Modello in vitro dell'angiogenesi coronarica

Riepilogo

I modelli in vitro di angiogenesi coronarica possono essere utilizzati per la scoperta dei meccanismi cellulari e molecolari dell'angiogenesi coronarica. Le colture in vitro espiante di venosus e tessuti endocardio mostrano una solida crescita in risposta al VEGF-A e mostrano un modello simile di espressione COUP-TFII come in vivo.

Abstract

Qui, descriviamo un saggio in vitro per studiare l'angiogenesi coronarica. I vasi coronarici alimentano il muscolo cardiaco e sono di importanza clinica. I difetti in questi vasi rappresentano gravi rischi per la salute come l'aterosclerosi, che può portare a infarti miocardici e insufficienze cardiache nei pazienti. Di conseguenza, la malattia coronarica è una delle principali cause di morte in tutto il mondo. Nonostante la sua importanza clinica, relativamente pochi progressi sono stati fatti su come rigenerare le arterie coronarie danneggiate. Tuttavia, sono stati fatti recenti progressi nella comprensione dell'origine cellulare e dei percorsi di differenziazione dello sviluppo dei vasi coronarici. L'avvento di strumenti e tecnologie che consentono ai ricercatori di etichettare fluorescentmente le cellule progenitrici, seguire il loro destino e visualizzare le progenie in vivo sono state fondamentali per comprendere lo sviluppo di vasi coronarici. Gli studi in vivo sono preziosi, ma hanno limitazioni in termini di velocità, accessibilità e flessibilità nella progettazione sperimentale. In alternativa, accurati modelli in vitro di angiogenesi coronarica possono aggirare questi limiti e consentire ai ricercatori di interrogare importanti questioni biologiche con velocità e flessibilità. La mancanza di adeguati sistemi di modelli in vitro può aver ostacolato i progressi nella comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari della crescita dei vasi coronarici. Qui, descriviamo un sistema di coltura in vitro per far crescere vasi coronarici dal veleno del seno (SV) e dall'endocardio (Endo), i due tessuti progenitori da cui nascono molti dei vasi coronarici. Abbiamo anche confermato che le culture riassumono accuratamente alcuni dei meccanismi in vivo noti. Per esempio, mostriamo che i germogli angiogenici in coltura da SV downregulate espressione COUP-TFII simile a quello che si osserva in vivo. Inoltre, mostriamo che il VEGF-A, noto fattore angiogenico in vivo, stimola in modo robusto l'angiogenesi sia delle culture SV che Endo. Collettivamente, abbiamo ideato un modello accurato di coltura in vitro per studiare l'angiogenesi coronarica.

Introduzione

I vasi sanguigni del cuore sono comunemente chiamati vasi coronarici. Questi vasi sono costituiti da arterie, vene e capillari. Durante lo sviluppo, i capillari altamente ramificati vengono stabiliti prima, che poi rimodellano in arterie coronarie e vene^1,2,3,4^,5. Questi capillari iniziali sono costruiti da cellule progenitrici endoteliali presenti nel proepicardio, nel veleno del seno (SV) e nei tessuti dell'endocardio (Endo)^1,6^,7,8. SV è l'organo di afflusso del cuore embrionale ed Endo è il rivestimento interno del lume del cuore. Le cellule del progenitore endoteliale presenti nella SV e nell'Endo costruiscono la maggior parte della vascolatura coronarica, mentre il proepidico contribuisce ad una porzione relativamente piccola di esso². Il processo mediante il quale la rete capillare di vasi coronarici cresce nel cuore dalle sue cellule precursori preesistenti è chiamata angiogenesi coronarica. La malattia coronarica è una delle principali cause di morte in tutto il mondo e tuttavia manca un trattamento efficace per questa malattia. Comprendere i meccanismi cellulari e molecolari dettagliati dell'angiogenesi coronarica può essere utile nella progettazione di terapie nuove ed efficaci per riparare e rigenerare le arterie coronarie danneggiate.

