Nucleofection e In Vivo Propagação de Parasitas de Eimeria de Frango

Resumo

Aqui, fornecemos um método para alcançar a transfecção estável de parasitas de frango Eimeria por nucleofecting esporozoitas ou merozoitas de segunda geração. Parasitas eimerianos geneticamente modificados expressando genes antigênicos heterologous poderiam ser usados como veículos de entrega de vacinas.

Resumo

Transfecção é um processo técnico através do qual material genético, como DNA e RNA de dupla cadeia, são entregues em células para modificar o gene de interesse. Atualmente, a tecnologia transgênica está se tornando uma ferramenta indispensável para o estudo da Eimeria, os agentes causadores da coccidiose em aves e pecuária. Este protocolo fornece uma descrição detalhada da transfecção estável em parasitas eimerianos: purificação e nucleofeção de esporozoitas ou merozoitas de segunda geração, e propagação in vivo de parasitas transfeccionados. Usando este protocolo, conseguimos transfecção em várias espécies de Eimeria. Juntas, a nucleofection é uma ferramenta útil para facilitar a manipulação genética em parasitas eimerianos.

Introdução

Eimeria spp. causa coccidiose, o que leva a perdas econômicas substanciais na pecuária e na indústria avícola. Embora os medicamentos anticoccidial, e até certo ponto, atenuados vacinas anticoccidial, tenham sido amplamente utilizados para o controle da coccidiose, ainda há deficiências em relação à sua resistência a medicamentos, resíduos de drogas e a potencial difusão de cepas de vacinas que recuperam a virulência¹. Com o desenvolvimento da biologia molecular, a transfecção tornou-se uma ferramenta vital para estudar funções genéticas, desenvolver novas vacinas e triagem de novos alvos medicamentosos para Eimeria.

Nas últimas décadas, a transfecção foi aplicada com sucesso para parasitas apicomplexos como Plasmodium e Toxoplasma gondii^2,3,4,5,6. Um estudo usando β-gal como repórter para a transfecção em E. tenella pilotou tal trabalho na Eimeria⁷. A transfecção de E. tenella^8,9, E. mitis¹⁰, e E. acervulina (Zhang et al., dados inéditos) foi bem sucedida em galinhas. Recentemente, conseguimos transfecção usando merozoitas de E. necatrix através da nucleofection¹¹.

Estudos mostraram que a Eimeria expressando um antígeno heterologous tem potencial para ser desenvolvida como uma vacina recombinante, como as expressas que expressam o antígeno Campylobacter jejuni A (CjaA) ou interleucina de frango 2 (chIL-2)^12,13. Portanto, este protocolo descreve um estudo de nucleofection de Eimeria spp. em galinhas. O procedimento descreve a purificação de esporozoitas ou merozoitas, nucleofection com DNA plasmídeo, inoculação cloacal/injeção intravenosa e propagação in vivo para ajudar pesquisadores a iniciar estudos sobre parasitas transgênicos da Eimeria.

Protocolo

As galinhas para todos os experimentos em animais foram alojadas e mantidas de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Agrícola da China e seguiram os Princípios Orientadores Internacionais para pesquisas biomédicas envolvendo animais. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Animais de Laboratório da Administração de Pequim.

1. Extração e purificação de esporozoitas de Eimeria spp. (por exemplo, E. tenella)

1. Liberação de esporocistos
   1. Centrífuga 1 x 10⁷oócisos esporulados em solução de dicromomate de potássio (2,5%, m/v) a 2.300 x g por 5 minutos. Lave-os com PBS (solução tampão de fosfato) três vezes.
   2. Resuspender as pelotas com 1 mL de PBS e transfira para um tubo de 15 mL. Adicione um volume igual de contas de vidro (1 mm x 1 mm de diâmetro) e oscilar a suspensão do oócisto usando um misturador de vórtice para liberar os esporócis.
   3. Monitore a liberação de esporócitos por microscopia a cada minuto. Pare de vórtice quando mais de 90% dos oocistos são quebrados.
      NOTA: A maioria dos oócistos (como E. tenella, E. necatrixe E. acervulina) foram quebradas após 1 min usando a misturadora de vórtice.
   4. Transfira a suspensão de esporocista para novos tubos de 1,5 mL e centrífuga sem 1.600 x g por 5 minutos.
   5. Resuspender o precipitado com 1 mL de 50% de densidade de gradiente, combine em um tubo de 1,5 mL e centrífuga sem 10.000 x g por 1 min.
      NOTA: Para a composição do gradiente de densidade, consulte a Tabela 1. O gradiente de densidade é um meio coloidal à base de sílica, composto por partículas de sílica coloidal de 15-30 nm de diâmetro (23% w/w na água), que foram revestidas usando polisrolidona de polivinilida (PVP).
2. Lançamento de esporozoitas
   1. Resuspender o precipitado com o tampão da excisão (Tabela 1) e incubar em um banho de água de 42 °C por 40-60 min para liberar os esporozoitas. Pare de incubar quando mais de 90% dos esporozoitas são liberados. Em seguida, centrífuga a 600 x g por 10 min.
      NOTA: Agite os tubos uma vez a cada 5 minutos durante a excisão.
   2. Resuspender a precipitação com 1 mL de 55% de solução gradiente de densidade e centrífuga em 10.000 x g por 1 min.
   3. Resuspender a precipitação com 1 mL de PBS e conte os esporozoitas usando um hemocímetro.

