JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В пробирке модели коронарного ангиогенеза могут быть использованы для открытия клеточных и молекулярных механизмов коронарного ангиогенеза. В пробирке эксплантные культуры синусовых веносов и эндокардийных тканей демонстрируют устойчивый рост в ответ на VEGF-A и демонстрируют аналогичную схему выражения COUP-TFII, как in vivo.

Аннотация

Здесь мы описываем анализ культуры in vitro для изучения коронарного ангиогенеза. Коронарные сосуды питают сердечную мышцу и имеют клиническое значение. Дефекты в этих сосудах представляют серьезную опасность для здоровья, например, при атеросклерозе, что может привести к инфарктам миокарда и сердечной недостаточности у пациентов. Следовательно, ишемическая болезнь сердца является одной из ведущих причин смерти во всем мире. Несмотря на его клиническую важность, относительно незначительный прогресс был достигнут в том, как регенерировать поврежденные коронарные артерии. Тем не менее, в последнее время был достигнут прогресс в понимании клеточного происхождения и путей дифференциации развития коронарных судов. Появление инструментов и технологий, которые позволяют исследователям флуоресцентно маркировать клетки-прародителя, следить за их судьбой и визуализировать потомство in vivo сыграли важную роль в понимании развития коронарных сосудов. Исследования In vivo являются ценными, но имеют ограничения с точки зрения скорости, доступности и гибкости в экспериментальном дизайне. Кроме того, точные модели в пробирке коронарного ангиогенеза могут обойти эти ограничения и позволить исследователям быстро и гибко изопрашивать важные биологические вопросы. Отсутствие соответствующих систем моделей in vitro, возможно, препятствовало прогрессу в понимании клеточных и молекулярных механизмов роста коронарных сосудов. Здесь мы описываем систему культуры in vitro для выращивания коронарных сосудов из синусового веноза (SV) и эндокардия (Endo), двух тканей-прародителей, из которых возникают многие коронарные сосуды. Мы также подтвердили, что культуры точно резюмируют некоторые из известных механизмов in vivo. Например, мы показываем, что ангиогенные ростки в культуре от SV downregulate COUP-TFII выражение аналогично тому, что наблюдается in vivo. Кроме того, мы показываем, что VEGF-A, известный ангиогенный фактор in vivo, активно стимулирует ангиогенез как из Культуры СВ, так и из эндо. В совокупности мы разработали точную модель культуры in vitro для изучения коронарного ангиогенеза.

Введение

Кровеносные сосуды сердца обычно называют коронарных сосудов. Эти сосуды состоят из артерий, вен и капилляров. Во время разработки сначала устанавливаются высокоразветвленные капилляры, которые затем переделываютв коронарные артерии и вены1,2,3,4. Эти первоначальные капилляры построены из эндотелиальных клеток-прародителей, найденных в проэпикардии, синусвенных веносах (SV) и эндокардии (Эндо)тканей 1,6,7,8. SV является органом притока эмбрионального сердца и Эндо является внутренней подкладкой просвет сердца. Эндотелиальные клетки-прародители, найденные в SV и Endo, создают большинство коронарных сосуд, в то время как проэпикардий способствует относительно небольшой его части2. Процесс, при котором капиллярная сеть коронарных сосудов растет в сердце из уже существующих клеток-предшественников, называется коронарным ангиогенезом. Ишемическая болезнь сердца является одной из ведущих причин смерти во всем мире, и все же эффективного лечения этого заболевания не хватает. Понимание подробных клеточных и молекулярных механизмов коронарного ангиогенеза может быть полезно при разработке новых и эффективных методов лечения для ремонта и регенерации поврежденных коронарных артерий.

В последнее время резкое понимание того, как развиваются коронарные сосуды, частично было достигнуто за счет разработки новых инструментов и технологий. В частности, маркировка линии in vivo и передовые технологии визуализации были очень полезны при раскрытии клеточного происхождения и путей дифференциации коронарных сосудов9,10,11,12. Несмотря на преимущества этих инструментов in vivo, существуют ограничения с точки зрения скорости, гибкости и доступности. Таким образом, надежные системы моделей in vitro могут дополнять системы in vivo для выяснения клеточных и молекулярных механизмов коронарного ангиогенеза высокой пропускной способностью.

Здесь мы описываем в пробирке модель коронарного ангиогенеза. Мы разработали систему культуры эксплантирования в пробирке для выращивания коронарных сосудов из двух тканей-прародителей, SV и Endo. С помощью этой модели мы показываем, что в экстракорпоральной ткани explant культур расти коронарных ростков сосудов, когда стимулируется средой роста. Кроме того, культуры эксплантов быстро растут по сравнению с контролем, когда стимулируется сосудистым эндотелиальным фактором роста A (VEGF-A), очень мощным ангиогенным белком. Кроме того, мы обнаружили, что ангиогенные ростки из культуры SV проходят венозную дедифференицицию (потеря экспрессии COUP-TFII), механизм, похожий на SV ангиогенез in vivo1. Эти данные свидетельствуют о том, что система культуры экстракорпорального экспланта точно восстанавливает ангиогенные события, происходящие в vivo. В совокупности, в пробирке модели ангиогенеза, которые описаны здесь идеально подходят для зондирования клеточных и молекулярных механизмов коронарного ангиогенеза в высокой пропускной способностью и доступным способом.

протокол

Использование всех животных в этом протоколе следовало руководящим принципам Комитета по институциональному уходу и использованию животных (IACUC).

1. Создание мышь заводчиков и обнаружение вагинальных втыковок для приурочен беременности

  1. Настроили клетку для разведения мышей с дикими самцами и самками мышей. Убедитесь, что возраст размножения мышей составляет от 6 до 8 недель. Навязаните либо пару (1 мужчина и 1 женщина), либо в трио (1 мужчина и 2 женщины) для разведения.
  2. Проверьте вагинальный штепсельную вилку на следующее утро. Используйте угловой металлический зонд для обнаружения глубокой вилки, вставив его в вагинальное отверстие. Назначить утро положительной вагинальной вилки, чтобы быть эмбриональным днем 0.5 (e0.5).
    ПРИМЕЧАНИЕ: вагинальный штепсельная вилка может быть либо поверхностной (которая легко видна, см. Рисунок 1)или глубоко (что не легко видно). Наличие глубокой вилки будет блокировать полную вставку зонда в то время как отсутствие вилки позволит полной вставки без сопротивления.
  3. Поддерживайте приуроченную беременность до тех пор, пока эмбрионы не достигнут e11.5, при котором они будут собраны. Чтобы подтвердить беременность перед сбором эмбрионов, запишите вес самок мышей между e7.5 и e11.5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ежедневное увеличение веса матери будет означать успешную беременность, в то время как никакие изменения в весе будет означать неудавшуюся беременность.

2. Сбор эмбрионов у беременных мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом, убедитесь, что следующее оборудование и реагенты: CO2 эвтаназии камеры, 70% этанола, бумажные полотенца, регулярные щипцы, тонкие щипцы, ножницы, 1x стерильный фосфат буферный солен (PBS), 10 см стерильных блюд Петри, контейнер со льдом, перфорированная ложка, дефиле стереомикроскоп.

  1. Поместите e11.5 беременной мыши в чистой камере эвтаназии CO2, чтобы пожертвовать ею. Закройте крышку камеры, чтобы мышь не сбегала.
  2. После того, как мышь закреплена в камере эвтаназии, включите CO2. Убедитесь в том, чтобы регулировать скорость потока CO2 на рекомендации IACUC (т.е. 10-30% перемещения в минуту). После того, как мышь полностью усыпщена, выполните вывих шейки матки, чтобы обеспечить смерть.
  3. Спрей мыши с 70% этанола. Поднимите кожу над животом с помощью щипков, сделать небольшой разрез с помощью ножниц и расширить разрез боковой. Увеличить разрез перед диафрагмой и подвергать маточный рог, содержащий эмбрионы(рисунок 2).
  4. Вытяните строку эмбрионов (маточный рог и эмбрионы), схватив матку и разрезая его бесплатно. Поместите строку эмбрионов в ледяной стерильной 1x PBS.
  5. Рассекать отдельные эмбрионы из рога матки, отслаивая мышцы матки, желток и амнион один за одним(Рисунок 3A-F) под стереомикроскопом. Перенесите очищенные эмбрионы перфорированной ложкой в чашку Петри, содержащую стерильные 1x PBS на льду. Убедитесь в том, чтобы сохранить эмбрионы холодными.

3. Изолирование сердец от e11.5 Эмбрионы

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом, убедитесь, что иметь следующее оборудование и реагенты: регулярные щипцы, тонкие щипцы, 1x стерильные PBS, 10 см стерильной чашкой Петри, 6 см стерильной чашкой Петри, контейнер со льдом, перфорированная ложка, рассечение стереомикроскопкопа.

  1. Настройка нового блюда Петри с ледяной стерильной 1x PBS под стереомикроскоп. Перенесите эмбрион со ступени 2.5 в чашку Петри, чтобы вскрыть сердце.
  2. Удалить голову эмбриона с помощью щипц. Во-первых, сожмите голову между щипками одной рукой, а затем снимите голову, соскребая ее с другой стороны, используя закрытые щипц(рисунок 4A-C).
  3. После удаления головы, сориентировать эмбрион с его брюшной стороной вверх, держа эмбрион с щипками на животе с одной стороны (Рисунок 4D).
  4. С другой стороны, открыть грудную стенку эмбриона, сначала сделав небольшой разрез в груди немного выше диафрагмы с помощью тонких щипц. Затем, увеличить разрез очень осторожно, вставив закрытые щипцы и разрывая грудную стенку, открывщив щипцы. Убедитесь в том, чтобы не тяги слишком глубоко, которые могут повредить сердце. С помощью щипцы, держать грудную стенку широко открытыми, чтобы разоблачить сердце и легкие в грудной полости(Рисунок 4E).
  5. Используя тонкие щипцы, осторожно двигайте сердце перед (90 ") и разоблачить дорсальную аорту/вену. Вытяните сердце / легкие передним путем захвата дорсальной аорты / вены у основания сердца (Рисунок 4F-H).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте нежны, вытаскивая сердце / легкие, чтобы избежать разрыва SV, который находится на стороне доза.
  6. Промыть сердце / легкие с холодной 1x PBS для удаления клеток крови.
  7. Повторите шаги 3.1-3.6 для удаления сердца/легких из оставшихся эмбрионов. Убедитесь в том, чтобы держать изолированное сердце / легкие на льду.

4. Изолирование SVs и ventricles от e11.5 Эмбриональные сердца мыши

  1. Поместите чашку Петри с сердцем / легкие от шага 3.7 под стереомикроскоп, чтобы изолировать SVs и целые желудочки. Очистите прикрепленные доли легких один за 1 от их корня с помощью тонких щипцы.
  2. Оснаните сердце на его стороне доза и удалите предсердие и прилегающую ткань, которая окружает SV переднюю, не разрывая SV. Удалите левую и правую притязания из сердца, держа на своей базе и соскабливая его с помощью тонких щипц(рисунок 5B). Удалите прилегающую ткань, окружающую СВ, используя аналогичную технику(рисунок 5C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что правое предсердие прилагается к SV, так что будьте осторожны, чтобы только удалить предсердие.
  3. Чтобы изолировать SV, сначала сориентируйте сердце с его содовой стороной вверх (потому что SV находится на стороне дорастиченного) и держите сердце все еще в этом положении, мягко держа сердце в желудочках с щиптом с щипцыми.
    ПРИМЕЧАНИЕ: SV является органом притока эмбрионального сердца, который находится между притязаниями на донской стороне сердца.
  4. Удалите SV, тщательно снимая его с сердца, где он прилагается или удерживая SV у основания его вложения с тонкими щипками и соскабливания его с закрытыми щипками(Рисунок 5D, E).
  5. Перенесите изолированный SV в новую 6-сантиметровую чашку Петри с ледяной стерильной 1x PBS на льду с помощью стерильной передачи пипетки и обозначьте блюдо Петри как SV.
  6. Чтобы изолировать целые желудочки, удалите отток тракта (аорты и легочного ствола) из сердца после удаления СВ(рисунок 5F,G).
  7. Перенесите все желудочки в новую 6-сантиметровую чашку Петри, содержащую стерильные 1x PBS на льду с помощью стерильной передаваемых пипетки и обозначьте блюдо Петри как желудочки. Держите изолированные SV и желудочки на льду.
  8. Повторите шаги 4.1-4.7 для изоляции SVs и желудочков от оставшихся сердец.

