akış sitometrisini kullanır. Bu yöntem, ilaç tedavisinin organoid proliferasyon ve sağkalım üzerindeki etkilerini değerlendirmek için yararlıdır.

Özet

Bağırsak epiteli, patojenik mikrobiyota ve toksinler gibi luminal içeriğin vücudun geri kalanına girmesini engelleyen bir bariyer görevi görür. Epitel bariyer fonksiyonu bağırsak epitel hücrelerinin bütünlüğünü gerektirir. Epitel hücre çoğalması bir bariyer oluşturan hücrelerin sürekli bir tabaka korurken, epitel hasarı bariyer disfonksiyon yol açar. Sonuç olarak, luminal içeriği sınırsız bir yol ile bağırsak bariyerini geçebilirsiniz. Bağırsak bariyerinin disfonksiyonu inflamatuar barsak hastalığı gibi birçok bağırsak hastalığı ile ilişkili olmuştur. İzole fare bağırsak mahzenleri kültürlenebilir ve bağırsak organoidleri veya "enteroidler" olarak adlandırılan crypt-villus benzeri yapılar olarak korunabilir. Enteroidler in vitro bağırsak epitel hücrelerinin proliferasyonu ve hücre ölümünü incelemek için idealdir. Bu protokolde, kültürlü enteroidlerde proliferatif ve ölü hücrelerin sayısını ölçmek için basit bir yöntem açıklıyoruz. 5-ethynyl-2'-deoksiürin (EdU) ve propidium iyodür enteroidlerde çoğalan ve ölü hücreleri etiketlemek için kullanılır ve çoğalan ve ölü hücrelerin oranı daha sonra akış sitometrisi tarafından analiz edilir. Bu bağırsak epitel hücre proliferasyonu ve hücre sağkalım üzerinde ilaç tedavisinin etkilerini test etmek için yararlı bir araçtır.

Giriş

Bağırsak epitel hücrelerinin temel bir işlevi patojenik bakteri ve toksinler 1 gibi luminal içeriğin girişini korumaktır^{1 ,2}. Böyle bir işlevi gerçekleştirmek için, bağırsak kök hücreleri sürekli çoğalır ve epitel hücrelerinin çeşitli farklılaştırmak, enterositler ve salgı hücreleri de dahil olmak üzere, hangi sıkı bağlantılar oluşturarak bir bariyer oluşturan³. Bağırsak epitel hücrelerinin hızlı yenilenmesi hücre çoğalması sıkı koordinasyon gerektirir, hücre farklılaşması, ve hücre ölümü^4,5. Azaltılmış hücre çoğalması veya aşırı hücre ölümü epitel hasarına ve tehlikeye bariyer fonksiyonu¹yol açar^,6. Bağırsak bariyerinin disfonksiyonu inflamatuar barsak hastalıkları ile ilişkili olmuştur^7,8.

Bağırsak mahzenlerini kültüre kazandıracak bir yöntem daha önce geliştirilmiştir. Bu tekniği kullanarak, izole fare crypts bağırsak organoidler (enteroidler), yapıları gibi crypt-villus ve tüm bağırsak epitel hücre soy⁹içeren içine büyür^{9 ,10}. 5-Ethynyl-2'-deoksiürin (EdU), hücre çoğalması sırasında replikasyon alabilen DNA'da timin (T) yerine geçen bir timin analogudur. Proliferatif hücreler EdU boyama ile hızlı ve doğru bir şekilde etiketlenebilir. Propidium iyodür (PI), çift iplikçikli DNA'ya yerleştirildiğinde kırmızı floresan salan ethidyum bromür analogudur. PI özellikle ölü hücreleri algılar, çünkü sadece hasarlı hücre zarından geçer.

Bu protokolde, önce minürikten mahzenlerin nasıl izole edilebildiğini sonra onları in vitro enteroid olarak kültürlediğimizi anlatıyoruz. Daha sonra EdU ve PI birleşme ve akış sitometrisi tarafından enteroidlerde proliferatif ve ölü hücrelerin nasıl analiz edilebildiğini açıklarız.