2. Coleta e purificação de merozoitas de E. necatrix

NOTA: Use os frangos arbor acre (AA) com idade sacada de 7 a 14 d no experimento. As galinhas sem coccidia (n=3) foram inoculadas com 2 x 10⁵ oocistos de E. necatrix. Às 109 h após a infecção, as aves foram sacrificadas por luxação cervical. O intestino foi removido para a coleta dos merozoitas de^2ª geração. Para diferentes espécies de Eimeria, houve um tempo diferente para a coleta dos merozoitas de^2ª geração: E. necatrix às 109 h, e E. tenella a 112 h pós-inoculação. Para a transfecção de E. necatrix,merozoitas são a escolha ideal, pois os segundo merozoitas são fáceis de purificar.

1. Coleção dos merozoitas de segunda geração de E. necatrix
   1. Corte o intestino de frango longitudinalmente, do talo de gema (no meio do intestino delgado) ao orifício ileocecal, e lave-o com PBS ou HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) suavemente três vezes em uma placa de Petri.
   2. Corte o intestino em pedaços de 0,5 cm x 0,5 cm e coloque-o em um frasco cônico com um tampão de digestão (Tabela 1). Coloque o frasco em uma batedeira magnética a 37 °C com uma barra de agitação por 30-60 min para liberar merozoitas. Após 30 min de incubação, monitore a liberação de merozoitas por exame microscópico a cada 5 min.
2. Purificar os merozoitas por filtração e centrífuga.
   1. Filtrar a suspensão contendo merozoitas digeridas usando quatro camadas de gaze¹⁴, e centrífuga em 600 x g por 10 minutos.
   2. Após centrífuga, descarte o supernatante contendo detritos intestinais. Transfira a precipitação com merozoitas purificadas para tubos de 1,5 mL.
   3. Resuspender a precipitação com 1 mL de PBS e conte os merozoitas usando um hemocímetro.

3. Nucleofection de merozoitas ou esporozoitas

1. Preparação antes da nucleofection de parasitas
   1. Prepare cerca de¹⁰⁷ merozoitas ou esporozoitas em um tubo. Se transfectingme merozoitas, prepare 3-4 tubos.
   2. Prepare uma quantidade de DNA plasmídeo ou fragmento de PCR purificado maior ou igual a 10 μg.
      NOTA: O plasmídeo utilizado neste estudo contém 2 genes: proteína fluorescente amarela aprimorada (EYFP) e sintetizador de teumidito dihidrofolado derivado do Toxoplasma gondii (TgDHFR-TS)¹⁵.
   3. Prepare 25 U de enzima de restrição. Se os plasmídeos forem linearizados, a enzima de restrição pode melhorar a eficiência da transfecção. Se os plasmídeos são circulares, omita a enzima de restrição.
   4. Prepare 85 μL de tampão de nucleofection: misture 20 μL de tampão de nucleofection I e 1 mL de tampão de nucleofection II, e use uma parte da solução. O volume do buffer total é de 100 μL.
2. Nucleofection
   1. Centrífuga a suspensão sporozoita ou merozoita em 600 x g por 10 min. Em seguida, descarte o supernatant.
   2. Na ordem a seguir, adicione 85 μL de tampão de transfecção nuclear, 10 μg de plasmídeo (fragmento pcr) e 25 U de enzima de restrição (geralmente 5 μL) no tubo de 1,5 mL contendo esporozoitas ou merozoitas.
   3. Transfira a suspensão para um copo de transfecção nuclear. Coloque o copo em um sulco de transferência nuclear.
   4. Ligue o dispositivo de nucleofection usando o botão de alimentação e selecione o procedimento de transfecção U-033. Se o dispositivo de nucleofection começar no modo Free Program Choice, saia deste modo pressionando o botão X.
   5. Quando o programa terminar, pressione o botão X do dispositivo de nucleofection, e a tela deve ser exibida OK,indicando que a nucleofection é bem sucedida.
   6. Adicione 0,5-1 mL do Medium de Águia Modificada (DMEM)⁸ do Dulbecco ao copo de nucleofection para parar a reação e transferir a suspensão para o tubo de 1,5 mL depois de misturar suavemente.

4. Inoculação cloacal ou injeção endovenosa

1. Inocule os parasitas nucleotados em galinhas de 7 dias de idade. Inocula os merozoitas de E. necatrix ou os esporozoitas de E. tenella através da rota cloacal, mas inoculado E. acervulina sporozoitas via injeção intravenosa. Inocular cerca de 2 x 10⁷ milhões de esporozoitas em cada frango, e merozoitas incoluates 10⁷ para cada pássaro.

5. Propagação e classificação FACS

1. Colete oócistos das fezes 5-9 dias após a inoculação com esporozoitas transfeccionadas. Colete os oocistos no terceiro dia após o inoculação com merozoitas transfecdas.
2. Use classificação celular ativada por fluorescência (FACS) e 150 mg/kg de pirimethamina⁸ para aumentar sucessivamente a relação populacional transgênica.
   NOTA: Use pirimethamina adicionando-a diretamente na alimentação. Para uso mais conveniente, prepare a pirimethamina solúvel em água. Dissolva 1 g de pirimethamina em 0,2 mL pf H₂SO₄ e 9,8 mL de pirrolido N-metil (NMP), e depois adicione 1,5 mL desta solução de estoque em 1 L de água potável para aves.

6. Purificação opcional da coluna

NOTA: Se forem necessários esporozoitas ou merozoitas mais puros, há um método opcional que os purifica através de uma coluna de celulose diethylaminoethyl-52 (celulose DE-52).

1. Prepare a coluna de celulose DE-52 com pelo menos um dia de antecedência.
   1. Prepare o tampão eluente de glicina(Tabela 1). Ajuste o pH do tampão eluente de glicina de 7,6 a 8,0 e pré-aquecido para 41 °C.
   2. Adicione 2,5 g de celulose DE-52 à coluna. Adicione água e mergulhe durante a noite. Descarte o supernatante.
   3. Adicione água e mergulhe por 1h. Descarte o supernatant.
   4. Adicione 0,1 M NaOH e mergulhe por pelo menos 2 horas. Repita este passo.
   5. Substitua o supernatante por água. Depois que a celulose se fixa completamente na parte inferior (cerca de meia hora), repita este passo.
   6. Descarte o supernatant, adicione 0,1 M HCl e mergulhe por pelo menos 2 horas. Repita este passo.
   7. Descarte o supernatante e mergulhe a celulose duas vezes com tampão eluente de glicina.
   8. Meça e ajuste o pH de 7,6 a 8,0 adicionando 0,1 M HCl ou 0,1 M NaOH.
      NOTA: Nesta parte, o líquido tem pelo menos 5x mais volume do que o da celulose DE-52.
2. Ajuste a taxa de fluxo entre 40-50 r/min.
3. Quando a sedimentação da celulose for concluída, adicione a suspensão de esporozoita ou merozoita à coluna cromatográfica. Ajuste a taxa de fluxo para 30-40 r/min.
   NOTA: Resuspender a precipitação de esporozoita ou merozoite com tampão eluente de glicina antes de adicionar a coluna cromatográfica.
4. Colete com tampão eluente de glicina em tubos de 50 mL. Pare a coleta de acordo com os resultados do exame microscópico de esporozoitas ou merozoitas durante o processo de elusão.
5. Centrífuga o tampão eluente de glicina coletado em 600 x g por 10 min. Transfira a precipitação esporozoita ou merozoite para novos tubos de 1,5 mL.
6. Conte os esporozoitas ou merozoitas usando um hemocímetro.

Resultados

Este protocolo foi usado para transfect parasitas eimerianos. Neste estudo, os meronts e merozoitas de^2ª geração da E. necatrix foram mostrados na Figura 2A e Figura 2B,enquanto a Figura 2C e a Figura 2D mostraram os esporócitos e esporozoitas de E. tenella depois de usar...

Discussão

Na década de 1990, foi desenvolvido um sistema de transfecção para parasitas apicomplexos, e foi usado para estudos em parasitas eimerianos. Recentemente, a transfecção estável foi realizada em E. tenella^8,9 e E. nieschulzi¹⁵. Alcançamos a transfecção estável de E. necatrix transfecting merozoites de segunda geração¹¹. A inoculação de esporozoitas transfeccionadas de E. a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
ATP-disodium	Sigma	A26209
Cellulose DE-52	Solarbio	C8350
Constant Flow Pump	SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD.	HL-2B
DMEM	MACGENE	CM15019
Glass beads	Sigma	Z250473-1PAK
Glucose	Sigma	No. V900116
Glycine	Biotopped	G6200
HBSS	MACGENE	CC016
KH2PO4	Sigma	No. V900041
Low Speed Centrifuge	BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD.	DT5-2
Magnetic Mixer	SCILOGEX	MS-H280-Pro
MgCl2	Sigma	449164
MoFlo cell sorter	BeckMan Coulter, US	201309995
NaHCO3	Sigma	144-55-8
Nucleofection device	LONZA/amaxa	90900012 (Nucleofector II)
PBS	Solarbio	P1010
Percoll (DG gradient stock solution)	GE Healthcare	17-0891-09
Sodium taurodeoxycholate hydrate	Sigma	T0875
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge	ThermoFisher Scientific	75002430
The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES.
Trypsin	Solarbio	T8150
Vortex Mixer	Beijing North TZ-Biotech Develop.co.	HQ-60-II
Water Bath Thermostat	Grant Instruments (Cambridge), Ltd.	GD120,GM0815010