Quantification des cellules proliférantes et mortes chez les entéroïdes

Résumé

Le protocole présenté utilise la cytométrie de flux pour quantifier le nombre de cellules proliférantes et mortes dans les entéroïdes de souris cultivés. Cette méthode est utile pour évaluer les effets du traitement médicamenteux sur la prolifération et la survie des organoïdes.

Résumé

L'épithélium intestinal agit comme une barrière qui empêche le contenu luminal, comme le microbiote pathogène et les toxines, d'entrer dans le reste du corps. La fonction de barrière épithéliale exige l'intégrité des cellules épithéliales intestinales. Tandis que la prolifération épithéliale de cellules maintient une couche continue de cellules qui forme une barrière, les dommages épithélial mènent au dysfonctionnement de barrière. En conséquence, le contenu luminal peut traverser la barrière intestinale par une voie sans restriction. La dysfonction de la barrière intestinale a été associée à de nombreuses maladies intestinales, telles que les maladies inflammatoires de l'intestin. Les cryptes intestinales isolées de souris peuvent être cultivées et maintenues comme structures crypt-villus-like, qui sont appelées organoïdes intestinaux ou « entéroïdes ». Les entéroïdes sont idéaux pour étudier la prolifération et la mort cellulaire des cellules épithéliales intestinales in vitro. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode simple pour quantifier le nombre de cellules prolifératives et mortes dans les entéroïdes cultivés. 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) et propidium iodide sont utilisés pour étiqueter la prolifération et les cellules mortes dans les entéroïdes, et la proportion de cellules proliférantes et mortes sont ensuite analysées par cytométrie de flux. Il s'agit d'un outil utile pour tester les effets du traitement médicamenteux sur la prolifération épithéliale intestinale et la survie cellulaire.

Introduction

Une fonction fondamentale des cellules épithéliales intestinales est de protéger l'entrée de contenus luminaltels tels que les bactéries pathogènes et les toxines^1,2. Pour remplir une telle fonction, les cellules souches intestinales prolifèrent et se différencient continuellement en une variété de cellules épithéliales, y compris les entéroocytes et les cellules sécrétrices, qui forment une barrière en formant des connexions serrées³. Le renouvellement rapide des cellules épithéliales intestinales exige la coordination stricte de la prolifération cellulaire, de la différenciation cellulaire, et de la mort cellulaire^4,5. La prolifération cellulaire réduite ou la mort cellulaire excessive entraîne des dommages épithéliales et une fonction de barrière compromise^1,6. La dysfonction de la barrière intestinale a été associée aux maladies inflammatoires d'entrailles^7,8.

Une méthode de culture des cryptes intestinales a déjà été développée. En utilisant cette technique, les cryptes de souris isolées se développent en organoïdes intestinaux (entéroïdes), qui ont des crypte-villus comme des structures et contiennent toutes les lignées épithéliales intestinales^9,10. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) est un analogue thymidine qui est capable de remplacer la thymine (T) dans l'ADN qui subit une réplication pendant la prolifération cellulaire. Les cellules proliférantes peuvent être rapidement et avec précision étiquetées par la coloration EdU. Propidium iodide (PI) est un analogue du bromure d'éthidium qui libère la fluorescence rouge lors de l'insertion dans l'ADN à double brin. PI détecte spécifiquement les cellules mortes, car il ne passe à travers la membrane cellulaire endommagée.

Dans ce protocole, nous décrivons d'abord comment isoler des cryptes de l'intestin grêle murine puis les culture comme entéroïdes in vitro. Nous décrivons ensuite comment analyser les cellules proliquaires et mortes dans les entéroïdes par l'incorporation et la cytométrie d'écoulement d'EdU et d'IP.

Protocole

Ce protocole a été approuvé par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux du Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU) de l'Université Soochow.