Protokol

Bu protokol Soochow Üniversitesi Cambridge-Suda Genomik Kaynak Merkezi (CAM-SU) Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Bağırsak Organoid İzolasyon ve Kültür

1. Bağırsak mahzenlerinin ve enteroid kültürün izole edilmesi
   1. CO₂ soluma ile 8 haftalık vahşi fare ötenazi. Ileum yaklaşık 8 cm incelemek için doku forceps ve ince iris makas kullanın.
   2. Yaklaşık 40 mL buz gibi soğuk Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ile gavaj besleme iğnesi ile bir şırınga kullanarak dışarı floş, sonra makas ile uzunlamasına kesilmiş ve ileum açın.
   3. Ileum küçük (0,5−1,0 cm) parçalar halinde kesin. 15 mL konik bir tüp içinde steril buz gibi DPBS 5 mL parçaları yerleştirin, sonra buz üzerinde 5 dakika kaya.
   4. DPBS'yi aspire etmek ve 10 mL soğuk tampon 1 (DPBS'de 2 mM EDTA) ile değiştirmek için bir pipet denetleyicisi kullanın. Buz üzerinde 30 dakika kaya.
   5. Tampon 1'i aspire etmek için pipet denetleyicisini kullanın ve 10 mL soğuk tampon 2 (DPBS'de 54,9 mM D-sorbitol, 43,4 mM sakaroz) ile değiştirin. Elle 2−3 dk çalkalayın (~80 sallar/dk).
   6. Salladıktan sonra 20 μL'lik tampon 2 damlacıkalın ve mikroskop altında inceleyin.
   7. Filtre tampon 2 içeriği 70 μm steril hücreli süzgeç ile, sonra 50 mL konik tüp ile filtretampon toplamak.
   8. Pipet 20 μL'lik filtrat, şifreleri saymak için slaytüzerine açılır. ~500 crypts/well olduğundan emin olmak için adım 1.1.7'den yeterli miktarda arabellek 2 aktarın.
   9. 4 °C'de 10 dk için 150 x g'de aşağı doğru dön. İplik bittikten sonra, supernatant'ı dikkatlice aspire edin.
   10. 500 crypts başına 50 μL bodrum membran matris (örneğin, Matrigel) crypts askıya, pipet yukarı ve aşağı (kabarcıklar önlemek için dikkatli olmak), sonra bir kuyunun ortasına 50 μL bodrum membran matris / crypt karışımı bir 24 kuyu plaka içinde bir damlacık yerleştirin. 37 °C'de 30 dakika kuluçka ya da bazal membran matrisini polimerize edin.
   11. 30 dk polimerizasyondan sonra, 600 μL minigut media (gelişmiş Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı [DMEM]/F12, 2 mM L-alanin-L-glutamin, kalem/strep [100 adet/mL], 10 mM Hepes, N2 takviyesi [1:100], B27 ek [1:50] epidermal büyüme faktörü ile [EGF; 50 ng / mL], Noggin [100 ng / mL], R-spondin [500 ng /mL], ve Y27632 [10 μM]) her kuyuya plaka dönmek, sonra 37 ° C incubartorr. Her gün mikroskop altında gözlemleyin ve her 2−3 günde bir ortamı değiştirin.
2. Enteroid geçiş
   NOT: Uzun kültürler için enteroidler yaklaşık her hafta bölünmelidir.
   1. Enteroidleri geçiş için doku kültür plakasını buzüzerine yerleştirin. Ortamı aspire edin ve her kuyuya 1 mL soğuk DPBS ekleyin. Katı bir bodrum membran matris parçaları kalana kadar pipet yukarı ve aşağı bir P1000 ucu kullanın.
   2. 1 mL'lik insülin şırıngasından (27 G) bir kez yukarı ve aşağı bir şekilde 15 mL konik tüpe geçirin. 4 °C'de 150 x g'de 5 dk aşağı doğru dön.
   3. DPBS kaldırmak için pipet kullanın. 50 μL'lik bazal membran matris/kuyuda resuspend.
   4. Taban membran matrisinin polimerize olmasını sağlamak için plakayı 30 dakika boyunca 37 °C'lik bir kuluçka makinesine yerleştirin. Her kuyuyu 600 μL ENR ortam (minigut media, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, 500 ng/mL R-spondin) ile yerleştirin ve tabağı kuvöze geri döndürün.

