מודל מבחנה של אנגיוגנזה כלילית

Summary

במודלים של בעלי מבחנה של אנגיוגנזה כלילית ניתן לעשות שימוש לגילוי המנגנון הסלולר והמולקולרי של אנגיוגנזה כלילית. באופן מתורבת תרבויות של הסינוס venosus ורקמות אנדוקרדיום להראות צמיחה חזקה בתגובה ל-ולהציג דפוס דומה של הביטוי הפיכה-TFII כמו ב vivo.

Abstract

כאן, אנו מתארים בתוך שיטת תרבות מבחנה לחקר אנגיוגנזה כלילית. כלי דם כליליים מזינים את שריר הלב והינם בעלי חשיבות קלינית. פגמים בכלי זה מייצגים סיכונים בריאותיים חמורים כגון טרשת עורקים, אשר יכול להוביל שריר הלב infarctions וכישלונות לב בחולים. כתוצאה מכך, מחלת עורק כלילית היא אחת הסיבות המובילות בעולם למוות. למרות החשיבות הקלינית שלה, התקדמות קטנה יחסית נעשתה על איך לחדש את העורקים הכליליים פגום. אף על פי כן, ההתקדמות האחרונה נעשתה בהבנת המקור הסלולר ומסלולי הבידול של פיתוח כלי קיבול כלילית. הופעתו של כלים וטכנולוגיות המאפשרים לחוקרים לתייג באופן מרשים בתאי קדמון, לעקוב אחר גורלם, ולהמחיש progenies בvivo היתה אינסטרומנטלית בהבנת התפתחות כלי הקיבול כלילית. במחקרים vivo הם יקרי ערך, אך יש להם מגבלות מבחינת מהירות, נגישות וגמישות בתכנון ניסיוני. לחילופין, מדויק במודלים מחוץ לגוף של אנגיוגנזה כלילית יכול לעקוף מגבלות אלה ולאפשר לחוקרים לחקור שאלות ביולוגיות חשובות במהירות ובגמישות. חוסר ההתאמה במערכות מודל החוץ-גופית עלול להיות מפריע להתקדמות בהבנת המנגנון הסלולר והמולקולרי של צמיחת כלי קיבול כלילית. כאן, אנו מתארים מערכת תרבות מבחנה לגדל כלי כלילית מן venosus סינוס (SV) ו אנדוקרדיום (אנדו), שתי רקמות הקדמון שממנו רבים של כלי כלילית להתעורר. כמו כן, אנו מאשרים כי התרבויות באופן מדויק לכידה של חלק הידוע במנגנונים vivo. למשל, אנו מראים כי נבטי האנגיוגנטי בתרבות מ-SV הפחתת הפיכה-TFII הביטוי דומה למה שנצפה ב vivo. בנוסף, אנו מראים כי מרכיב ה-אנגיוf-A, גורם מוכר היטב בvivo, מעורר את האנגיוגנזה הן מתרבויות הSV והן מתרביות האנדו. באופן קולקטיבי, המציאו מודל מדויק של תרבות מבחנה לחקר אנגיוגנזה כלילית.

Introduction

כלי הדם של הלב נקראים בדרך כלל כלי דם כליליים. כלי הדם מורכבים מעורקים, עורקים ונימים. במהלך פיתוח, נימים מאוד מסוקנים מבוססים על הראשון, אשר לאחר מכן לשפץ לתוך עורקים וורידים כליליים^1,2,3,4,5. הנימים הראשוניים האלה בנויים מתאי מחולל שורש שנמצאו בתוך הפרואפידיום, הסינוס venosus (SV), ו אנדוקרדיום (אנדו) רקמות^1,6,7,8. SV הוא האיבר הנכנס של הלב העובריים ואנדו הוא הציפוי הפנימי של הלב לומן. תאי מחולל שורש שנמצאו ב-SV ו-אנדו בונים את רוב העורקים הכליליים, ואילו הפרואפידיום תורמת לחלק קטן יחסית ממנו². התהליך בו הרשת הקפילר של כלי הדם הכליליים גדלים בלב התאים הקודמיים הקיימים נקראת אנגיוגנזה כלילי. מחלת עורק כלילית היא אחד הגורמים המובילים למוות ברחבי העולם, ובכל זאת, טיפול יעיל למחלה זו חסר. הבנת המנגנונים הסלולאריים והמולקולריים המפורטים באנגיוגנזה כלילית יכולים להועיל בעיצוב הטיפולים החדשניים והיעילים לתיקון ולחידוש העורקים הכליליים שנפגעו.

לאחרונה, גל ההבנה שלנו כיצד מתפתחים כלי קיבול כליליים הושג באופן חלקי באמצעות פיתוח כלים וטכנולוגיות חדשים. בפרט, בשנת vivo התוויות היוחסין וטכנולוגיות הדמיה מתקדמות שימושי מאוד לחשוף את המקור הסלולר בידול מסלולים של כלי כלילית^9,10,11,12. למרות היתרונות של אלה בכלים vivo, קיימות מגבלות במונחים של מהירות, גמישות ונגישות. לכן, מערכות מודל מבחנה חזקות יכולות להשלים במערכות vivo כדי להבהיר את המנגנונים הסלולאריים והמולקולריים של אנגיוגנזה כלילית בצורה של תפוקה גבוהה.

כאן, אנו מתארים מודל מתורבת של אנגיוגנזה כלילית. פיתחנו מערכת תרבות התפתחות מחוץ גופית כדי לגדל כלי קיבול כלילית משני רקמות קדמון, SV ו אנדו. עם המודל הזה, אנו מראים כי ברקמות הרקמה מחוץ למוח החוקר לגדול ניצנים כלילית כאשר מגורה על ידי מדיום הצמיחה. בנוסף, תרבויות ההסבר גדלות במהירות בהשוואה לשליטה בזמן הגירוי על ידי גורם הגדילה של כלי הדם A ("וואפ-א"), חלבון אנגיוגנטי חזק במיוחד. יתרה מזאת, גילינו כי נבטי האנגיוגנטית מתרבות ה-SV עוברים הבחנה ורידים (אובדן הבעת ההפיכה-TFII), מנגנון הדומה לאנגיוגנזה של SV ב-vivo¹. נתונים אלה מצביעים על כך שמערכת התרבות התרבותית של החברה ממריצה בנאמנות אירועים של אנגיוגנטי המתרחשים בvivo. באופן קולקטיבי, במודלים של האנגיוגנזה המתוארים כאן, הם אידיאליים לבדיקה של מנגנונים סלולאריים ומולקולריים של אנגיוגנזה כלילית בצורה של תפוקה גבוהה ונגישה.

Protocol

השימוש של כל בעלי החיים בפרוטוקול זה בעקבות כדור המדינה מוסדיים טיפול בעלי חיים הוועדה השימוש (IACUC) הנחיות.

1. הקמת מגדלים עכבר זיהוי אטמי נרתיקי עבור הריונות מתוזמן

1. להקים כלוב הרבייה עכבר עם מסוג פראי גברים ועכברים נקבה. ודא שגיל העכברים הוא בין 6-8 שבועות. להקים זוג (1 זכר ו 1 נקבה) או כשלישייה (1 זכר ו 2 נקבה) להתרבות.
2. בדקו למחרת את הפקק הנרתיק. השתמש במכשיר מתכת זוויתי כדי לזהות תקע עמוק על ידי הוספתו לתוך פתח הנרתיק. לייעד את הבוקר של תקע חיובי הנרתיק להיות היום העובריים 0.5 (e 0.5).
   הערה: תקע מהנרתיק יכול להיות שטחי (שניתן לראותו בקלות, ראה איור 1) או עמוק (שאינו גלוי בקלות). נוכחות של תקע עמוק יחסום החדרת מלאה של המכשיר בעוד העדר תקע יאפשר הכנסה מלאה ללא התנגדות.
3. לשמור על ההריון מתוזמן עד העוברים להגיע e 11.5 שבו הם ייקצרו. כדי לאשר הריון לפני לקצור עוברים, להקליט את המשקל של העכברים הנשיים בין e 7.5 ו-e 11.5.
   הערה: הגידול היומי במשקל האם יציין הריון מוצלח, בעוד ששום שינוי במשקל לא יציין הריון כושל.

