A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
כאן, סיפקנו שיטה כדי להשיג שינוי יציב של העוף Eimeria טפילים על-ידי נוקלאונופיטים sporozoites או הדור השני merozoites. טפילים מהונדסים גנטית שונה ביטוי הטרוולוגי הגנים ניתן להשתמש ככלי משלוח החיסון.
החצייה היא תהליך טכני שדרכו חומר גנטי, כגון DNA ו-RNA כפול, מועברים לתאים כדי לשנות את גן העניין. כיום, הטכנולוגיה הטרנסגניים הופכת כלי הכרחי לחקר Eimeria, הסוכנים סיבתי של coccidiosis ב עופות ובעלי חיים. פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של התפשטות יציבה בטפילים eimerian: טיהור והתגרצות של הנבגים או הדור השני, ובהפצה vivo של טפילים מזוהמים. באמצעות פרוטוקול זה, השגנו. העברה בכמה מינים של איאימריה . כדי להקל על מניפולציה גנטית בטפילים
Eimeria spp. גורם coccidiosis, אשר מוביל הפסדים כלכליים ניכרים בתעשיית החי והעופות. למרות תרופות anticoccidial, ובמידה רבה, חיסונים anticoccidial הקלוש, השתמשו באופן נרחב עבור השליטה של coccidiosis, יש עדיין חסרונות לגבי התנגדות הסמים שלהם, שאריות סמים, ואת הדיפוזיה הפוטנציאלית של זנים החיסון כי להחזיר התקפה אלימה1. עם התפתחות של ביולוגיה מולקולרית, ההתפתחות הפכה לכלי חיוני ללימוד פונקציות גן, פיתוח חיסונים חדשניים, והקרנת מטרות סמים חדשים עבור Eimeria.
בעשורים האחרונים, החלה העברה בהצלחה עבור טפילים apicomplexan כגון פלמודיום ו טוקסופלזמה gondii2,3,4,5,6. מחקר העושה שימוש בβ-גל כעיתונאי עבור התרגום ב -E. tenella ניווט עבודה כזאת ב eimeria7. הזיהום של e. tenella8,9, e. mitis10, ו -E. אכוקלינה (זאנג ואח ', נתונים שלא פורסמו) הצליחה בעופות. לאחרונה, השגנו העברה באמצעות merozoites של אי-מטריקס דרך נוקלאוזיהום11.
מחקרים הראו כי eimeria ביטוי אנטיגן הטרוולוגי יש את הפוטנציאל להיות מפותח כמו חיסון רקומביננטי, כגון אלה ביטוי campylobacter jejuni אנטיגן (cjaa) או עוף אינטרלויקין 2 (צ'יל-2)12,13. לכן, פרוטוקול זה מתאר מחקר של התגרריה של Eimeria spp. בתרנגולות. ההליך מתאר טיהור של הספאוזוענים או merozoites, נוקלאוזיהום עם דנ א פלבמיד, הזרקה של הזרקת ורידית ובהפצה vivo כדי לעזור לחוקרים להתחיל ללמוד על טפילים Eimeria הטרנסגניים.
תרנגולות עבור כל הניסויים בבעלי חיים היו שוכנו ושמרו על פי הנחיות בעלי חיים מוסדיים באוניברסיטה החקלאית והשתמש בהנחיות ובעקבות העקרונות המנחים הבינלאומיים למחקר ביו-רפואי המעורב בבעלי חיים. הניסויים אושרו על ידי ועדת המינהל של בייג של חיות מעבדה.
1. הפקת וטיהור של הספוראוזודות של Eimeria spp. (למשל, e. tenella)
2. איסוף וטיהור הmerozoites של א. נקטריקס
הערה: שימוש בברויילרים (AA) ב7-14 d בניסוי. Coccidia-תרנגולות חינם (n = 3) חוסנו עם 2 x 105 אוציסטות של E. מטריקס. ב 109 h לאחר ההדבקה, הציפורים הוקרב על ידי פריקה צוואר הרחם. המעי הוסר לאוסף שלהדור 2 merozoites. עבור מינים Eimeria שונים, היה זמן שונה עבור אוסף שלהדור 2 merozoites: E. necatrix ב 109 h, ו -E. tenella ב 112 h פוסט-חיסון. הmerozoites הן הבחירה האופטימלית שלהmerozoites השנייה בקלות לטיהור.
3. נוקלאוזיהום של merozoites או מספורזוטים
4. הזרקה בתוך ורידית
5. מיון והפצה של FACS
6. טיהור טור אופציונלי
הערה: אם יש צורך בעוד מספורטים טהורים או merozoites, קיימת שיטה אופציונלית המטהרת אותם דרך העמודה diethylaminoethyl-52 תאית (DE-52 תאית).
הפרוטוקול הזה השתמש. כדי לעבור טפילים במחקר זה,הדור 2 meronts ו Merozoites של E. necatrix הוצגו באיור 2A ו- איור 2B, בעוד איור 2C ו- איור 2הראו את הספורלוציסטים והספוראוזוטים של ...
בשנות ה-90, פותחה מערכת העברה עבור טפילים apicomplexan והיא שימש למחקרים על טפילים איציריאנית. לאחרונה, נערך הזיהום היציב ב -tenella8,9 ו -e. nies,15. השגנו את ההעברה היציבה של E. necatrix על ידי העברה של הדור השני merozoites11. החיסונים של הנבגים...
לא.
עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי של סין (2017YFD0501200) והקרן הלאומית למדע הטבע של סין (31572507, 31772728 ו 31873007).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
ATP-disodium | Sigma | A26209 | |
Cellulose DE-52 | Solarbio | C8350 | |
Constant Flow Pump | SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. | HL-2B | |
DMEM | MACGENE | CM15019 | |
Glass beads | Sigma | Z250473-1PAK | |
Glucose | Sigma | No. V900116 | |
Glycine | Biotopped | G6200 | |
HBSS | MACGENE | CC016 | |
KH2PO4 | Sigma | No. V900041 | |
Low Speed Centrifuge | BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. | DT5-2 | |
Magnetic Mixer | SCILOGEX | MS-H280-Pro | |
MgCl2 | Sigma | 449164 | |
MoFlo cell sorter | BeckMan Coulter, US | 201309995 | |
NaHCO3 | Sigma | 144-55-8 | |
Nucleofection device | LONZA/amaxa | 90900012 (Nucleofector II) | |
PBS | Solarbio | P1010 | |
Percoll (DG gradient stock solution) | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
Sodium taurodeoxycholate hydrate | Sigma | T0875 | |
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002430 | |
The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES. | |||
Trypsin | Solarbio | T8150 | |
Vortex Mixer | Beijing North TZ-Biotech Develop.co. | HQ-60-II | |
Water Bath Thermostat | Grant Instruments (Cambridge), Ltd. | GD120,GM0815010 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved