Nucleofezione e Propagazione In Vivo dei Parassiti dell'Emeria del Pollo

Riepilogo

Qui, abbiamo fornito un metodo per ottenere una trasfezione stabile dei parassiti dell'Eimeria di pollo nucleofecting sporozoiti o merozoiti di seconda generazione. I parassiti eimeri geneticamente modificati che esprimono geni antigenici eterologi potrebbero essere usati come veicoli per la somministrazione di vaccini.

Abstract

La trasfezione è un processo tecnico attraverso il quale il materiale genetico, come il DNA e l'RNA a doppio filamento, vengono consegnati nelle cellule per modificare il gene di interesse. Attualmente, la tecnologia transgenica sta diventando uno strumento indispensabile per lo studio di Eimeria, gli agenti causali della coccidiosi nel pollame e nel bestiame. Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata della trasfezione stabile nei parassiti emerici: purificazione e nucleofezione di sporozoiti o merozoiti di seconda generazione, e propagazione in vivo di parassiti trasmutati. Utilizzando questo protocollo, abbiamo raggiunto la trasfezione in diverse specie di Eimeria. Nel loro insieme, la nucleofezione è uno strumento utile per facilitare la manipolazione genetica nei parassiti emerici.

Introduzione

Eimeria spp. provoca coccidiosi, che porta a notevoli perdite economiche nell'industria zootecnica e avicola. Anche se i farmaci anticcidi, e in una certa misura, attenuati i vaccini anticcidi, sono stati ampiamente utilizzati per il controllo della coccidiosi, ci sono ancora carenze per quanto riguarda la loro resistenza ai farmaci, i residui di farmaci e la potenziale diffusione di ceppi di vaccino che riacquistano la virulenza¹. Con lo sviluppo della biologia molecolare, la trasfezione è diventata uno strumento vitale per studiare le funzioni genetiche, sviluppare nuovi vaccini e vagliare nuovi bersagli farmacologici per Eimeria.

Negli ultimi decenni, la trasfezione è stata applicata con successo per parassiti apicomplessi come Plasmodium e Toxoplasma gondii^2,3,4,5,6. Uno studio condotto su z-gal come reporter per la trasfezione in E. tenella ha sperimentato tale lavoro in Eimeria⁷. La trasfezione di E. tenella^8,9, E. mitis¹⁰ed E. acervulina (et al., dati inediti) ebbe successo nei polli. Recentemente, abbiamo raggiunto la trasfezione usando merozoiti di E. necatrix attraverso la nucleofezione¹¹.

Gli studi hanno dimostrato che Eimeria che esprime un antigene eteologo ha il potenziale per essere sviluppata come vaccino ricombinante, come quelli che esprimono L'antigene A (CjaA) o l'interleumina di pollo 2 (chIL-2)^12,13. Pertanto, questo protocollo descrive uno studio di nucleofezione di Eimeria spp. in polli. La procedura descrive la purificazione di sporozoiti o merozoiti, la nucleofezione con DNA plasmide, l'inoculazione cloasnica/iniezione endovenosa e la propagazione in vivo per aiutare i ricercatori ad avviare studi sui parassiti eimeria transgenici.

Protocollo

I polli per tutti gli esperimenti sugli animali sono stati ospitati e mantenuti secondo le linee guida del Comitato per la cura e l'uso degli animali delle Università Agricola della Cina e hanno seguito i principi guida internazionali per la ricerca biomedica che coinvolgono gli animali. Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato di Animali da Laboratorio dell'Amministrazione di Pechino.