2. קצירת עוברים מעכברים בהריון

הערה: לפני תחילת, הקפד לקבל את הציוד הבאים ריאגנטים: קאמרית CO₂ המתת חסד, 70% אתנול, מגבות נייר, מלקחיים רגיל, מלקחיים משובחים, מספריים, 1x מלוחים סטרילית באגירה (PBS), 10 ס מ מנות פטרי סטרילי, מיכל עם קרח, מחורר כף, לנתיחה stereomicroscope.

1. מניחים את העכבר בהריון 11.5 בחדר נקי של₂ המתת חסד כדי להקריב אותו. סגור את המכסה של התא כדי למנוע את העכבר לברוח.
2. לאחר העכבר מאובטח בתא המתת החסד, להפעיל את CO₂. ודא כי לווסת את קצב הזרימה של CO₂ לכל IACUC המלצות (כלומר, 10-30% הזחה לדקה). לאחר העכבר מורדמים לחלוטין, לבצע פריקה צוואר הרחם כדי להבטיח מוות.
3. לרסס את העכבר עם 70% אתנול. הרם את העור מעל הבטן באמצעות מלקחיים, לעשות חתך קטן באמצעות זוג מספריים ולהאריך את החתך החוצה. הגדל את החתך עד לסרעפת וחשוף את קרן הרחם המכילה את העוברים (איור 2).
4. משוך את מחרוזת העוברים (קרן הרחם + עוברים) על ידי אוחז את הרחם ולחתוך אותו בחינם. מניחים את שרשרת העוברים בקירור קר 1x PBS.
5. לנתח את העוברים הבודדים מקרן הרחם על ידי קילוף שריר הרחם, שק החלמון, ואת השפיר על אחד (איור 3A-F) תחת stereomicroscope. העבר את העוברים הנקוחים בכפית מחורר לצלחת פטרי המכילה PBS 1 x מעוקר על הקרח. הקפידו לשמור על העוברים קרים.

3. בידוד לבבות מ-e 11.5 עוברים

הערה: לפני תחילת, הקפד לקבל את הציוד הבאים ריאגנטים: מלקחיים רגיל, מלקחיים עדינים, 1x מעוקר PBS, 10 ס מ צלחת פטרי סטרילי, 6 ס"מ צלחת פטרי סטרילי, מיכל עם קרח, מחורר כפית, לנתיחה stereomicroscope.

1. הגדר צלחת פטרי חדשה עם הקרח קר מעוקר 1x PBS תחת stereomicroscope. להעביר עובר משלב 2.5 לתוך צלחת פטרי כדי לנתח את הלב.
2. להסיר את ראש העובר באמצעות מלקחיים. ראשית, לסחוט את הראש בין מלקחיים ביד אחת ולאחר מכן להסיר את הראש על ידי מגרד אותו משם עם היד השנייה באמצעות מלקחיים סגורים (איור 4א-ג).
3. לאחר הסרת הראש, כוון את העובר עם הצד הגחוני שלו למעלה על ידי החזקת העובר עם מלקחיים על בטנו ביד אחת (איור 4ד).
4. עם זאת, לפתוח את קיר החזה של העובר על ידי הראשון עושה חתך קטן בחזה מעט מעל הסרעפת באמצעות מלקחיים עדינים. אז, להגדיל את החתך בזהירות רבה על ידי החדרת מלקחיים סגורים לקרוע את הקיר בחזה על ידי פתיחת מלקחיים. הקפידו לא לדחוף עמוק מדי, מה שעלול לגרום נזק ללב. בעזרת מלקחיים, לשמור על קיר החזה פתוח לחשוף את הלב ואת הריאות בחלל החזה (איור 4E).
5. באמצעות מלקחיים עדינים, מזיז בעדינות את הלב (90 °) וחושף את עורק העורקים/הווריד. הוצא את הלב/הריאות מתוך לכידת העורקים/הווריד בבסיס הלב (איור 4F-H).
   הערה: להיות עדין תוך משיכת הלב/הריאות כדי למנוע קריעה של SV, אשר ממוקם בצד השני של הלב.
6. לשטוף את הלב/הריאות עם הקרים 1x PBS להסרת כדוריות הדם.
7. חזור על שלבים 3.1-3.6 כדי להסיר את הלב/הריאות של העוברים הנותרים. הקפידו לשמור על קרח מבודד לב/הריאות.