Recentemente, un aumento nella nostra comprensione di come si sviluppano i vasi coronarici è stato in parte raggiunto attraverso lo sviluppo di nuovi strumenti e tecnologie. In particolare, l'etichettatura del lignaggio in vivo e le tecnologie di imaging avanzate sono state molto utili per scoprire l'origine cellulare e i percorsi di differenziazione dei vasi coronarici^9,10,11,12. Nonostante i vantaggi di questi strumenti in vivo, ci sono limitazioni in termini di velocità, flessibilità e accessibilità. Pertanto, robusti sistemi di modelli in vitro possono integrare i sistemi in vivo per chiarire i meccanismi cellulari e molecolari dell'angiogenesi coronarica in modo ad alta produttività.

Qui, descriviamo un modello in vitro di angiogenesi coronarica. Abbiamo sviluppato un sistema di coltura in vitro per far crescere vasi coronarici da due tessuti progenitori, SV ed Endo. Con questo modello, mostriamo che le colture di espianto di tessuto in vitro crescono germogli di vasi coronarici quando stimolati dal mezzo di crescita. Inoltre, le colture di espiante crescono rapidamente rispetto al controllo quando stimolate dal fattore di crescita endoteliale vascolare A (VEGF-A), una proteina angiogenica altamente potente. Inoltre, abbiamo scoperto che i germogli angiogenici della cultura SV subiscono una dedifferenziazione venosa (perdita di espressione COUP-TFII), un meccanismo simile all'angiogenesi SV in vivo¹. Questi dati suggeriscono che il sistema culturale dell'espianto in vitro ripristina fedelmente gli eventi angiogenici che si verificano in vivo. Collettivamente, i modelli in vitro di angiogenesi che sono descritti qui sono ideali per sondare meccanismi cellulari e molecolari di angiogenesi coronarica in modo ad alta produttività e accessibile.

Protocollo

L'uso di tutti gli animali in questo protocollo ha seguito le linee guida del Ball State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Stabilire allevatori di topi e rilevare spine vaginali per gravidanze a tempo

1. Impostare una gabbia per l'allevamento di topi selvatici di tipo maschile e femminile. Assicurarsi che l'età dei topi da riproduzione sia compresa tra 6-8 settimane. Impostare una coppia (1 maschio e 1 femmina) o come trio (1 maschio e 2 femmina) per l'allevamento.
2. Verificare la presenza di una spina vaginale la mattina seguente. Utilizzare una sonda metallica angolata per rilevare una spina profonda inserendola nell'apertura vaginale. Designare la mattina di un tappo vaginale positivo per essere giorno embrionale 0.5 (e0.5).
   NOTA: Una spina vaginale può essere superficiale (che è facilmente visibile, vedere Figura 1) o profonda (che non è facilmente visibile). La presenza di una spina profonda bloccherà l'inserimento completo della sonda, mentre l'assenza di una spina consentirà l'inserimento completo senza resistenza.
3. Mantenere la gravidanza a tempo fino a quando gli embrioni raggiungono e11.5 in cui saranno raccolti. Per confermare la gravidanza prima della raccolta degli embrioni, registrare il peso dei topi femminili tra e7.5 e e11.5.
   NOTA: L'aumento giornaliero del peso della madre indicherà una gravidanza di successo, mentre nessun cambiamento di peso indicherà una gravidanza fallita.

2. Raccolta di embrioni da topi in gravidanza

NOTA: Prima di iniziare, assicurarsi di avere le seguenti attrezzature e reagenti: una camera di eutanasia CO_2, 70% di etanolo, asciugamani di carta, pinze regolari, pinze fini, forbici, 1x sterile fosfato-bufferato salina (PBS), 10 cm sterile sterile piatti Petri, contenitore con ghiaccio, cucchiaio perforato, dissezione stereomicroscopio.