5. Установка пластин культуры тканей с вставками и внеклеточным матричным покрытием

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом, убедитесь, что иметь следующее оборудование и реагенты: коммерческие внеклеточные матричные решения (ECM; например, Matrigel), 8,0 м м полиэтилен терефталат (ПЭТ) культуры вставок, 24 хорошо пластины, 37 КК, 5% CO2 инкубатора.

  1. Пусть решение ECM оттаивает на льду. Держите решение ECM на льду, чтобы избежать затвердевания.
  2. Поместите ПЭТ мембраны культуры вставки (пор размерю 8,0 мкм, область фильтрации 0,3 см2, диаметр фильтра 6,5 мм) в колодцы не-ткани культуры обработаны 24 хорошо пластин. Пометьте пластины как SV или желудочки для SV или эндокардиальный ангиогенез анализы, соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка вставки в отдельные пластины для SV и желудочков при выполнении обеих культур одновременно. Убедитесь в том, чтобы создать достаточное количество скважин для всех экспериментальных образцов и элементов управления.
  3. После того, как раствор ECM размораживаются, немедленно разбавить ECM 1:2 в предварительно охлажденной базальной среде (т.е. базальной среде EBM-2, см. Таблица материалов)до достаточного объема (100 л/вставить х количество вставок).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если есть шесть вставок, то общий объем будет 100 л х 6 600 л. Добавить 200 л ECM в 400 л базальной среды.
  4. Пальто вставки с 100 л свежеразбавленного ECM, добавив его непосредственно на верхней части мембраны. Инкубировать пластину при 37 градусах По Цельсию в течение по крайней мере 30 минут, чтобы позволить ECM затвердеть.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть выполнено под ламинаром ткани потока ткани капюшон, чтобы избежать загрязнения.

6. SVs и целые культуры ventricles

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом, убедитесь, что иметь следующее оборудование и реагенты: 70% этанола, передачи пипетки, стереомикроскоп, щипцы, ламинар ткани ткани ткани капюшон, микрососудистые эндотелиальные клетки дополнение комплекта (Таблица материалов), базальная среда, 1x стерильные PBS). На рисунке 6 показан рабочий процесс культуры SV и желудочков.

  1. Оттепель из содержимого дополнения комплект на льду. Подготовка полной среде, добавив все содержимое комплекта дополнения в 500 мл базальной среде под сертифицированным ламинаром ткани ткани капота. Смешайте средний хорошо и распространять в 50 мл aliquots.
  2. Стерилизовать основание стереомикроскопа и прилегающую рабочую зону с помощью 70% этанола.
  3. Получить пластины культуры ткани от шага 5.4. С помощью переноса пипетки, тщательно переложить экстенсы со ступени 4.7 на верхней части вставки мембраны. Под стереомикроскопом и с помощью чистых щипцы, положение explants в центре вставки, чтобы они не застряли в углу вставки или прилагается к боковых стен.
  4. После того, как экспланты помещаются и по центру на вставках, тщательно удалите любые дополнительные PBS из вставок и закройте крышки пластин.
  5. Под ламинаром ткани потока ткани капота, добавить 100 злител до конца среды на верхней части вставок и 200 Зл в колодцы для культуры explants на воздушно-жидком интерфейсе так, что базальная поверхность вставки находится в контакте со средой , но верхняя поверхность подвергается воздействию воздуха.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы настроить громкость для получения воздухожидкого интерфейса при использовании различных размеров вставки / хорошо пластин.
  6. Добавьте 300 л PBS в неиспользованные скважины 24 скважины и накройте крышкой. Инкубировать пластину в 37 градусов По Цельсию, 5% CO2 инкубатор, и расти культур в течение 5 дней.
  7. В последующие дни, регулярно наблюдать культур под перевернутым световым микроскопом для оценки состояния explant культур. Убедитесь, что explants экспонат сократительных избиения и что все explants прикреплены к нижней части мембраны встроенных с ECM. Принять к сведению любые плавающие explants.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Периодическое сокращение explants указывает, что они живы. Плавающие экспланты должны быть исключены из анализа.
  8. После оценки культурного статуса, положить культурную плиту обратно в инкубатор и продолжать расти культуры до 5 дней.