1. Estrazione e purificazione degli sporozoiti di Eimeria spp. (ad esempio, E. tenella)

1. Rilascio di sporocisti
   1. Centrifuga 1 x 10⁷oocisti spororati in soluzione di cromata di potassio (2,5%, m/v) a 2.300 x g per 5 min. Lavarli con PBS (soluzione buffer fosfato) tre volte.
   2. Risospendere i pellet con 1 mL di PBS e trasferirli in un tubo da 15 mL. Aggiungere un volume uguale di perline di vetro (1 mm x 1 mm di diametro gamma) e oscillare la sospensione dell'oocisti utilizzando un mixer vortice per rilasciare le sporocisti.
   3. Monitorare il rilascio di sporocisti in microscopia ogni minuto. Smettere di vortice quando più del 90% delle oocisti sono rotti.
      NOTA: La maggior parte delle ovocisti (come E. tenella, E. necatrixed E. acervulina) sono stati interrotti dopo 1 min utilizzando il mixer vortice.
   4. Trasferire la sospensione sporocisti in nuovi tubi da 1,5 mL e centrifugare a 1.600 x g per 5 min.
   5. Risospendere il precipitato con una soluzione di gradiente di densità del 50%, combinare in un tubo da 1,5 mL e centrifugare a 10.000 x g per 1 min.
      NOTA: per la composizione del gradiente di densità, fare riferimento alla Tabella 1. Il gradiente di densità è un mezzo colloidale a base di silice, costituito da particelle di silice colloidali di 15-30 nm di diametro (23% w/w in acqua), che sono stati rivestiti con polivinylpyrrolidone (PVP).
2. Rilascio di sporozoiti
   1. Risospendere il precipitato con il tampone di escissione (Tabella 1) e incubare in un bagno d'acqua a 42 gradi per 40-60 min per rilasciare le sporozoiti. Smettere di incubare quando più del 90% delle sporozoites vengono rilasciate. Quindi centrifugare a 600 x g per 10 min.
      NOTA: Agitare i tubi una volta ogni 5 minuti durante l'escissione.
   2. Risospendere la precipitazione con una soluzione di gradiente di densità del 55% del 55% e centrifugare a 10.000 x g per 1 min.
   3. Risospendere la precipitazione con 1 mL di PBS e contare gli sporozoiti utilizzando un emocitometro.

2. Raccolta e purificazione dei merozoiti di E. necatrix

NOTA: utilizzare i polli da carne Arbor Acre di età compresa tra 7 e 14 d nell'esperimento. I polli senza coccidia (n. 3) sono stati inoculati con 2 x 10⁵ ovociti di E. necatrix. A 109 h dopo l'infezione, gli uccelli sono stati sacrificati dalla lussazione cervicale. L'intestino è stato rimosso per la raccolta dei merozoiti di 2^{di maestra.} Per diverse specie di Eimeria, c'era un tempo diverso per la raccolta dei merozoiti di seconda^generazione: E. necatrix a 109 h, ed E. tenella a 112 h post-inoculazione. Per la trafezione di E. necatrix,i merozoiti sono la scelta ottimale in quanto i secondi merozoiti sono facili da purificare.

1. Collezione dei merozoiti di seconda generazione di E. necatrix
   1. Tagliare il pollo alla longitudine, dal gambo del tuorlo (al centro dell'intestino tenue) all'orifizio ileocecal, e lavarlo con PBS o HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) delicatamente tre volte in un piatto Petri.
   2. Tagliare l'intestino a pezzi di 0,5 cm x 0,5 cm e metterlo in un pallone conico con un buffer di digestione (Tabella 1). Collocare il flacone su un miscelatore magnetico a 37 gradi centigradi con una barra di agitazione per 30-60 min per rilasciare i merozoiti. Dopo 30 min di incubazione, monitorare il rilascio di merozoiti con esame microscopico ogni 5 min.
2. Purificare i merozoiti filtrazione e centrifugazione.
   1. Filtrare le sospensioni contenenti merozoiti digeriti utilizzando quattro strati di garza¹⁴e centrifugare a 600 x g per 10 min.
   2. Dopo la centrifuga, scartare il supernatante contenente i detriti intestinali. Trasferire la precipitazione con merozoiti purificati a tubi da 1,5 mL.
   3. Risospendere la precipitazione con 1 mL di PBS e contare i merozoiti utilizzando un emocitometro.