1. Mettere un topo incinta e11.5 in una camera di eutanasia di CO₂ pulita per sacrificarlo. Chiudere il coperchio della camera per evitare che il mouse esui.
2. Dopo aver fissato il mouse nella camera di eutanasia, attivare CO₂. Assicurarsi di regolare la portata di CO₂ per le raccomandazioni IACUC (cioè 10-30% di spostamento al minuto). Dopo che il topo è completamente eutanasia, eseguire lussazione cervicale per garantire la morte.
3. Spruzzare il mouse con 70% di etanolo. Sollevare la pelle sul ventre utilizzando pinze, fare una piccola incisione utilizzando un paio di forbici ed estendere l'incisione lateralmente. Ingrandire l'incisione anteriormente fino al diaframma ed esporre il corno uterino contenente gli embrioni (Figura 2).
4. Estrarre la stringa di embrioni (corno uterino - embrioni) afferrando l'utero e tagliandolo libero. Mettere la stringa di embrioni in 1x PBS sterile a freddo ghiaccio.
5. Dissezionare i singoli embrioni dal corno d'utero staccando il muscolo uterino, il sacco del tuorlo e l'amnione uno per uno(Figura 3A-F) sotto uno stereomicroscopio. Trasferire gli embrioni puliti con un cucchiaio perforato in un piatto Petri contenente sterile 1x PBS sul ghiaccio. Assicurarsi di mantenere gli embrioni freddi.

3. Isolare i cuori da e11.5 Embrioni

NOTA: Prima di iniziare, assicurarsi di avere le seguenti attrezzature e reagenti: pinze regolari, pinze sottili, 1x sterile PBS, 10 cm sterile piatto Petri, 6 cm sterile Petri parabola, contenitore con ghiaccio, cucchiaio perforato, dissezione stereomicroscopio.

1. Impostare un nuovo piatto Petri con sterile ghiacciato 1x PBS sotto uno stereomicroscopio. Trasferire un embrione dalla fase 2.5 nel piatto Petri per sezionare il cuore.
2. Rimuovere la testa dell'embrione con le pinze. In primo luogo, spremere la testa tra le pinze con una mano e quindi rimuovere la testa raschiando via con l'altra mano utilizzando pinze chiuse (Figura 4A-C).
3. Dopo aver rimosso la testa, orientare l'embrione con il lato ventrale tenendo l'embrione con le pinze alla pancia con una mano (Figura 4D).
4. Con l'altra mano, aprire la parete toracica dell'embrione prima facendo una piccola incisione nel torace leggermente sopra il diaframma utilizzando pinze sottili. Quindi, ingrandire l'incisione con molta attenzione inserendo pinze chiuse e strappando la parete toracica aprendo le pinze. Assicurarsi di non spingere troppo in profondità, che può danneggiare il cuore. Con l'aiuto delle pinze, tenere la parete toracica spalancata per esporre il cuore e i polmoni nella cavità toracica (Figura 4E).
5. Usando le pinze sottili, muovi delicatamente il cuore anteriormente (90o) ed esponi l'aorta/veina dorsale. Estrarre il cuore/ polmoni anteriormente catturando l'aorta/vena dorsale alla base del cuore (Figura 4F-H).
   NOTA: Sii gentile mentre estrai il cuore /i polmoni per evitare lo strappo della SV, che si trova sul lato dorsale del cuore.
6. Sciacquare il cuore/polmone con 1x PBS freddo per rimuovere le cellule del sangue.
7. Ripetere i passaggi da 3.1 a 3.6 per rimuovere il cuore/i polmoni dagli embrioni rimanenti. Assicurarsi di tenere il cuore/polmoni isolati sul ghiaccio.

4. Isolamento di SAv e Ventricoli da e11.5 Cuori murini embrionali

1. Posizionare il piatto Petri con cuore/polmoni dal punto 3.7 sotto uno stereomicroscopio per isolare i SV e i ventricoli interi. Sbucciare i lobi attaccati dei polmoni uno ad uno dalla loro radice utilizzando pinze fini.
2. Orientare il cuore sul lato dorsale e rimuovere gli atri e il tessuto adiacente che circonda la SV anteriormente senza strappare la SV. Rimuovere gli atri sinistro e destro dal cuore tenendo alla sua base e raschiandolo via con pinze sottili (Figura 5B). Rimuovere il tessuto adiacente che circonda l'SV con una tecnica simile (Figura 5C).
   NOTA: Tenere presente che l'atrio giusto è collegato all'Atrio, quindi fate attenzione a rimuovere solo l'atrio.
3. Per isolare l'SV, prima orientare il cuore con il suo lato dorsale rivolto verso l'alto (perché la SV è sul lato dorsale) e mantenere il cuore ancora in questa posizione tenendo delicatamente il cuore ai suoi ventricoli con pinze.
   NOTA: L'SV è un organo in flusso di un cuore embrionale che si trova tra gli atri sul lato dorsale del cuore.
4. Rimuovere la SV staccandolo con cura dal cuore dove è attaccato o tenendo la SV alla base del suo attacco con pinze sottili e raschiandola con pinze chiuse (Figura 5D,E).
5. Trasferire la SV isolata in una nuova parabola Petri di 6 cm con sterile ghiacciato 1x PBS sul ghiaccio utilizzando una pipetta di trasferimento sterile ed etichettare il piatto Petri come SV.
6. Per isolare tutti i ventricoli, rimuovere il tratto di deflusso (aorta e tronco polmonare) dal cuore dopo la rimozione della SV (Figura 5F,G).
7. Trasferire l'intero ventricolo in un nuovo piatto Petri di 6 cm contenente sterile 1x PBS sul ghiaccio utilizzando una pipetta di trasferimento sterile ed etichettare il piatto Petri come ventricoli. Tenere l'Isolato SV e ventricoli sul ghiaccio.
8. Ripetere i passaggi da 4.1 a 4.7 per isolare gli SV e i ventricoli dai cuori rimanenti.

5. Impostazione di piastre di coltura dei tessuti con inserti e rivestimento a matrice extracellulare

NOTA: Prima di iniziare, assicurarsi di disporre delle seguenti attrezzature e reagenti: soluzione a matrice extracellulare commerciale (ECM; ad esempio, Matrigel), 8,0 inserti di coltura in polietilene terephthalate (PET), 24 piastre di pozzo, 37 gradi centigradi, 5% di incubatore di CO_2.

1. Lasciare scongelare la soluzione ECM sul ghiaccio. Mantenere la soluzione ECM sul ghiaccio per evitare la solidificazione.
2. Collocare gli inserti della coltura della membrana PET (dimensione del poro - 8,0 m, area di filtrazione - 0,3 cm², diametro del filtro , 6,5 mm) nei pozzi della coltura non tissutale trattati 24 piastre di pozzo. Etichettare le piastre come SV o ventricoli per la SV o i saggi di angiogenesi endocardiale, rispettivamente.
   NOTA: Impostare gli inserti in piastre separate per l'SV e i ventricoli quando si eseguono entrambe le colture contemporaneamente. Assicurarsi di impostare abbastanza pozzi per tutti i campioni e controlli sperimentali.
3. Dopo lo scongelamento della soluzione ECM, diluire immediatamente ECM 1:2 in un supporto basale preraffreddato (ad esempio, supporto basale EBM-2, vedere Tabella dei materiali) a un volume sufficiente (100 L/inserire x numero di inserti).
   NOTA: Ad esempio, se ci sono sei inserti, il volume totale sarà 100 x 6 x 600 L. Aggiungere 200 L di ECM in 400 - L di supporto basale.
4. Rivestire gli inserti con 100 gradi di ECM appena diluito aggiungendolo direttamente sopra la membrana. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi per almeno 30 min per consentire all'ECM di solidificare.
   NOTA: Questa operazione deve essere eseguita in una cappa di coltura del tessuto a flusso laminare per evitare la contaminazione.

6. SV e Culture Ventrili Intere

NOTA: Prima di iniziare, assicurarsi di avere le seguenti attrezzature e reagenti: 70% etanolo, transfer pipette, stereomicroscopio, pinze, cappa di coltura del tessuto flusso laminare, kit di supplemento di cellule endoteliali microvascolari (Tabella dei materiali), mezzo basale, 1xe steril e PBS). La figura 6 mostra il flusso di lavoro della cultura SV e ventricola.