2. Enteroidlerde EdU-pozitif Hücrelerin Akış Sitometri Analizi

NOT: Şekil 1 enteroidlerde EdU-pozitif hücrelerin akış sitometri analizi için iş akışını gösterir.

1. EdU ile enteroidlerin kuluçka
   1. 5-7 gün boyunca adım 1.2.4 gelen enteroids büyümek. Geçit 1:2 bir bölme oranı yeni bir 24 kuyu plaka içine girer. Her kuyuya 600 μL ENR orta ekleyin. 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde 4−5 gün kuluçkaya yayılın.
   2. Kontrol grubunu (işlenmemiş enteroidler) ve deney grubunu (5 ng/mL interlökin 22 [IL-22] ile tedavi edilen enteroidler) ayarlayın. Her grup için en az üç çoğaltma hazırlayın.
   3. 50 μM konsantrasyonu ile EdU ortamı hazırlamak için ENR ortamına EdU ekleyin. Her kuyuya 600°L EdU orta ekleyin ve 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde 2 saat kuluçkaya yatırın. Arka plan çıkarma için olumsuz bir kontrol olarak EdU tedavisi olmadan enteroids bir kuyu ayarlayın.
2. İnatçı ların bazal membran matrisinden hasadı
   1. EdU orta aspire ve DPBS ile 1x yıkamak için bir pipet denetleyicisi kullanın. 1 mL DPBS ekleyin.
   2. Katı bir bodrum membran matris parçaları kalana kadar P1000 pipet ucu ve pipet yukarı ve aşağı kullanın. 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 300 x g'de 5 dk. Supernatant'ı atın.
   3. Hücre ayrıştırma enzimlerinin 500 μL'sini(Malzeme Tablosu)ekleyin ve 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın. Tek hücrelere enteroids kırmak için Yukarı ve aşağı P200 pipet ucu ve pipet kullanın.
   4. %10 fetal sığır serumu (FBS) içeren 3 mL DMEM ortamı ve p1000 pipet ucu ile tekrar tekrar pipet ekleyin.
   5. 5 dk için 300 x g aşağı spin ve supernatant orta aspire. 1 mL DPBS ile hücreleri yeniden askıya alın.
3. Hücrelerin fiksasyonu ve permeabilizasyonu
   1. Hücre süspansiyonuna 1,5 mL'lik bir tüp aktarın, 5 dk boyunca 300 x g'de aşağı doğru döndürün ve süpernatant'ı atın.
   2. 1 mL%4 paraformaldehit (PFA) ile hücreleri yeniden askıya alın, oda sıcaklığında 15 dakika (RT) için düzeltin ve 5 dk. bir pipet ucu ile supernatant aspire 300 x g aşağı spin, DPBS ile 1x yıkayın ve supernatant kaldırmak için aşağı spin.
   3. 1 mL%0.5 noniyonik yüzey aktif maddeli hücreleri resuspend. RT'de 10 dakika kuluçka.
   4. 5 dk için 300 x g aşağı spin ve supernatant aspire. DPBS ile 1x yıkayın ve supernatant kaldırmak için aşağı spin.
4. EdU tespiti
   1. Önceden her bileşen için stok çözümleri hazırlayın: 1) Alexa Fluor azide çalışma çözümü, 2) 1x EdU reaksiyon tampon çalışma çözümü, ve 3) EdU tampon katkı 10x stok çözeltisi.
   2. 10x çözeltisini deiyonize suda 1:10 seyrelterek 1x EdU tampon katkı maddesi hazırlayın. Bu çözümü taze hazırlayın.
   3. Tablo 1'egöre reaksiyon kokteyli hazırlayın.
      NOT: Malzemeyi tabloda listelenen sıraya ekleyin. Reaksiyon kokteylini hazırlıktan sonraki 15 dakika içinde kullanın.
   4. Her 1,5 mL tüpe 100 μL reaksiyon kokteyli ekleyin. Hücreleri yeniden askıya alın, ışıktan koruyun, RT'de 30 dakika kuluçkaya yatın.
   5. 5 dk için 300 x g santrifüj ve pipet ucu ile reaksiyon çözeltisi hafifçe aspire.
   6. RT. Centrifuge 5 dakika için 300 x g 1x yıkamak için her tüp% 0.5 niyonik yüzey aktif penetrant ekleyin, yavaşça pipet ucu ile supernatant aspire, ve DPBS 1 mL hücreleri yeniden askıya.
5. Akış sitometrisi ile hücrelerin analizi
   1. Resuspended hücreleri 40 μm süzgeçle filtreleyin, ardından filtrelenmiş hücreleri 15 mL konik tüple toplayın. FACS makine de en kısa sürede algılama gerçekleştirin.
      NOT: Koşullar sınırlı ise, hücre lekeli numuneler 4 °C'de karanlıkta saklanmalı ve 3 gün içinde akış testi yapılmalıdır.
   2. Akış sitometri sitometrisi analizi için uygun kanalı (EdU kitindeki Alexa Fluor azide türüne göre; burada, kırmızı kanal) ve voltajı (burada ~ 150-350 V) seçin.
   3. Gating stratejisi
      1. Bir FSC-A (x ekseni) ile SSC-A (y ekseni) psödorenk çizimi çizin ve gerilimi ayarlayarak hücrelerin çoğunu nokta haritasının görünür aralığına dağıtın. Hücre popülasyonu (R1) seçin ve sol alt köşedeki hücre enkazını hariç tut.
      2. R1 hücre popülasyonundan, bir FSC-A (x-ekseni) ve. FSC-H (y ekseni) psödorenk çizimve hücre kümelerini dışlamak için tek hücre (R2) seçmek için kapıyı ayarlayın.
      3. R2 hücre popülasyonundan floresan yoğunluğunu (x-ekseni) vs. hücre numarası (y ekseni) çizimi ve negatif denetimi kullanarak geçidi ayarlayın. Floresan sinyalin bölgesi pozitif hücre bölgesidir (R3). EdU-pozitif hücrelerin (R3) deney ve kontrol grupları arasındaki oranını karşılaştırın.