1. Isolation et culture organoïdes intestinaux

1. Isolement des cryptes intestinales et de la culture entéroïde
   1. Euthanasiez une souris sauvage de 8 semaines avec inhalation de CO_2. Utilisez des forceps tissulaires et des ciseaux fins à l'iris pour disséquer environ 8 cm d'ilém.
   2. Rincer à l'aide d'une seringue avec une aiguille d'alimentation gavage avec environ 40 ml de salin tamponné par le phosphate (DPBS) de Dulbecco, puis couper dans le sens de la longueur avec des ciseaux et ouvrir l'ilum.
   3. Couper l'ilédès en petits morceaux (0,5 à 1,0 cm). Placer les morceaux dans 5 ml de DPBS stérile glacé dans un tube conique de 15 ml, puis se balancer pendant 5 min sur glace.
   4. Utilisez un contrôleur de pipette pour aspirer le DPBS et le remplacer par 10 ml de tampon froid 1 (2 mM EDTA en DPBS). Roche pendant 30 min sur glace.
   5. Utilisez le contrôleur de pipette pour aspirer le tampon 1 et remplacer par 10 ml de tampon froid 2 (54,9 mM D-sorbitol, 43,4 mM de saccharose en DPBS). Agiter pendant 2 à 3 min à la main (80 secousses/min).
   6. Prendre une gouttelette de 20 llet de 2 contenus tampon après avoir tremblé et inspecter sous un microscope.
   7. Filtrer le contenu tampon 2 avec une passoire à cellules stériles de 70 m, puis recueillir le tampon filtré avec un tube conique de 50 ml.
   8. Pipette 20 l de filtrate sur la diapositive pour compter les cryptes. Transférer un volume suffisant de tampon 2 à partir de l'étape 1.1.7 pour s'assurer qu'il y a 500 cryptes/puits.
   9. Faire tourner à 150 x g pendant 10 min à 4 oC. Une fois la filature terminée, aspirez soigneusement le supernatant.
   10. Suspendre les cryptes dans 50 L de matrice membranaire du sous-sol (p. ex. Matrigel) par 500 cryptes, pipette de haut en bas (en prenant soin d'éviter les bulles), puis placez une gouttelette de 50 llet de matrice de membrane de sous-sol / mélange de crypte au centre d'un puits dans une plaque de 24 puits. Incuber pendant 30 min à 37 oC pour polymériser la matrice membranaire du sous-sol.
   11. Après 30 min de polymérisation, ajoutez soigneusement 600 l de minigut media (advanced Dulbecco's modified Eagle medium [DMEM]/F12, 2 mM L-alanine-L-glutamine, pen/strep [100 unités/mL], 10 mM Hepes, supplément N2 [1:100], supplément B27 [1:50] avec facteur de croissance épidermique [EGF; 50 ng/mL], Noggin [100 ng/mL], R-spondin [500 ng/mL], et Y27632 [10 M]) à chaque puits, puis retournent la plaque à l'incubateur 37 oC. Observez au microscope chaque jour et changez les médias tous les deux à trois jours.
2. Passaging Enteroid
   REMARQUE : Pour les cultures longues, les entéroïdes doivent être divisés environ chaque semaine.
   1. Pour passer les entéroïdes, placez la plaque de culture tissulaire sur la glace. Aspirez les médias et ajoutez 1 ml de DPBS froid à chaque puits. Utilisez une pointe P1000 pour faire monter et descendre jusqu'à ce qu'il ne reste plus de morceaux solides de matrice de membrane de sous-sol.
   2. Passer de haut en bas une fois à travers une seringue à insuline de 1 ml (27 G) et dans un tube conique de 15 ml. Faire tourner vers le bas pendant 5 min à 150 x g à 4 oC.
   3. Utilisez pipette pour supprimer DPBS. Resuspendre dans 50 L de matrice/puits de membrane de sous-sol.
   4. Placer la plaque dans un incubateur de 37 oC pendant 30 min pour permettre à la matrice de membrane du sous-sol de polymériser. Regroupez chaque puits de 600 oL de supports ENR (minigut media, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, 500 ng/mL R-spondin), puis retournez la plaque à l'incubateur.

2. Analyse de cytométrie de flux des cellules EdU-positives dans les entéroïdes

REMARQUE : La figure 1 montre le flux de travail pour l'analyse de cytométrie de flux des cellules EdU-positives dans les entéroïdes.