1. Scongelare il contenuto del kit di supplemento sul ghiaccio. Preparare il mezzo completo aggiungendo tutti i contenuti del kit di supplemento in 500 mL di mezzo basale sotto un cofano di coltura del tessuto a flusso laminare certificato. Mescolare bene il mezzo e distribuirlo in aliquote da 50 mL.
2. Sterilizzare la base dello stereomicroscopio e dell'area di lavoro circostante con il 70% di etanolo.
3. Ottenere le piastre di coltura dei tessuti dal punto 5.4. Con l'aiuto di una pipetta di trasferimento, trasferire attentamente gli espianti dal passaggio 4.7 sulla parte superiore della membrana di inserimento. Sotto uno stereomicroscopio e con l'aiuto di pinze pulite, posizionare i semiplants al centro degli inserti per assicurarsi che non siano bloccati nell'angolo degli inserti o attaccati alle pareti laterali.
4. Dopo aver posizionato e centrato gli inserti agli espiatori, rimuovere con attenzione eventuali PBS aggiuntivi dagli inserti e chiudere i coperchi delle piastre.
5. Sotto un cofano di coltura del tessuto di flusso laminare, aggiungere 100 L del mezzo completo preriscaldato sopra gli inserti e 200 L nei pozzi per lacoltura degli espianti all'interfaccia aria-liquido in modo che la superficie basale dell'inserto sia a contatto con il mezzo , ma la superficie superiore è esposta all'aria.
   NOTA: Assicurarsi di regolare il volume per ottenere un'interfaccia aria-liquido se si utilizzano inserti di dimensioni diverse/ piastre di pozzo.
6. Aggiungere 300 l di PBS nei pozze inutilizzati delle 24 lastre del pozzo e coprire con il coperchio. Incubare la piastra in un incubatore di CO₂ a 37 gradi e coltivare le culture per 5 giorni.
7. Nei giorni successivi, osservare regolarmente le colture al microscopio luminoso invertito per valutare lo stato delle colture espiante. Assicurarsi che gli espianti esibiscano il pestaggio contrattile e che tutti gli espianti siano attaccati alla parte inferiore della membrana incorporata con ECM. Prendere nota di eventuali espianti galleggianti.
   NOTA: la contrazione periodica degli espianti indica che sono vivi. Gli espianti galleggianti devono essere omessi dall'analisi.
8. Dopo aver valutato lo stato culturale, rimettere la piastra di coltura nell'incubatrice e continuare a far crescere la coltura per un massimo di 5 giorni.

7. Trattamento delle colture con VEGF-A (controllo positivo)

NOTA: prima di iniziare, assicurarsi di disporre delle seguenti attrezzature e reagenti: cappa di coltura del tessuto del flusso laminare, 1x PBS, supporto basale , 1% siero bovino fetale (FBS), supporto basale - VEGF-A, pipette e punte pipette.

1. Preparare il supporto basale dell'1% FBS e il supporto basale - VEGF-A.
   1. Per preparare il supporto basale - 1% FBS, determinare innanzitutto il numero di pozzi di controllo necessari. Ad esempio, se ci sono tre pozze di controllo, allora 300 L/well x 3 x 900 L è il volume totale necessario. Aggiungete 9 L di FBS a 891 l di mezzo basale per rendere il mezzo basale : 1% FBS.
   2. Per preparare il supporto basale - VEGF-A, determinare innanzitutto il numero totale di pozzi che necessitano di un supporto VEGF-A. Se ci sono tre pozze, allora 300 l/well x 3 x 900 l è il volume totale e 50 ng/well x 3 x 150 ng VEGF-A. Aggiungete 150 ng di VEGF-A in 900 l di mezzo basale per rendere il mezzo basale : VEGF-A.
      NOTA: assemblare questa soluzione a un volume maggiore di quello calcolato per assicurare un numero sufficiente di aliquote più piccole per ogni esperimento.
2. Il giorno 2, rimuovere il supporto da entrambe le camere (gli inserti e i pozzi). Lavare le colture con 300 - L di 1x PBS aggiungendo 100 - L agli inserti e 200 L nei pozze. Girare saldamente le piastre un paio di volte e rimuovere il PBS.
3. Aggiungete 300 l di mezzo basale : 1% DiF (100 gradi nell'inserto e 200 l nei pozze) per affamare le colture per 24 h.
4. Il giorno 3, dopo la fame, aggiungere 300 l di mezzo basale : 1% DiF (100 -L nell'inserto e 200 L nei pozze di controllo) rispettivamente nei pozze di controllo e nel mezzo basale - VEGF-A (50 ng/well) nei pozze di trattamento.
5. Dopo il trattamento, continuare a far crescere le colture nell'incubatrice.