7. Лечение культур с помощью VEGF-A (Позитивный контроль)

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом, убедитесь, что есть следующее оборудование и реагенты: ламинарный поток ткани культуры капот, 1x PBS, базальная среда no 1% сыворотки крупного рогатого скота (FBS), базальная среда - VEGF-A, пипетки, и пипетки советы.

  1. Подготовьте базальную среду 1% FBS и базальную среду - VEGF-A.
    1. Для подготовки базальной среды 1% FBS, сначала определить количество контрольных скважин, необходимых. Например, если есть три контрольные скважины, то 300 Л/уэлл х 3 х 900 Л - это общий объем, необходимый. Добавьте 9 л FBS в 891 Л базальной среды, чтобы сделать базальную среду 1% FBS.
    2. Для подготовки базального среднего - VEGF-A сначала определите общее количество скважин, нуждающихся в среде VEGF-A. Если есть три скважины, то 300 Л/хорошо х 3 х 900 л - это общий объем и 50 нг/хорошо х 3 и 150 нг VEGF-A. Добавьте 150 нг VEGF-A в 900 л базальной среды, чтобы сделать базальную среду veGF-A.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите это решение в большем объеме, чем рассчитано, чтобы застраховать достаточное количество меньших aliquots для каждого эксперимента.
  2. На второй день удалите носители из обеих камер (вставки и колодцы). Вымойте культуры с 300 зл 1x PBS, добавив 100 зл. Твердо закружить пластины несколько раз и удалить PBS.
  3. Добавьте 300 л базальной среды и 1% FBS (100 л в вставку и 200 л в скважины), чтобы голодать культур в течение 24 ч.
  4. На 3-й день, после голодания, добавляйте 300 л базальной среды и 1% FBS (100 л в вставку и 200 л в скважины) в контрольные скважины и базальную среду - VEGF-A (50 нг/хорошо) в очистные скважины, соответственно.
  5. После лечения продолжайте выращивать культуры в инкубаторе.

8. Фиксация и иммуностоирование

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом, убедитесь, что следующее оборудование и реагенты: 4% параформальдегид (PFA), 1x PBS, первичные и вторичные антитела, шейкер, 0,5% неионический сурфактант в PBS (PBT).

  1. На шестой день культивирования, удалить средних и мыть культур ы с 1x PBS при комнатной температуре (RT).
    1. Исправьте культуры, добавив 200 qL 4% раствора PFA в скважины и 100 qL в вставки. Исправьте культуры в 4 кК в течение 20 минут во время качания.
    2. После 20 мин фиксации, удалить PFA из культур в дым капота и мыть культуры с 1x PBS, добавив 200 кЛ в колодцы и 100 кл в вставки.
    3. Повторите моет 3x, 10 минут каждый, в то время как качалки. Затем приступайте к проведению иммунодефицита.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги мыть выполняются на скамейке на RT.
  2. Разбавить первичные антитела (анти-VE-Cadherin, анти-ERG 1/2/3) в блокирующем растворе (5% сыворотки осла, 0,5% ПБТ). Добавьте 300 л первичного раствора антитела (200 л в нижних колодцах и 100 л в вставки). Инкубировать культуры в первичных антител ночь на 4 градуса по Цельсию во время качания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анти-VE-Cadherin используется для обозначения эндотелиальной клеточной мембраны и анти-ERG 1/2/3 используется для обозначения эндотелиальных ядер клеток для того, чтобы визуализировать ангиогенные ростки эндотелиальных клеток.
  3. На следующий день, мыть и рок культуры пластин 10x в 0,5% PBT, изменение PBT каждые 10 минут.
  4. Разбавить вторичные антитела (осел анти-крыса Alexa Fluor 488 и осла анти-кролик Alexa Fluor 555) в блокирующем растворе. Добавьте 300 qL вторичных антител, как в шаге 8.2 и инкубировать культуры на ночь при 4 градусах Цельсия во время качания. На следующий день, мыть вторичные антитела 10x в ПБТ, изменение ПБТ каждые 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вымойте минимум 10 x, но больше моет лучше. После того, как мойки завершены, культуры могут храниться с 1x PBS, пока они не установлены на слайды.