3. Enteroidlerde PI-pozitif Hücrelerin Akış Sitometri Analizi

NOT: Şekil 2 enteroidlerde PI-pozitif hücrelerin akış sitometri analizi için iş akışını göstermektedir.

1. PI ile enteroid hücrelerin kuluçka
   1. 5-7 gün boyunca adım 1.2.4 gelen enteroids büyümek. Geçit 1:2 bir bölme oranı yeni bir 24 kuyu plaka içine girer. Her kuyuya 600 μL ENR orta ekleyin. 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde 4−5 gün kuluçkaya yayılın.
   2. Her grup için en az üç çoğaltma kullanarak kontrol grubunu (işlenmemiş) ve deney grubunu (IL-22 tedavi) ayarlayın.
   3. 3 μM konsantrasyonu ile PI ortamı hazırlamak için ENR ortamına PI ekleyin.
   4. Her kuyuya 600°L PI orta ekleyin ve 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde 30 dakika kuluçkaya yatırın. Arka plan çıkarma için olumsuz bir kontrol olarak PI tedavisi olmadan enteroidler bir kuyu ayarlayın.
2. 2.2.1−2.2.5 adımlarını takiben bazal membran matrisinden enteroidler hasat.
3. Akış sitometrisi ile hücrelerin analizi
   1. Resuspended hücreleri 40 μm süzgeçle filtreleyin ve filtrelenmiş hücreleri 15 mL konik tüple toplayın.
   2. FACS makine de en kısa sürede algılama gerçekleştirin.
      NOT: Koşullar sınırlı ise, hücre lekeli numuneler 4 °C'de karanlıkta saklanmalı ve 3 gün içinde akış testi yapılmalıdır.
   3. Akış sitometri analizi için uygun kanalı (burada, kırmızı kanal) ve gerilimi (burada~ 150-350 V) seçin.
   4. Bölüm 2.5.3'te açıklandığı gibi aynı gating stratejisini kullanın.