1. Incubation d'entéroïdes avec EdU
   1. Cultivez les entéroïdes à partir de l'étape 1.2.4 pendant 5 à 7 jours. Passage enteroids dans une nouvelle plaque de 24 puits dans un rapport de fractionnement de 1:2. Ajouter 600 l de milieu ENR à chaque puits. Incuber les entéroïdes pendant 4 à 5 jours dans un incubateur de 37 oC.
   2. Définir le groupe témoin (entéroïdes non traités) et le groupe expérimental (entéroïdes traités avec 5 ng/mL d'interleukine 22 [IL-22]). Préparer au moins trois répliques pour chaque groupe.
   3. Ajouter de l'EdU au support ENR pour préparer le milieu EdU avec une concentration de 50 M. Ajouter 600 oL de milieu EdU à chaque puits et incuber pendant 2 h dans un incubateur de 37 oC. Définir un puits d'entéroïdes sans traitement EdU comme un contrôle négatif pour la soustraction de fond.
2. Récolte des entéroïdes de la matrice de membrane de sous-sol
   1. Utilisez un contrôleur de pipette pour aspirer le milieu EdU et laver 1x avec DPBS. Ajouter 1 ml de DPBS.
   2. Utilisez la pointe de pipette P1000 et la pipette de haut en bas jusqu'à ce qu'il ne reste plus aucun morceau solide de matrice de membrane de sous-sol. Transférer dans un tube de 15 ml et faire tourner à 300 x g pendant 5 min. Jeter le supernatant.
   3. Ajouter 500 l d'enzymes de dissociation cellulaire(tableau des matériaux)et incuber pendant 15 min à 37 oC. Utilisez la pointe de pipette P200 et la pipette de haut en bas pour décomposer les entéroïdes en cellules simples.
   4. Ajouter 3 mL de milieu DMEM contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et une pipette répétée avec une pointe de pipette P1000.
   5. Faites tourner à 300 x g pendant 5 min et aspirez le milieu supernatant. Resuspendre les cellules avec 1 ml de DPBS.
3. Fixation et perméabilisation des cellules
   1. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 ml, faire tourner à 300 x g pendant 5 min, et jeter le supernatant.
   2. Resuspendre les cellules avec 1 ml de paraformaldéhyde de 4 % (PFA), fixer pendant 15 min à température ambiante (RT) et descendre à 300 x g pendant 5 min. Aspirez le supernatant avec une pointe de pipette, lavez 1x avec DPBS, et faites tourner vers le bas pour enlever le supernatant.
   3. Resuspendre les cellules avec 1 ml de 0,5% de surfactant nonionique. Incuber pendant 10 min à RT.
   4. Faites tourner à 300 x g pendant 5 min et aspirez le supernatant. Laver 1x avec DPBS et tourner vers le bas pour enlever le supernatant.
4. Détection de l'EdU
   1. Préparer des solutions de stock pour chaque composant à l'avance: 1) solution de travail de l'azide Alexa Fluor, 2) solution de travail de 1x tampon de réaction EdU, et 3) 10x solution de stock de l'additif tampon EdU.
   2. Préparer 1x Additif tampon EdU en diluant la solution 10x 1:10 dans de l'eau déionisée. Préparer cette solution fraîche.
   3. Préparer le cocktail de réaction selon le tableau 1.
      REMARQUE : Ajouter les ingrédients dans l'ordre indiqué dans le tableau. Utilisez le cocktail de réaction dans les 15 minutes suivant la préparation.
   4. Ajouter 100 l de cocktails de réaction à chaque tube de 1,5 ml. Resuspendre les cellules, protéger de la lumière, incuber pendant 30 min à RT.
   5. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min et aspirelaz doucement la solution de réaction avec une pointe de pipette.
   6. Ajouter 0,5% de pénétrant nonionic surfactant à chaque tube pour laver 1x à RT. Centrifuge à 300 x g pendant 5 min, aspirer le supernatant avec la pointe de pipette doucement, et resuspendre les cellules dans 1 ml de DPBS.
5. Analyse des cellules par cytométrie de flux
   1. Filtrer les cellules suspendues à l'air d'une passoire de 40 m, puis recueillir les cellules filtrées avec un tube conique de 15 ml. Effectuer la détection FACS sur machine dès que possible.
      REMARQUE : Si les conditions sont limitées, les échantillons tachés de cellules doivent être stockés dans l'obscurité à 4 oC et testés dans les 3 jours.
   2. Sélectionnez le canal approprié (selon le type d'azide Alexa Fluor dans le kit EdU; ici, canal rouge) et la tension (ici, 150 à 350 V) pour l'analyse de cytométrie de flux.
   3. Stratégie de gating
      1. Dessinez une parcelle pseudo-couleur FSC-A (x-axe) vs SSC-A (y-axe) et distribuez la plupart des cellules à la plage visible de la carte à points en ajustant la tension. Sélectionnez la population cellulaire (R1) et excluez les débris cellulaires dans le coin inférieur gauche.
      2. De la population de cellules R1, établir un FSC-A (x-axe) vs. FSC-H (y-axe) pseudocolor plot, et définir la porte pour sélectionner les cellules uniques (R2) pour exclure les amas cellulaires.
      3. De la population de cellules R2, établir l'intensité de fluorescence (x-axe) vs. nombre de cellules (y-axe) trace, et utiliser le contrôle négatif pour définir la porte. La région du signal fluorescent est une région cellulaire positive (R3). Comparez le rapport des cellules EdU-positives (R3) entre les groupes expérimentaux et témoins.

3. Analyse de cytométrie de flux des cellules PI-positives dans les entéroïdes

REMARQUE : La figure 2 montre le flux de travail pour l'analyse de cytométrie de flux des cellules PI-positives dans les entéroïdes.