3. Nucleofezione di merozoiti o sporozoiti

1. Preparazione prima della nucleofezione dei parassiti
   1. Preparare circa 10⁷ merozoiti o sporozoiti in un tubo. Se trasfecare i merozoiti, preparare 3-4 tubi.
   2. Preparare una quantità di DNA plasmide o frammento di PCR purificato maggiore o uguale a 10 g.
      NOTA: Il plasmide utilizzato in questo studio contiene 2 geni: proteina fluorescente gialla avanzata (EYFP) e sintesi diidrofolata reducitto tiromidillatico derivata da Toxoplasma gondii (TgDHFR-TS)¹⁵.
   3. Preparare 25 U di enzima di restrizione. Se i plasmidi sono linearizzati, l'enzima di restrizione può migliorare l'efficienza della trasfezione. Se i plasmidi sono circolari, omettere l'enzima di restrizione.
   4. Preparare 85 l di buffer di nucleofezione: mescolare 20 l di buffer di nucleofezione I e 1 mL di buffer di nucleofezione II, e utilizzare una parte della soluzione. Il volume del buffer totale è 100.
2. Nucleofezione
   1. Centrifugare la sporozoite o la sospensione di merozoite a 600 x g per 10 min. Poi scartare il super-natante.
   2. Nell'ordine seguente, aggiungere 85 l di buffer di trasfezione nucleare, 10 g di plasmide (frammento PCR) e 25 U di enzima di restrizione (di solito 5) nel tubo da 1,5 mL contenente sporozoiti o merozoiti.
   3. Trasferire la sospensione in una coppa di trasfezione nucleare. Metti la tazza in una scanalatura di trasferimento nucleare.
   4. Accendere il dispositivo di nucleofezione utilizzando il pulsante di accensione e selezionare la procedura di trasfezione U-033. Se il dispositivo di nucleofezione si avvia nella modalità Scelta programma libero, uscire da questa modalità premendo il pulsante X.
   5. Al termine del programma, premere il pulsante X del dispositivo di nucleofezione e sullo schermo dovrebbe essere visualizzato OK, a indicare che la nucleoflessione ha esito positivo.
   6. Aggiungere 0,5-1 mL di Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)⁸ alla coppa di nucleofezione per fermare la reazione e trasferire la sospensione a tubo da 1,5 mL dopo aver miscelato delicatamente.

4. Inoculazione cloaca o iniezione endovenosa

1. Inoculare i parassiti nucleofettati in polli vecchi di 7 giorni. Inoculare le merozoites di E. necatrix o le sporozoites di E. tenella attraverso il percorso cloacale, ma inoculare E. acervulina sporozoites tramite iniezione endovenosa. Inoculare circa 2 x 10⁷ milioni di sporozoiti in ogni pollo, e incoluate merozoites 10⁷ per ogni uccello.

5. Propagazione e smistamento FACS

1. Raccogliere le oocisti dalle feci 5-9 giorni dopo l'inoculazione con sporozoiti trasmutati. Raccogliere le oocisti il terzo giorno dopo l'inoculazione con merozoiti trasmissi.
2. Utilizzare lo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza (FACS) e 150 mg/kg di pirilatamina⁸ per aumentare successivamente il rapporto tra popolazione transgenica.
   NOTA: Utilizzare la pirimethamina aggiungendola direttamente nel feed. Per un uso più conveniente, preparare pirrimethamina solubile in acqua. Sciogliere 1 g di pirithamina in 0,2 mL pf H₂SO₄ e 9,8 mL di pirrododone n-metilico (NMP), quindi aggiungere 1,5 mL di questa soluzione di stock in 1 L di acqua potabile per gli uccelli.

6. Purificazione facoltativa colonna

NOTA: Se sono necessari più sporozoiti o merozoiti puri, c'è un metodo opzionale che li purifica attraverso una colonna di cellulosa dietilaminoethyl-52 (DE-52 cellulosa).

1. Preparare la colonna di cellulosa DE-52 con almeno un giorno di anticipo.
   1. Preparare il buffer eluente della glicina (tabella 1). Regolare il pH del buffer eluente di glicina da 7,6 a 8,0 e preriscaldato a 41 gradi centigradi.
   2. Aggiungere 2,5 g di cellulosa DE-52 alla colonna. Aggiungere acqua e ammollo durante la notte. Scartare il super-attardato.
   3. Aggiungere acqua e ammollo per 1 h. Scartare il supernatante.
   4. Aggiungere 0,1 M di NaOH e immergere per almeno 2 ore. Ripetere questo passaggio.
   5. Sostituire il supernatante con acqua. Dopo che la cellulosa si deposita completamente verso il basso (circa mezz'ora), ripetere questo passaggio.
   6. Scartare il supernatante, aggiungere 0,1 M HCl e immergere per almeno 2 ore. Ripetere questo passaggio.
   7. Scartare il supernatante e immergere la cellulosa due volte con tampone eluente di glicina.
   8. Misurare e regolare il pH da 7,6 a 8,0 aggiungendo 0,1 M HCl o 0,1 M NaOH.
      NOTA: In questa parte, il liquido ha almeno 5 volte più volume di quello della cellulosa DE-52.
2. Regolare la portata tra 40-50 r/min.
3. Quando la sedimentazione della cellulosa è completata, aggiungere la sporozoite o la sospensione della merozoite alla colonna cromatografica. Regolare la portata a 30-40 r/min.
   NOTA: Risospendere la sporozoite o la precipitazione di merozoite con tampone eluente di glicina prima di aggiungere la colonna cromatografica.
4. Raccogliere con tampone eluente di glicina in tubi da 50 mL. Interrompere la raccolta in base ai risultati dell'esame microscopico di sporozoiti o merozoiti durante il processo di eluizione.
5. Centrifugare il buffer eluente di glicina raccolto a 600 x g per 10 min. Trasferire la precipitazione sporozoite o merozoite a nuovi tubi da 1,5 mL.
6. Contare gli sporozoiti o i merozoiti usando un emocitometro.

Risultati

Questo protocollo è stato utilizzato per trasfect parassiti eimeri. In questo studio, le merontes di 2^nd generazione e merozoites di E. necatrix sono stati mostrati in Figura 2A e Figura 2B, mentre Figura 2C e Figura 2D ha mostrato le sporocisti e sporozoites di E. tenella d...

Discussione

Negli anni '90, è stato sviluppato un sistema di trasfezione per i parassiti apicomplessi, ed è stato utilizzato per studi sui parassiti eimeri. Recentemente, la trasfezione stabile è stata condotta in E. tenella^8,9 e E. nieschulzi¹⁵. Abbiamo raggiunto la trasfezione stabile di E. necatrix traducendo merozoiti di seconda generazione¹¹. L'inoculazione delle sporozoiti trasfette di E....

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
ATP-disodium	Sigma	A26209
Cellulose DE-52	Solarbio	C8350
Constant Flow Pump	SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD.	HL-2B
DMEM	MACGENE	CM15019
Glass beads	Sigma	Z250473-1PAK
Glucose	Sigma	No. V900116
Glycine	Biotopped	G6200
HBSS	MACGENE	CC016
KH2PO4	Sigma	No. V900041
Low Speed Centrifuge	BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD.	DT5-2
Magnetic Mixer	SCILOGEX	MS-H280-Pro
MgCl2	Sigma	449164
MoFlo cell sorter	BeckMan Coulter, US	201309995
NaHCO3	Sigma	144-55-8
Nucleofection device	LONZA/amaxa	90900012 (Nucleofector II)
PBS	Solarbio	P1010
Percoll (DG gradient stock solution)	GE Healthcare	17-0891-09
Sodium taurodeoxycholate hydrate	Sigma	T0875
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge	ThermoFisher Scientific	75002430
The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES.
Trypsin	Solarbio	T8150
Vortex Mixer	Beijing North TZ-Biotech Develop.co.	HQ-60-II
Water Bath Thermostat	Grant Instruments (Cambridge), Ltd.	GD120,GM0815010