8. Fissaggio e immunostaining

NOTA: Prima di iniziare, assicurarsi di avere le seguenti attrezzature e reagenti: 4% paraformaldeide (PFA), 1x PBS, anticorpi primari e secondari, uno shaker, 0.5% nonionic surfactant in PBS (PBT).

1. Il sesto giorno di coltura, rimuovere il mezzo e lavare le colture con 1x PBS a temperatura ambiente (RT).
   1. Fissare le colture aggiungendo 200 l di 4% soluzione PFA nei pozze e 100 L negli inserti. Fissare le colture a 4 gradi centigradi per 20 min mentre dondola.
   2. Dopo 20 min di fissazione, togliere la PFA dalle colture in una cappa di fumi e lavare le colture con 1x PBS aggiungendo 200 l nei pozzi e 100 L negli inserti.
   3. Ripetere i lava3x, 10 min ciascuno, mentre dondolo. Quindi procedere all'immunostaining.
      NOTA: tutti i passaggi di lavaggio vengono eseguiti su un banco a RT.
2. Diluire gli anticorpi primari (anti-VE-Cadherin, anti-ERG 1/2/3) in soluzione di blocco (5% siero d'asino, 0,5% PBT). Aggiungete 300 l di soluzione anticorpale primaria (200 L nei pozze inferiori e 100 L negli inserti). Incubano colture negli anticorpi primari durante la notte a 4 gradi centigradi mentre dondolano.
   NOTA: Anti-VE-Cadherin viene utilizzato per etichettare la membrana cellulare endoteliale e anti-ERG 1/2/3 viene utilizzato per etichettare il nucleo delle cellule endoteliali al fine di visualizzare i germogli angiogenici delle cellule endoteliali.
3. Il giorno successivo, lavare e scuotere le piastre di coltura 10x in 0.5% PBT, cambiando PBT ogni 10 min.
4. Diluire gli anticorpi secondari (anti-ratto anti-ratto Alexa Fluor 488 e anti-coniglio anti-asino Alexa Fluor 555) in soluzione di blocco. Aggiungere 300 l dell'anticorpo secondario come al punto 8.2 e incubare le colture durante la notte a 4 gradi centigradi mentre dondola. Il giorno successivo, lavare gli anticorpi secondari 10x in PBT, cambiando PBT ogni 10 min.
   NOTA: Lavare un minimo di 10x ma più lavaggi sono migliori. Una volta completati i lavamenti, le colture possono essere conservate con 1x PBS fino a quando non vengono montate su scivoli.

9. Montaggio delle colture su diapositive, imaging e analisi

NOTA: Prima di iniziare, assicurarsi di avere le seguenti attrezzature e reagenti: pinze sottili, scivoli, supporto di montaggio con 4-6-diamidino-2-fenilondole (DAPI), coprilabbra e microscopio confocale. Dopo la colorazione dell'anticorpo secondario, montare le colture sui vetrini per l'imaging utilizzando i seguenti passaggi.

1. Sbucciare attentamente la membrana dall'inserto con pinze sottili e trasferirla sui vetrini mettendo il lato della membrana verso il basso e posizionando le colture espiante verso l'alto. Inserire i campioni di replica nelle stesse diapositive ed etichettare le diapositive come controllo o VEGF-A. Aggiungere alcune gocce di supporto di montaggio con DAPI direttamente sulla membrana e coprire i vetrini con gli scivoli di copertura.
   NOTA: Assicurarsi di evitare le bolle d'aria durante il posizionamento dei coperchi.
2. Sigillare i bordi dei vetrini con smalto trasparente e lasciare asciugare.
   NOTA: Le diapositive possono essere conservate in -20 gradi centigradi per l'archiviazione a lungo termine.
3. Diapositive di immagini con un microscopio confocale.
4. Eseguire analisi per misurare la lunghezza della escrescenza angiogenica. Quantificare la lunghezza della crescita angiogenica misurando la distanza delle cellule endoteliali (Ve-Cadherin,ERG 1/2/3) estesa dal limite interno delle cellule ERG 1/2/3 nelle colture ventricole e dal centro degli espiatori SV nelle colture SV.
   1. Per eseguire la quantificazione utilizzando FIJI/ImageJ, scaricare prima il software FIJI.
   2. Aprire i file di immagine in FIJI: andare su File Proprietà Open . Proprietà Folder . Proprietà Filename . Aperto.
   3. Vai a Analizzare Impostare le misure Selezionare Perimetro.
   4. Selezionare lo strumento Linea retta dalla finestra principale.
   5. Disegnare una linea sulla lunghezza di un germoglio come suggerito nel passaggio 9.4.
   6. Vai a Analizzare Misurare.
      NOTA: le misure della lunghezza vengono visualizzate nella nuova finestra.
   7. Eseguire la quantificazione nelle immagini che rappresentano almeno tre campi di visualizzazione selezionati casualmente. Calcolare la media delle misurazioni della lunghezza del germoglio e riportarle come media e deviazione standard.

Risultati

Una delle caratteristiche più sorprendenti dell'angiogenesi SV in vivo è che segue un percorso specifico e coinvolge eventi di dedifferenziazione cellulare e ridifferenziazione che si verificano in tempi e posizioni stereotipati¹. Man mano che le cellule SV iniziali crescono sul ventricolo cardiaco, smettono di produrre marcatori venosi come COUP-TFII (Figura 7). Successivamente, i germogli coronarici prendono due percorsi di migrazi...

Discussione

Alcuni dei passaggi più critici per la crescita con successo dei vasi coronarici dai tessuti progenitivi SV ed Endo sono: 1) Identificare e isolare correttamente il tessuto SV per la coltura SV; 2) l'uso di ventricoli da embrioni di età compresa tra e11 e 11,5 per una cultura accurata degli Endo; 3) mantenere le condizioni sterili per tutto il periodo di dissezione e mantenere i tessuti freddi in ogni momento; e 4) mantenendo le espiatori attaccate alla membrana rivestita ECM per evitare che il tessuto galleggiasse nel...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 x 20 MM Tissue Culture Dish	Fisher Scientific	877222	Referred in the protocol as Petri dish
24-well plates	Fisher Scientific	08-772-51
8.0 uM PET membrane culture inserts	Millipore Sigma	MCEP24H48
Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555	Fisher Scientific	A31572	Secondary antibody
Alexa Fluor Donkey anti-rat 488	Fisher Scientific	A21206	Secondary antibody
Angled Metal Probe	Fine science tools	10088-15	Angled 45 degree, used for detecting deep plugs
Anti- ERG 1/2/3 antibody	Abcam	Ab92513	Primary antibody
Anti- VE-Cadherin antibody	Fisher Scientific	BDB550548	Primary antibody, manufacturer BD BioSciences
CO2 gas tank	Various suppliers	N/A
CO2 Incubator	Fisher Scientific	13998223	For 37 °C, 5% CO2 incubation
Dissection stereomicrosope	Leica	S9i	Leica S9i Stereomicroscope
EBM-2 basal media	Lonza	CC-3156	Endothelial cell growth basal media
ECM solution	Corning	354230	Commercially known as Matrigel
EGM-2 MV Singlequots Kit	Lonza	CC-4147	Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	SH3007003IR
FiJi	NIH	NA	Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads)
Fine Forceps	Fine science tools	11412-11	Used for embryo dissection
Fisherbrand Straight-Blade operating scissors	Fisher Scientific	13-808-4
Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X)	Fisher Scientific	SH-302-5601LR
Laminar flow tissue culture hood	Fisher Scientific	various models available
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1200	Vectashield with DAPI
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy/Fisher	50-980-494	This is available at 32%; needs to be diluted to 4%
Perforated spoon	Fine science tools	10370-18	Useful in removing embryo/tissues from a solution
Recombinant Murine VEGF-A 165	PeproTech	450-32
Standard forceps, Dumont #5	Fine science tools	11251-30
Sure-Seal Mouse/Rat chamber	Easysysteminc	EZ-1785	Euthanasia chamber