4. בידוד SVs וחדרים מ-e 11.5 לבבות מעובריים של העכבר

1. מניחים את צלחת פטרי עם לב/הריאות משלב 3.7 מתחת stereomicroscope לבודד את SVs ואת החדרים כולו. לקלף את האונות המצורפת של הריאות אחד-אחד מן השורש שלהם באמצעות מלקחיים עדינים.
2. כוון את הלב על הצד הצדדי שלה ולהסיר את הרקמה הסמוכה המקיף את ההזמנה SV מבלי לקרוע את SV. הסר את השמאל ואת הימין מהלב על ידי החזקת בבסיסו ומגרדים אותו באמצעות מלקחיים עדינים (איור 5ב). הסר את הרקמה הסמוכה סביב SV באמצעות טכניקה דומה (איור 5ג).
   הערה: זכור כי האטריום הימני מחובר ל-SV, כדי להיזהר רק להסיר את האטריום.
3. כדי לבודד את ה-SV, ראשית המזרח הלב עם הצד הצדדי שלו פונה כלפי מעלה (כי SV הוא בצד החלק השני) ולשמור על הלב עדיין בתנוחה זו על ידי החזקת בעדינות את הלב על החדרים שלה עם מלקחיים.
   הערה: ה-SV הוא איבר של לב עובריים הנמצא בין האטריה בצידו הפנימי של הלב.
4. הסר את ה-SV על ידי קילוף בזהירות את הלב שבו הוא מצורף או על ידי החזקת SV בבסיס ההחזקה שלה עם מלקחיים עדינים מגרד אותו עם מלקחיים סגורים (איור 5ד, E).
5. העבר את SV מבודדים לתוך צלחת חדשה 6 ס מ פטרי עם קירור קר 1x PBS על הקרח באמצעות פיפטה העברה סטרילית לתייג את צלחת פטרי כמו SV.
6. כדי לבודד את החדרים כולו, להסיר את מערכת הזרימה (עורק העורקים ואת גזע הריאות) מהלב לאחר הסרת SV (איור 5F, G).
7. העבר את החדרים כולו לתוך צלחת חדשה 6 ס מ פטרי המכיל מעוקר 1x PBS על הקרח באמצעות פיפטה העברה סטרילית לתייג את צלחת פטרי כמו החדרים. לשמור על SV מבודדת החדרים על הקרח.
8. חזור על שלבים 4.1-4.7 כדי לבודד SVs והחדרים משאר הלבבות.

5. הגדרת לוחות תרבות רקמה עם מוסיף וציפוי מטריקס מסחטות

הערה: לפני תחילת, הקפד לקבל את הציוד הבאים ריאגנטים: הפתרון המסחרי מטריצה מסחרי (ECM; למשל, מטריצות), 8.0 μM פוליאתילן terאפרון (PET) מוסיף תרבות, 24 לוחות טוב, 37 ° c, 5% CO בחממה₂ .