1. Incubation de cellules entéroïdes avec PI
   1. Cultivez les entéroïdes à partir de l'étape 1.2.4 pendant 5 à 7 jours. Passage enteroids dans une nouvelle plaque de 24 puits dans un rapport de fractionnement de 1:2. Ajouter 600 l de milieu ENR à chaque puits. Incuber les entéroïdes pendant 4 à 5 jours dans un incubateur de 37 oC.
   2. Définir le groupe témoin (non traité) et le groupe expérimental (traité IL-22), en utilisant au moins trois répliques pour chaque groupe.
   3. Ajouter PI au milieu ENR pour préparer le milieu PI avec une concentration de 3 M.
   4. Ajouter 600 ll de PI moyen à chaque puits et couver pendant 30 min dans un incubateur de 37 oC. Définir un puits d'entéroïdes sans traitement IP comme un contrôle négatif pour la soustraction de fond.
2. Récolte des entéroïdes à partir de la matrice membranaire du sous-sol suivant les étapes 2.2.1-2.2.5.
3. Analyse des cellules par cytométrie de flux
   1. Filtrer les cellules suspendues à l'intérieur d'une passoire de 40 m et recueillir les cellules filtrées à l'abri d'un tube conique de 15 ml.
   2. Effectuer la détection FACS sur machine dès que possible.
      REMARQUE : Si les conditions sont limitées, les échantillons tachés de cellules doivent être stockés dans l'obscurité à 4 oC et testés dans les 3 jours.
   3. Sélectionnez le canal approprié (ici, canal rouge) et la tension (ici, 150 à 350 V) pour l'analyse de cytométrie du débit.
   4. Utilisez la même stratégie de gating que décrite à la section 2.5.3.

Résultats

Les petites cryptes intestinales ont été isolées et cultivées comme entéroïdes dans la matrice de membrane de sous-sol. Les entéroïdes ont commencé à former des bourgeons 2 jours après l'isolement. Le jour 6, les entéroïdes avaient beaucoup de bourgeons avec beaucoup de débris (cellules mortes) dans le lumen. Les entéroïdes étaient prêts à être adoptés à ce stade (figure 3).

De nombreuses études ont montré que les cytokines inflammatoires s...

Discussion

Ce protocole détaille les étapes nécessaires à la culture des entéroïdes in vitro et à la quantification des cellules EdU et PI-positives dans les entéroïdes par cytométrie de flux. Cette stratégie présente plusieurs avantages. Tout d'abord, l'étiquetage EdU est utilisé pour détecter les cellules proliférantes dans les entéroïdes. Par rapport à l'analyse BrdU traditionnelle, la méthode d'étiquetage EdU est plus rapide, plus sensible et plus précise. L'EdU est très similaire à la thymine (T), qui r...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml centrifuge tube	Corning	430791
22 G gavage needle	VWR	20068-608
24-well plate	Nunc	142475
40 mm sterile cell strainer	BD	352340
50 ml centrifuge tube	Corning	430829
70 mm sterile cell strainer	BD	352350
Advanced DMEM/F-12	GIBCO	12634010
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer	Invitrogen	A24863
B-27 Supplement	GIBCO	17504044
Buffer 1			2 mM EDTA in DPBS
Buffer 2			54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS
C57/B6 mice	Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University
Cell-dissociation enzymes (TrypLE)	Life technologies	12605-010
Centrifuge	Eppendorf	5424
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit	Life technologies	C10639
CO2 incubator	Panasonic	MCO-18AC
DPBS	GIBCO	14190144
D-sorbitol	BBI	SB0491
EDTA	BBI	EB0185
ENR media			Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106
Fine Iris Scissors	Tansoole	2037454
Fluorescence microscope	Olympus	FV1000
GlutaMAX Supplement	GIBCO	35050-061
Goat Serum	Life technologies	16210-064
HDMEM	Hyclone	SH30243.01B
HEPES	Sigma	H4034
Matrigel	Corning	356231
Minigut media			Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50)
N2 supplement	R&D	AR009
Nonionic surfactant (Triton X)	BBI	TB0198-500ML
Operating Scissor (12.5 cm)	Tansoole	2025785
Paraformaldehyde (PFA)	sigma	158127-500g
Penn/Strep	Invitrogen	15140-148
Phase contrast microscope	Nikon	TS1000
Propidium iodide	Sigma	P4170-25MG
Recombinant EGF	PeproTech	315-09
Recombinant Mouse Noggin	PeproTech	250-38
Recombinant Mouse R-Spondin 1	R&D	3474-RS-050
Recombinant Murine IL-22	PeproTech	210-22-10
Sucrose	BBI	SB0498
Tissue Forceps	Tansoole	2026704
Y-27632 2HC1	Selleck	S1049