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Method Article
Qui, abbiamo fornito un metodo per ottenere una trasfezione stabile dei parassiti dell'Eimeria di pollo nucleofecting sporozoiti o merozoiti di seconda generazione. I parassiti eimeri geneticamente modificati che esprimono geni antigenici eterologi potrebbero essere usati come veicoli per la somministrazione di vaccini.
La trasfezione è un processo tecnico attraverso il quale il materiale genetico, come il DNA e l'RNA a doppio filamento, vengono consegnati nelle cellule per modificare il gene di interesse. Attualmente, la tecnologia transgenica sta diventando uno strumento indispensabile per lo studio di Eimeria, gli agenti causali della coccidiosi nel pollame e nel bestiame. Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata della trasfezione stabile nei parassiti emerici: purificazione e nucleofezione di sporozoiti o merozoiti di seconda generazione, e propagazione in vivo di parassiti trasmutati. Utilizzando questo protocollo, abbiamo raggiunto la trasfezione in diverse specie di Eimeria. Nel loro insieme, la nucleofezione è uno strumento utile per facilitare la manipolazione genetica nei parassiti emerici.
Eimeria spp. provoca coccidiosi, che porta a notevoli perdite economiche nell'industria zootecnica e avicola. Anche se i farmaci anticcidi, e in una certa misura, attenuati i vaccini anticcidi, sono stati ampiamente utilizzati per il controllo della coccidiosi, ci sono ancora carenze per quanto riguarda la loro resistenza ai farmaci, i residui di farmaci e la potenziale diffusione di ceppi di vaccino che riacquistano la virulenza1. Con lo sviluppo della biologia molecolare, la trasfezione è diventata uno strumento vitale per studiare le funzioni genetiche, sviluppare nuovi vaccini e vagliare nuovi bersagli farmacologici per Eimeria.
Negli ultimi decenni, la trasfezione è stata applicata con successo per parassiti apicomplessi come Plasmodium e Toxoplasma gondii2,3,4,5,6. Uno studio condotto su z-gal come reporter per la trasfezione in E. tenella ha sperimentato tale lavoro in Eimeria7. La trasfezione di E. tenella8,9, E. mitis10ed E. acervulina (et al., dati inediti) ebbe successo nei polli. Recentemente, abbiamo raggiunto la trasfezione usando merozoiti di E. necatrix attraverso la nucleofezione11.
Gli studi hanno dimostrato che Eimeria che esprime un antigene eteologo ha il potenziale per essere sviluppata come vaccino ricombinante, come quelli che esprimono L'antigene A (CjaA) o l'interleumina di pollo 2 (chIL-2)12,13. Pertanto, questo protocollo descrive uno studio di nucleofezione di Eimeria spp. in polli. La procedura descrive la purificazione di sporozoiti o merozoiti, la nucleofezione con DNA plasmide, l'inoculazione cloasnica/iniezione endovenosa e la propagazione in vivo per aiutare i ricercatori ad avviare studi sui parassiti eimeria transgenici.
I polli per tutti gli esperimenti sugli animali sono stati ospitati e mantenuti secondo le linee guida del Comitato per la cura e l'uso degli animali delle Università Agricola della Cina e hanno seguito i principi guida internazionali per la ricerca biomedica che coinvolgono gli animali. Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato di Animali da Laboratorio dell'Amministrazione di Pechino.
1. Estrazione e purificazione degli sporozoiti di Eimeria spp. (ad esempio, E. tenella)
2. Raccolta e purificazione dei merozoiti di E. necatrix
NOTA: utilizzare i polli da carne Arbor Acre di età compresa tra 7 e 14 d nell'esperimento. I polli senza coccidia (n. 3) sono stati inoculati con 2 x 105 ovociti di E. necatrix. A 109 h dopo l'infezione, gli uccelli sono stati sacrificati dalla lussazione cervicale. L'intestino è stato rimosso per la raccolta dei merozoiti di 2di maestra. Per diverse specie di Eimeria, c'era un tempo diverso per la raccolta dei merozoiti di secondagenerazione: E. necatrix a 109 h, ed E. tenella a 112 h post-inoculazione. Per la trafezione di E. necatrix,i merozoiti sono la scelta ottimale in quanto i secondi merozoiti sono facili da purificare.
3. Nucleofezione di merozoiti o sporozoiti
4. Inoculazione cloaca o iniezione endovenosa
5. Propagazione e smistamento FACS
6. Purificazione facoltativa colonna
NOTA: Se sono necessari più sporozoiti o merozoiti puri, c'è un metodo opzionale che li purifica attraverso una colonna di cellulosa dietilaminoethyl-52 (DE-52 cellulosa).
Questo protocollo è stato utilizzato per trasfect parassiti eimeri. In questo studio, le merontes di 2nd generazione e merozoites di E. necatrix sono stati mostrati in Figura 2A e Figura 2B, mentre Figura 2C e Figura 2D ha mostrato le sporocisti e sporozoites di E. tenella d...
Negli anni '90, è stato sviluppato un sistema di trasfezione per i parassiti apicomplessi, ed è stato utilizzato per studi sui parassiti eimeri. Recentemente, la trasfezione stabile è stata condotta in E. tenella8,9 e E. nieschulzi15. Abbiamo raggiunto la trasfezione stabile di E. necatrix traducendo merozoiti di seconda generazione11. L'inoculazione delle sporozoiti trasfette di E....
Nessuno.
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (2017YFD0501200) e dalla National Natural Science Foundation of China (31572507, 31772728 e 31873007).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
ATP-disodium | Sigma | A26209 | |
Cellulose DE-52 | Solarbio | C8350 | |
Constant Flow Pump | SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. | HL-2B | |
DMEM | MACGENE | CM15019 | |
Glass beads | Sigma | Z250473-1PAK | |
Glucose | Sigma | No. V900116 | |
Glycine | Biotopped | G6200 | |
HBSS | MACGENE | CC016 | |
KH2PO4 | Sigma | No. V900041 | |
Low Speed Centrifuge | BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. | DT5-2 | |
Magnetic Mixer | SCILOGEX | MS-H280-Pro | |
MgCl2 | Sigma | 449164 | |
MoFlo cell sorter | BeckMan Coulter, US | 201309995 | |
NaHCO3 | Sigma | 144-55-8 | |
Nucleofection device | LONZA/amaxa | 90900012 (Nucleofector II) | |
PBS | Solarbio | P1010 | |
Percoll (DG gradient stock solution) | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
Sodium taurodeoxycholate hydrate | Sigma | T0875 | |
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002430 | |
The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES. | |||
Trypsin | Solarbio | T8150 | |
Vortex Mixer | Beijing North TZ-Biotech Develop.co. | HQ-60-II | |
Water Bath Thermostat | Grant Instruments (Cambridge), Ltd. | GD120,GM0815010 |
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