1. תנו לפתרון ה-ECM להפשיר את הקרח. שמור את הפתרון ECM על הקרח כדי למנוע מיצוק.
2. מניחים את התרבות הממברנה PET מוסיף (גודל הנקבוביות = 8.0 μm, אזור סינון = 0.3 ס"מ², מסנן קוטר = 6.5 מ"מ) לתוך הבארות של תרבות שאינה רקמה שטופלו 24 צלחות. תווית את הצלחות כמו SV או החדרים עבור SV או אנקרחיוג אנגיוגנזה assays בהתאמה.
   הערה: הגדר את התוספות בצלחות נפרדות עבור ה-SV והחדרים בעת ביצוע שתי התרבויות בו זמנית. הקפד להגדיר מספיק בארות עבור כל הדגימות ניסיוני ובקרות.
3. לאחר פתרון ECM מופדים, מיד לדלל ECM 1:2 בינונית בסיס מראש (כלומר, EBM-2 בסיס הבסיס, ראה טבלת חומרים) לנפח מספיק (100 μl/הוסף x מספר התוספות).
   הערה: למשל, אם יש שישה מוסיף, אז הנפח הכולל יהיה 100 μL x 6 = 600 μL. הוסף 200 μL של ECM לתוך 400 μL של המדיום הבזלי.
4. המעיל מוסיף עם 100 μL של ECM טרי מדולל על ידי הוספת אותו ישירות על גבי קרום. מודקת את הצלחת ב 37 ° c עבור לפחות 30 דקות כדי לאפשר ECM לגבש.
   הערה: יש לבצע זאת תחת המכסה התרבותי של רקמת הזרימה כדי למנוע זיהום.

6. SVs ו תרבות החללי המלא

הערה: לפני תחילת, הקפד לקבל את הציוד הבאים ריאגנטים: 70% אתנול, העברת הצינורות, stereomicroscope, מלקחיים, כיסוי התרבות של רקמת זרימה למינארי, מיקרוכלי-דם מיקרו מוסף תאהתוספת (טבלת חומרים), בסיס מדיום, 1x סטרילי PBS). איור 6 מראה את זרימת העבודה של התרבות SV וחדר החדר.

1. להפשיר את התוכן של ערכת תוספת על קרח. הכינו את המדיום השלם על ידי הוספת כל התוכן של ערכת התוספת לתוך 500 mL של בסיס הבסיס תחת מוסמך כיסוי התרבות הגוף רקמת הזרימה. מערבבים היטב את המדיום ומפיצים ל50 mL.
2. לחטא את הבסיס של אזור העבודה stereomicroscope והסביבה עם 70% אתנול.
3. השג את לוחיות התרבות של הרקמה משלב 5.4. בעזרת פיפטה העברה, בזהירות להעביר את explants משלב 4.7 על גבי קרום ההכנסה. תחת stereomicroscope ובעזרת מלקחיים נקיים, מקמו את האקסוצמחים במרכז התוספות כדי לוודא שהם לא תקועים בפינת התוספות או מחוברים לקירות הצדדיים.
4. לאחר explants ממוקמים וממורכז על מוסיף, בזהירות להסיר כל PBS נוסף מן התוספות ולסגור את העפעפיים של הצלחות.
5. תחת המכסה התרבותי של רקמת הזרימה למינארי, להוסיף 100 μL של המדיום השלם prewarmed על גבי מוסיף ו 200 μL לתוך הבארות כדי התרבות explants על ממשק נוזלי האוויר כגון משטח הבסיס של הכנס הוא במגע עם המדיום , אך המשטח העליון נחשף לאוויר.
   הערה: הקפד לכוונן את עוצמת הקול כדי להשיג ממשק נוזלי אוויר אם באמצעות מוסיף בגודל שונה/טוב צלחות.
6. הוסף 300 μL של PBS לתוך הבארות שאינן בשימוש של 24 צלחות ולכסות עם המכסה. מודקת את הצלחת ב 37 ° c, 5% שיתוף חממה₂ , ולצמוח את התרבויות 5 ימים.
7. בימים הבאים, להתבונן באופן שגרתי בתרבויות תחת מיקרוסקופ אור הפוך כדי להעריך את מעמדם של תרבויות ההסבר. ודא כי the explants התערוכה מכות הכוללת את כל האקסוצמחים מחוברים לתחתית הקרום מוטבע עם ECM. שימו לב לכל הרחבות צף.
   הערה: הכיווץ התקופתי של האקכורים מעיד על כך שהם חיים. הרחבות צף אמורות להיות מושמטות מהניתוח.
8. לאחר הערכת מעמד התרבות, הכניסו את לוח התרבות בחזרה לחממה והמשיכו לגדל את התרבות עד חמישה ימים.