Sonuçlar

İnce bağırsak mezarları izole edildi ve bazal membran matrisinde enteroid olarak kültürlendi. Enteroidler izolasyondan 2 gün sonra tomurcuk oluşturmaya başladılar. 6. günde, enteroidlerin lümeninde çok sayıda enkaz (ölü hücre) olan birçok tomurcukları vardı. Enteroidler bu aşamada geçilmeye hazırdı (Şekil 3).

Çok sayıda çalışma inflamatuar sitokinler bağırsak epitel homeostaz bakımı için gerekli olduğunu göstermiştir. İnflama...

Tartışmalar

Bu protokol, enteroidlerin in vitro kültürü için gerekli adımları ve akış sitometrisi ile enteroidlerde EdU ve PI-pozitif hücrelerin sayısallaştırılmasını ayrıntılarıyla anlatır. Bu stratejinin çeşitli avantajları vardır. İlk olarak, EdU etiketleme enteroidler çoğalan hücreleri algılamak için kullanılır. Geleneksel BrdU çıktısı ile karşılaştırıldığında, EdU etiketleme yöntemi daha hızlı, daha hassas ve daha doğrudur. EdU, hücre bölünmesi sırasında DNA sentezinde timinin...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml centrifuge tube	Corning	430791
22 G gavage needle	VWR	20068-608
24-well plate	Nunc	142475
40 mm sterile cell strainer	BD	352340
50 ml centrifuge tube	Corning	430829
70 mm sterile cell strainer	BD	352350
Advanced DMEM/F-12	GIBCO	12634010
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer	Invitrogen	A24863
B-27 Supplement	GIBCO	17504044
Buffer 1			2 mM EDTA in DPBS
Buffer 2			54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS
C57/B6 mice	Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University
Cell-dissociation enzymes (TrypLE)	Life technologies	12605-010
Centrifuge	Eppendorf	5424
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit	Life technologies	C10639
CO2 incubator	Panasonic	MCO-18AC
DPBS	GIBCO	14190144
D-sorbitol	BBI	SB0491
EDTA	BBI	EB0185
ENR media			Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106
Fine Iris Scissors	Tansoole	2037454
Fluorescence microscope	Olympus	FV1000
GlutaMAX Supplement	GIBCO	35050-061
Goat Serum	Life technologies	16210-064
HDMEM	Hyclone	SH30243.01B
HEPES	Sigma	H4034
Matrigel	Corning	356231
Minigut media			Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50)
N2 supplement	R&D	AR009
Nonionic surfactant (Triton X)	BBI	TB0198-500ML
Operating Scissor (12.5 cm)	Tansoole	2025785
Paraformaldehyde (PFA)	sigma	158127-500g
Penn/Strep	Invitrogen	15140-148
Phase contrast microscope	Nikon	TS1000
Propidium iodide	Sigma	P4170-25MG
Recombinant EGF	PeproTech	315-09
Recombinant Mouse Noggin	PeproTech	250-38
Recombinant Mouse R-Spondin 1	R&D	3474-RS-050
Recombinant Murine IL-22	PeproTech	210-22-10
Sucrose	BBI	SB0498
Tissue Forceps	Tansoole	2026704
Y-27632 2HC1	Selleck	S1049