9. Монтаж культур на слайды, изображения и анализа

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом, убедитесь, что иметь следующее оборудование и реагенты: тонкие щипцы, слайды, монтаж среды с 4 ",6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), крышки, и конфокальный микроскоп. После вторичного окрашивания антител, смонтировать культуры на слайды для визуализации, используя следующие шаги.

  1. Очистите от мембраны тщательно от вставки с помощью тонких щипцы и передать его на слайды, поставив мембраны стороны вниз и размещения explant культур вверх. Поместите образцы репликации в те же слайды и пометьте слайды как контроль или VEGF-A. Добавьте несколько капель монтажной среды с DAPI непосредственно на мембрану и накройте слайды крышкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы избежать пузырьков воздуха при размещении крышки.
  2. Уплотнение края слайдов с четким лаком для ногтей и дайте высохнуть.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды могут храниться в -20 градусов по Цельсию для длительного хранения.
  3. Слайды изображения с помощью конфокального микроскопа.
  4. Выполните анализ для измерения длины ангиогенных наростов. Количественное огениогенное увеличение длины роста путем измерения расстояния эндотелиальных клеток (Ve-Cadherin/ERG 1/2/3") простирается от внутренней границы ERG 1/2/3 "клеток в желудочка холестерол культур и из центра С. explants в SV культур.
    1. Для выполнения количественной оценки с помощью FIJI/ImageJ, сначала скачать программное обеспечение FIJI.
    2. Откройте файлы изображений в FIJI: перейдите в файл Открыто (ru) Фолдер Файлимя Открыто.
    3. Перейти к анализу Набор измерений Выберите периметр.
    4. Выберите инструмент «Прямая линия» из основного окна.
    5. Нарисуйте линию по всей длине ростка, как это предлагается в шаге 9.4.
    6. Перейти к анализу Мера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения длины отображаются в новом окне.
    7. Выполните количественную оценку в изображениях, которые представляют по крайней мере три случайно выбранных поля зрения. Усреднете измерения длины ростка и сообщите о них как о среднем и стандартном отклонении.

Результаты

Одна из самых ярких особенностей SV ангиогенез in vivo является то, что она следует определенным образом и включает в себя ячейки обезличения и реразличения событий, которые происходят в стереотипные времена и позиции1. По мере того как начальные клетки SV раст...

Обсуждение

Некоторые из наиболее важных шагов для успешного выращивания коронарных сосудов из тканей SV и Endo-прародителя: 1) Правильное выявление и изоляция ткани СВ для культуры СВ; 2) использование желудочков эмбрионов в возрасте от e11-11.5 для точной культуры эндо; 3) поддержание стерильных состояни...