7. טיפול בתרבויות עם השליטה החיובית

הערה: לפני תחילת, הקפד לקבל את הציוד הבאים ריאגנטים: כיסוי התרבות של רקמת זרימה למינארי, 1x PBS, בסיס בינוני + 1% סרום העוברי (FBS), בינוני בסיס +-מדיום-מיכשור וציוד, וטיפים.

1. הכינו את המדיום הבזאלי + 1% FBS ואת המדיום הבזאלי + הבסיס.
   1. כדי להכין את המדיום הבזאלי + 1% FBS, קבע תחילה את מספר בארות הבקרה הדרושות. למשל, אם יש שלוש בארות שליטה, אז 300 μL/טוב x 3 = 900 μL הוא הנפח הכולל הדרוש. הוסף 9 μL של FBS לתוך 891 μL של המדיום הבזליים כדי להפוך את המדיום הבסיס +1% FBS.
   2. כדי להכין את המדיום הבזאלי + מדיום-A, קבע תחילה את המספר הכולל של בארות הזקוקים ל-מדיום. אם יש שלוש בארות, אז 300 μL/טוב x 3 = 900 μL הוא אמצעי האחסון הכולל ו50 ng/טוב x 3 = 150-A. הוסף 150 ng של מדיום-A לתוך 900 μL של בסיס הבסיס כדי להפוך את מדיום בסיס + הבסיס.
      הערה: הכנס פתרון זה באמצעי אחסון גדול יותר מאשר מחושב כדי להבטיח מספר מספיק של הרשאות קטנות עבור כל ניסוי.
2. ביום 2, הוציאו את המדיה משני התאים (התוספות והבארות). לשטוף את התרבויות עם 300 μL של 1x PBS על ידי הוספת 100 μL ל מוסיף ו 200 μL לתוך הבארות. מערבולת בחוזקה את הצלחות כמה פעמים ומסירים את ה-PBS.
3. הוסף 300 μL של בינוני בסיס + 1% FBS (100 μL לתוך התוספת ו 200 μL לתוך הבארות) כדי להרעיב את התרבויות עבור 24 שעות.
4. ביום 3, לאחר הרעב, להוסיף 300 μL של בינונית בסיס +1% FBS (100 μL לתוך הכנס ו 200 μL לתוך הבארות) לתוך בארות הבקרה בינונית בסיס + ומעלה-A (50 ng/גם) לתוך הטיפול בארות, בהתאמה.
5. לאחר הטיפול, המשיכו לגדל את התרבויות בחממה.

8. קיבוע ומכתים חיסוני

הערה: לפני תחילת, הקפד לקבל את הציוד הבאים ריאגנטים: 4% פאראפורמלדהיד (כדור הראש), 1x PBS, הראשי והמשני נוגדנים, שייקר, 0.5% nonionic החומרים ב-PBS (PBT).

1. ביום השישי של culturing, להסיר את המדיום ולשטוף את התרבויות עם 1 x PBS בטמפרטורת החדר (RT).
   1. תקן את התרבויות על ידי הוספת 200 μL של 4% הפתרון הכל1 לתוך הבארות ו 100 μL לתוך התוספות. לתקן תרבויות ב 4 ° צ' במשך 20 דקות בזמן הנדנדה.
   2. לאחר הקיבעון 20 דקות, להסיר את החצי הראשון מן התרבויות בתוך מכסה ולשטוף את התרבויות עם 1x PBS ידי הוספת 200 μL לתוך הבארות 100 μL לתוך התוספות.
   3. חזור על שוטף 3 x, 10 דקות כל אחד, בזמן הנדנדה. לאחר מכן המשך לבצע כתמים חיסוני.
      הערה: כל צעדי השטיפה מבוצעים על שחקן ספסל ב-RT.
2. לדלל נוגדנים עיקריים (אנטי-VE-קדהרין, anti-ERG 1/2/3) בפתרון חסימה (5% החמור סרום, 0.5% PBT). הוסף 300 μL של פתרון הנוגדן העיקרי (200 μL ב בארות התחתונה ו 100 μL לתוך התוספות). התרבות הדגירה של נוגדנים בתוך הלילה ב 4 ° צ' בעת הנדנדה.
   הערה: משתמשים באנטי-וו-קדהרין כדי לתייג את קרום התא האנדותל ו-anti-ERG 1/2/3 משמש להוספת תווית לגרעין התא האנדותל כדי להמחיש את הנבטים של תאי האנדותל.
3. למחרת, לשטוף ולנענע את לוחות התרבות 10x ב 0.5% PBT, שינוי PBT כל 10 דקות.
4. לדלל את הנוגדנים המשניים (חמור נגד חולדה אלקסה Fluor 488 ו חמור אנטי ארנב אלקסה Fluor 555) בפתרון חסימה. הוסף 300 μL של הנוגדן המשני כמו בשלב 8.2 ו דגירה התרבויות לילה ב 4 ° צ' בעת נדנדה. ביום שלמחרת, רוחצים את הנוגדנים המשניים 10x ב PBT, שינוי PBT כל 10 דקות.
   הערה: לשטוף מינימום של 10x אבל יותר שוטף הם טובים יותר. לאחר השלמת השיטיפות, ניתן לאחסן את התרבויות ב-1x PBS עד להרכבה על שקופיות.

9. הרכבה של תרבויות על שקופיות, הדמיה וניתוח

הערה: לפני תחילת, הקפד לקבל את הציוד הבאים ריאגנטים: מלקחיים עדינים, שקופיות, הרכבה בינונית עם 4 ′, 6-diamidino-2-פניינילידול (dapi), כיסוי, ומיקרוסקופ קונפוקלית וקד. לאחר כתמים נוגדן משני, לטעון את התרבויות על שקופיות לדימות באמצעות השלבים הבאים.

1. לקלף את הקרום בזהירות מן הכנס באמצעות מלקחיים עדינים ולהעביר אותו על השקופיות על ידי הצבת הממברנה בצד למטה והצבת תרבויות ההסבר כלפי מעלה. הצב את דגימות השכפול באותן שקופיות ותייג את השקופיות כפקד או על-ידי הערך הרגיל. הוסף כמה טיפות של בינוני גובר עם DAPI ישירות על הקרום ולכסות את השקופיות עם תעודות מכסות.
   הערה: הקפד להימנע בועות אוויר תוך הצבת שמיכות.
2. אטום את קצות השקופיות עם לק בהיר ולתת יבש.
   הערה: ניתן לאחסן שקופיות ב-20 ° צ' לאחסון לטווח ארוך.
3. תמונה שקופיות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד.
4. ביצוע ניתוח כדי למדוד את אורך הצמיחה של אנגיוגנטי. ככמת אנגיוגנטית אורך הצמיחה על ידי מדידת המרחק של תאי האנדותל (Ve-קדהרין +/ERG 1/2/3 +) המורחבת מתוך הגבול הפנימי של ERG 1/2/3 + תאים בתרבויות החדר ומהמרכז של ה-SV explants בתרבויות SV.
   1. כדי לבצע כימות באמצעות פיג'י/ImageJ, הורד תחילה את תוכנת פיג'י.
   2. פתיחת קובצי תמונות בפיג: עבור לקובץ | פתח | תיקיה | שם קובץ | . פתח אתזה
   3. עבור לניתוח | הגדרת מדידות | בחר היקף.
   4. בחרו בכלי קו ישר מהחלון הראשי.
   5. צייר קו לאורך הנבט כפי שהוצע בשלב 9.4.
   6. עבור לניתוח | . מידה מדידה
      הערה: מדידות אורך מוצגות בחלון החדש.
   7. לבצע כימות בתמונות המייצגות לפחות שלושה שדות שנבחרו באופן אקראי. ממוצע מדידות אורך הנבט ודווח עליהן כמשמעות של ± סטיית תקן.

תוצאות

אחת התכונות הבולט ביותר של אנגיוגנזה של SV ב vivo היא שהיא עוקבת אחר מסלול מסוים וכרוכה בביטול התא ובידול אירועים המתרחשים בזמנים ומיקומים¹. כמו תאים SV הראשונית לגדול על חדר הלב, הם מפסיקים לייצר סמנים ורידים כגון הפיכה-TFII (איור 7). לאחר מכן, נבטי כ...

Discussion

חלק מהצעדים הקריטיים ביותר לגידול בהצלחה באוניות כלילית מתוך הרקמות SV ו-אנדו הם: 1) זיהוי נכון ובידוד רקמת SV עבור תרבות SV; 2) שימוש בחללי החדרים מעוברים בין הגילאים e11-11.5 לתרבות אנדו מדויקת; 3) שמירה על תנאים סטריליים לאורך תקופת הניתוח ושמירה על הרקמות קרות בכל עת; ו 4) שמירה על explants מחוברים קרו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 x 20 MM Tissue Culture Dish	Fisher Scientific	877222	Referred in the protocol as Petri dish
24-well plates	Fisher Scientific	08-772-51
8.0 uM PET membrane culture inserts	Millipore Sigma	MCEP24H48
Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555	Fisher Scientific	A31572	Secondary antibody
Alexa Fluor Donkey anti-rat 488	Fisher Scientific	A21206	Secondary antibody
Angled Metal Probe	Fine science tools	10088-15	Angled 45 degree, used for detecting deep plugs
Anti- ERG 1/2/3 antibody	Abcam	Ab92513	Primary antibody
Anti- VE-Cadherin antibody	Fisher Scientific	BDB550548	Primary antibody, manufacturer BD BioSciences
CO2 gas tank	Various suppliers	N/A
CO2 Incubator	Fisher Scientific	13998223	For 37 °C, 5% CO2 incubation
Dissection stereomicrosope	Leica	S9i	Leica S9i Stereomicroscope
EBM-2 basal media	Lonza	CC-3156	Endothelial cell growth basal media
ECM solution	Corning	354230	Commercially known as Matrigel
EGM-2 MV Singlequots Kit	Lonza	CC-4147	Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	SH3007003IR
FiJi	NIH	NA	Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads)
Fine Forceps	Fine science tools	11412-11	Used for embryo dissection
Fisherbrand Straight-Blade operating scissors	Fisher Scientific	13-808-4
Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X)	Fisher Scientific	SH-302-5601LR
Laminar flow tissue culture hood	Fisher Scientific	various models available
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1200	Vectashield with DAPI
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy/Fisher	50-980-494	This is available at 32%; needs to be diluted to 4%
Perforated spoon	Fine science tools	10370-18	Useful in removing embryo/tissues from a solution
Recombinant Murine VEGF-A 165	PeproTech	450-32
Standard forceps, Dumont #5	Fine science tools	11251-30
Sure-Seal Mouse/Rat chamber	Easysysteminc	EZ-1785	Euthanasia chamber