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Благодарности

Авторы благодарят сотрудников лаборатории Шарма за создание благоприятной исследовательской среды. Мы хотели бы выразить особое спасибо Диане (Ди) Р. Хоффман, который поддерживает и заботится о нашей колонии мыши. Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Филипа Смальдино и Каролин Ванн за тщательное коррективо рукописи и предоставление полезных комментариев. Эта работа была поддержана за счет средств из Балла государственный университет проректор управления и кафедры биологии в B.S., Индиана Академия наук старший научно-исследовательский грант средств B.S, и NIH (RO1-HL128503) и Нью-йоркской стволовой клетки Фонд средств К.Р.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
100 x 20 MM Tissue Culture DishFisher Scientific877222Referred in the protocol as Petri dish
24-well platesFisher Scientific08-772-51
8.0 uM PET membrane culture insertsMillipore SigmaMCEP24H48
Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555Fisher ScientificA31572Secondary antibody
Alexa Fluor Donkey anti-rat 488Fisher ScientificA21206Secondary antibody
Angled Metal ProbeFine science tools10088-15Angled 45 degree, used for detecting deep plugs
Anti- ERG 1/2/3 antibodyAbcamAb92513Primary antibody
Anti- VE-Cadherin antibodyFisher ScientificBDB550548Primary antibody, manufacturer BD BioSciences
CO2 gas tankVarious suppliersN/A
CO2 IncubatorFisher Scientific13998223For 37 °C, 5% CO2 incubation
Dissection stereomicrosopeLeicaS9iLeica S9i Stereomicroscope
EBM-2 basal mediaLonzaCC-3156Endothelial cell growth basal media
ECM solutionCorning354230Commercially known as Matrigel
EGM-2 MV Singlequots KitLonzaCC-4147Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media
Fetal Bovine Serum (FBS)Fisher ScientificSH3007003IR
FiJiNIHNAImage processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads)
Fine ForcepsFine science tools11412-11Used for embryo dissection
Fisherbrand Straight-Blade operating scissorsFisher Scientific13-808-4
Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X)Fisher ScientificSH-302-5601LR
Laminar flow tissue culture hoodFisher Scientificvarious models available
Mounting MediumVector LaboratoriesH-1200Vectashield with DAPI
Paraformaldehyde (PFA)Electron Microscopy/Fisher50-980-494This is available at 32%; needs to be diluted to 4%
Perforated spoonFine science tools10370-18Useful in removing embryo/tissues from a solution
Recombinant Murine VEGF-A 165PeproTech450-32
Standard forceps, Dumont #5Fine science tools11251-30
Sure-Seal Mouse/Rat chamberEasysystemincEZ-1785Euthanasia chamber

Ссылки

  1. Red-Horse, K., et al. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
  2. Chen, H. I., et al. The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis. Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).
  3. Volz, K. S., et al. Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle. Elife. 4, (2015).
  4. Chen, H. I., et al. VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development. Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4899-4914 (2014).
  5. Chang, A. H., et al. DACH1 stimulates shear stress-guided endothelial cell migration and coronary artery growth through the CXCL12-CXCR4 signaling axis. Genes and Development. , (2017).
  6. Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).
  7. Wu, B., et al. Endocardial Cells Form the Coronary Arteries by Angiogenesis through Myocardial-Endocardial VEGF Signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
  8. Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Developmental Cell. 22 (3), 639-650 (2012).
  9. Das, S., Red-Horse, K. Cellular plasticity in cardiovascular development and disease. Developmental Dynamics. 246 (4), 328-335 (2017).
  10. Sharma, B., Chang, A., Red-Horse, K. Coronary Artery Development: Progenitor Cells and Differentiation Pathways. Annual Review of Physiology. 79, 1-19 (2017).
  11. Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis. Circulation Research. 116 (3), 515-530 (2015).
  12. Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
  13. Gerhardt, H., et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. Journal of Cell Biology. 161 (6), 1163-1177 (2003).
  14. Ruhrberg, C., et al. Spatially restricted patterning cues provided by heparin-binding VEGF-A control blood vessel branching morphogenesis. Genes and Development. 16 (20), 2684-2698 (2002).
  15. Kikuchi, R., et al. An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease. Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2002).
  16. Folkman, J., et al. Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis. Journal of Experimental Medicine. 133 (2), 275-288 (1971).
  17. Ferrara, N. The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis. Experientia Supplementum. (94), 209-231 (2005).
  18. Ferrara, N., Bunting, S. Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 5 (1), 35-44 (1996).
  19. Sharma, B., et al. Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts. Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).
  20. Rhee, S., et al. Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease. Nature Communications. 9 (1), 368 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

157SVex vivoin vitro

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены