JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כדי לזהות והרגולטורים הרומן של גורמי שעתוק, פיתחנו גישה למסך מסודר או לספריות RNAi ויראלי באמצעות שימוש כפול-לוציפראז מבוסס מבוססת הכתב. גישה זו מציעה דרך מהירה וזולה יחסית להקרין מאות מועמדים בניסוי אחד.

Abstract

גורמים שעתוק יכול לשנות את הביטוי של גנים היעד רבים המשפיעים על מגוון של תהליכים במורד הופך אותם מטרות טובות נגד סרטן טיפולים. עם זאת, מיקוד ישירות גורמי שעתוק הוא לעתים קרובות קשה יכול לגרום לתופעות לוואי שליליות אם גורם שעתוק הוא הכרחי ברקמות אחת או יותר מבוגר. זיהוי במעלה והרגולטורים כי באופן מיוחד להפעיל את גורמי התמלול בתאים סרטניים מציע חלופה אפשרית יותר, במיוחד אם אלה חלבונים הם קלים לתרופה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שניתן להשתמש בו כדי לשלב ספריות ויראליות בקנה מידה בינוני ומבוסס כפול-לluciferase מבוססי הכתב לזהות הרגולטורים הרומן של גורמי שעתוק בתאים סרטניים. הגישה שלנו מציעה דרך מהירה, קלה וזולה לבחון מאות גנים בניסוי אחד. כדי להדגים את השימוש בגישה זו, ביצעת מסך של ספריית RNAi ויראלי מסודר המכיל מספר הרגולטורים של חלבון הקשורים כן (לצ) ו transcript co-activator עם מוטיב PDZ-כריכה (TAZ), שני ההמרה שיתוף מפעילי כי הם הזרם המורד של מסלול היפו. עם זאת, גישה זו יכול להיות שונה למסך עבור הרגולטורים של כמעט כל גורם שעתוק או שיתוף פקטור והוא יכול לשמש גם למסך CRISPR/CAS9, cDNA, או ORF ספריות.

Introduction

מטרת השיטה היא להשתמש בספריות ויראליות לזיהוי הרגולטורים של גורמי שעתוק בצורה מהירה וזולה יחסית. הפעילות החריגה מזוהה עם סרטן גרורות1,2,3,4,5,6, כך המיקוד גורמים שעתוק בתאים סרטניים היא גישה טיפולית מבטיחה. עם זאת, גורמים שעתוק הם לעתים קרובות קשה למקד את היעד של השימוש ב-פרמקואובולוגית7 ורבים נדרשים עבור פונקציה סלולרית נורמלית ברקמות למבוגרים8,9,10. מיקוד המסלולים הקשורים לסרטן, כי בדרך מאוד להפעיל גורמי תמלול כדי לנהוג במחלה היא גישה אפשרית יותר עם פוטנציאל יש תופעות לוואי חמורות פחות. הזמינות המסחרית של מערך מסודר ונגיפי RNAi, CRISPR/CAS9, cDNA, או ORF ספריות מאפשר לחוקרים לבדוק את החשיבות של גנים רבים בניסוי אחד. עם זאת, נדרש בדיקה אמינה לפעילות הטרנסדפורמציה ששונתה.

כאן, אנו מתארים את השימוש בשיטת הכתב המבוסס על כפול-לוציפראזה ובספריות מבוססות-ויראליות כדי לזהות חלבונים המסדירים את גורמי התמלול בתאי הסרטן. בתוך מעשה זה, משרין כי היעד הקשורים לסרטן הגנים מועברים לתאי סרטן היונקים באמצעות התמרה ויראלי תאים נבחרים עבור אינטגרציה יציבה באמצעות puromycin. התאים הם הטרנסג הבאה עם מבנה עיתונאי המבטא גחלילית לוציפראז מונע על ידי יזם ספציפי לגורם שעתוק כי הוא נחקר מבנה שליטה המבטא Renilla לוציפראז מיזם פעיל באופן מכונן שאינו מגיב לגורם שעתוק נחקר. אנו מדגימים גישה זו עם מסך הוכחה של קונספט עבור הרגולטורים של לנבוח ו TAZ, המטה הקריטי העריקים של מסלול היפו8,10,11. פעילות חריגה של לנבוח ו TAZ מקדמת מספר שלבים של אשד גרורתי11 והוא נצפה בסרטן רבים11,12,13. עם זאת, כיצד להפוך את באופן מאוד מתאים ל-, מפעיל בתאי סרטן לא מובנים עדיין. במקום זאת, לא לקשור את ה-DNA, אלא מגויס ליזמים על ידי שעתוק אחרים. חברים בתחום התה (TEAD) המשפחה של גורמי שעתוק הם שותפי האיגוד העיקריים ל-לנבוח ו-TAZ, והם קריטיים עבור רוב הפונקציות מתלוות ו TAZ. העיתונאי שלנו לבנות מביע מבטא גחלילית לוציפראז מתוך מיזם לנבוח/TAZ-tead תגובה ומחקרים קודמים הפגינו כי הוא בנאמנות מזהה שינויים ב-2לנבוח-tead ו TAZ-tead פעילותמעבר 2,14,15.

הגישה שלנו היא מהירה, תפוקה בינונית, ואינו דורש מתקני הקרנה, רובוטים אוטומטיים או רצף עמוק של ספריות במאגר. העלויות נמוכות יחסית וקיימות ספריות מסחריות זמינות רבות לבחירה. הציוד הנדרש והריאגנטים הינם גם סטנדרטיים יחסית ברוב המעבדות. זה יכול לשמש למסך עבור הרגולטורים כמעט כל גורם שעתוק אם העיתונאי מבוסס לוציפראז קיים או נוצר. אנו משתמשים בגישה זו כדי להקרין מרין בתאים סרטניים, אבל כל קו תא שניתן לשנות עם יעילות סבירה יכול לשמש עם כל סוג של ספריית מסודר.

Protocol

הערה: סיכום סכמטי של פרוטוקול זה מוצג באיור 1.

1. הכנה לספרייה וקטורית לגבי הנגיף

הערה: המסך הפגינו השתמשו בספריית מסודר שניתן לרכוש כמלאי גליצרול ב-96-צלחות, אך ניתן גם להרכיב ספריות באופן ידני על פי רשימת מועמדים. יש לשקול ולכלול פקדים מתאימים בספריה כלשהי. זה כולל שליטה ללא המיקוד מרין (shNTC), מרין שליטה מיקוד הגורם שעתוק נחקר, ואם אפשר, שרין מיקוד גחלילית לluciferase.

  1. הוסף 1.3 מ ל לוריא ציר (ליברות) (1% bacto-טריקטון, 0.5% שמרים לחלץ, 1% הנאגל, pH 7.5) המכיל 100 באמפיצילין μg/mL של הטוב ביותר של לוחית היטב של 96. מחסן כל טוב עם 2 μL של מלאי גליצרול וגדלים ב 37 ° c לילה עם עצבנות מתמדת ב 225 סל ד.
  2. להעביר את כל התרבות החיידקית לתוך שפופרת צנטריפוגה 1.5 mL ו הגלולה החיידקים על ידי צנטריפוגה ב 21,000 x g ב 4 ° c עבור 10 דקות.
  3. לטהר כל וקטור באמצעות ערכת הכנה מיני חיידקי על ידי ביצוע הפרוטוקול של היצרן.
  4. לקבוע את הריכוז של כל וקטור באמצעות ספקטרוסקופיה.
  5. אחסן את הפלמידים ב-20 ° c.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

2. אריזות של הספרייה המתקדמת

הערה: כל העבודה הכוללת וירוס, כולל אריזה, זיהום, ו culturing הבאים של תאים נגועים צריך בהחלט לעקוב אחר כללי ותקנות אבטחה טיחות מוסדיים.

  1. הרחב את התאים 293FT באמצעות מדיה צמיחה מלאה (מדיום שונה של מאוד הנשר (DMEM) המכיל 4 מ"מ L-גלוטמין, 4,500 mg/L גלוקוז ו-נתרן פירובט, שיושלם עם 10% סרום שור עוברי (FBS), 100 יחידות/mL של פניצילין, 100 μg/mL סטרפטומיצין ו-2 מ"מ L-גלוטמין
  2. עבור כל וקטור בספרייה משלב 1.4, הזרע 1 24-ובכן עם 1 x 105 293ft תאים.
    הערה: מומלץ כי כמה בארות נוספות של שליטה וקטור ויראלי להיות ארוזים ומשמש כדי לבדוק את סיכוייו של הווירוס לפני שתמשיך לשלב 3 (ראה להלן).
  3. מודיית את התאים ב 37 ° צ' עם 5% CO2 עבור 24 שעות.
    הערה: פרוטוקול כללי לאריזת וירוס שתואר בעבר14 הוקטן ל-24 בארות עבור פרוטוקול זה. הוא משתמש ב-psPAX2 עבור אריזות ויראליות ו-VSVG כחלבון מעיל. אם וירוס ectropic רצוי, וקטור מספק Eco ניתן להשתמש במקום VSVG. מומלץ מאוד כי פרוטוקול זה ממוטב כדי להשיג סיכוייו נגיפי המעניקה בין 30%-70% יעילות הזיהום של תאי היעד (ראה דיון). ראה טבלה משלימה 1 עבור רשימה של כל הווקטורים הנמצאים בשימוש.
  4. הגדר תערובת העברה לכל וקטור ויראלי משלב 1.4 כמתואר להלן. כל מעבר צריך להכיל 250 ng של וקטור ויראלי, 125 ng של psPAX2, 125 ng של VSVG, 1.25 μL של העברה מגיב 1, ו-23.75 μL של מאגר החצייה (ראה טבלת חומרים).
    1. לדלל כל וקטור לויראלי כדי 50 ng/μL עם nuclease-מים ללא תשלום, ולאחר מכן להעביר 5 μL (250 ng) לתוך באר של הצלחת 96-טוב PCR.
    2. הפוך את התערובת סופר לערבב על ידי ערבוב 1.25 μL * X של מגיב העברה 1 ו 23.75 μL * X של מאגר טרום-הזיהום מראש שבו "X" הוא המספר הכולל של העברה בתוספת מספר נוסף לחשבון אובדן העוצמה במהלך pipetting.
    3. משלב את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
    4. הוסף 125 ng * X של psPAX2 ו 125 ng * X של VSVG לתוך הצינורית של שילוב סופר לערבב משלב 2.4.3 ובעדינות pipet למעלה ולמטה כדי לערבב. . המשך במהירות לשלב 2.4.5
    5. מיד סדרת מחלקים את התערובת משלב 2.4.4 לתוך כל שפופרת של רצועת ה-PCR, ולאחר מכן להשתמש בצינורות מרובת ערוצים כדי להעביר 25 μl את התערובת לתוך כל היטב המכיל וקטור ויראלי משלב 2.4.1.
    6. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 20 דקות.
    7. העברת כל 30 μLs מכל 96-ובכן מ Step 2.4.6 לתוך באר של 24-גם המכיל 293 תאים FT משלב 2.3.
  5. מודקת את התאים ב 37 ° צ' עם 5% CO2 עבור 24 שעות ולאחר מכן להחליף את המדיה בכל באר של הצלחת 24-באר עם 500 μl של מדיה הצמיחה השלמה טריים. מודטה את התאים ב 37 ° צ' עם 5% CO2 עבור עוד 24 h.
  6. באמצעות הצינורות מרובת הערוצים, לאסוף את supernatant ויראלי מן היטב סדרת מחלקים 220 μl (מספיק עבור 1 זיהום בשלב 3 ועוד כמה נפח נוסף) לתוך 2 96-בארות כל אחד. אלו לוחיות הזיהוי. הנגיפי המגולפות
  7. אחסן את לוחיות הזיהוי הנגיפי הנבחנות ב-80 ° c.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. מומלץ גם לבדוק כמה וירוס בקרת נוסף שנארז (ראה לעיל) על התאים להידבק לפני שתמשיך שלב 3. זה כדי להבטיח כי סיכוייו מספיק כדי להשיג לפחות 30% יעילות הזיהום.

3. זיהום התאים למסך

הערה: תאים מלנומה האדם (A375) שימשו כדי להפגין גישה זו, אבל שיטה זו יכולה להיות מוחלת על כל התאים חסיד להדביק עם הנגיף. עם זאת, יש למטב את תנאי התרבות והציפוי של התאים עבור כל קו תא (ראה דיון).

  1. הרחב את התאים שיהיו נגועים במדיית גדילה מלאה.
  2. זרעים 24-צלחות עם 1 x 105 תאים ב 0.5 מ ל של מדיה צמיחה מלאה לכל טוב. זרע אחד טוב עבור כל וקטור ויראלי להיבדק (כולל פקדים) וכוללים גם היטב כי לא יהיה נגוע אשר ישמש כפקד עבור בחירת סמים בשלב 3.7.
  3. מודיית את התאים ב 37 ° צ' עם 5% CO2 עבור 24 שעות.
  4. להדביק כל באר משלב 3.2 עם supernatant ויראלי שונים מן הסופר הקפוא המכונה supernatant כדלקמן.
    1. להכין מדיה צמיחה מלאה המכילה 20 μg/mL polybrene.
    2. הפשרת הספרייה המתקדמת של הספריה משלב 2.7 לטמפרטורת החדר.
    3. מנושף את מדיית הגדילה מן הצלחות 24-היטב משלב 3.2 ומיד להוסיף 200 μL של polybrene-המכיל מדיית גדילה לכל טוב.
    4. באמצעות הצינורות מרובת ערוצים, להעביר 200 μL של supernatant ויראלי מכל אחד 96-ובכן מ Step 3.4.2 אל 24 בארות משלב 3.4.3.
  5. מודיית את התאים ב 37 ° צ' עם 5% CO2 עבור 24-48 h.
    הערה: קווי תא מסוימים עשויים לדרוש יותר מ -24 שעות כדי לבטא את מספר הpuromycin ולהפוך לעמידים. וקטור ויראלי משמש כאן מספק טורבו-GFP-IRES-puroR עם מmiR30 מבוסס מרין ב 3 ' UTR של puroR (איור 1). היעילות הזיהום והביטוי של הגן ההתנגדות הpuromycin והמרין מנוטרים על ידי חלבון פלורסנט ירוק.
  6. הכינו מדיית גדילה מלאה המכילה 2.5 μg/mL puromycin.
    הערה: ריכוז הבחירה של puromycin משתנה בין קווי התאים. מומלץ לבצע עקומת להרוג אנטיביוטי עבור כל קו תא להיות החוליה לפני המסך.
  7. מחלק את המדיה מכל באר ולהחליף עם 500 μL של puromycin-המכיל מדיה צמיחה מלאה.
    הערה: הקפד גם להוסיף puromycin לפקד שאינו נגוע היטב שניתן להשתמש בהם בשלבים הבאים כדי להבטיח שהבחירה הpuromycin תושלם.
  8. דגירה את התאים ב 37 ° צ' עם 5% CO2 עבור 48 h.
    הערה: מומלץ לבחור עבור 48 h, כך צפיפות הציפוי, סיכוייו ויראלי צריך להיות ממוטב כך התאים אינם שוטפת לפני 48 h.
  9. ודא כי התאים הנגועים הם ירוקים תחת מיקרוסקופ פלורסנט, וכי תאים בפקד שאינם נגועים היטב מטופלים עם puromycin כולם מתים לפני שממשיכים לשלב 4.

4. זריעת תאים לצורך העברה של כתב כפול-לוציפראז

הערה: יש לבצע העברה של מבחן כדי לקבוע את צפיפות הזריעה המיטבית עבור כל קו תא חדש.

  1. טריסילזציה כל הטוב משלב 3.9 והעברת בערך 1 x 105 תאים לתוך בארות במיקום המקביל על הצלחת החדשה 24-טוב כדלקמן.
    הערה: פרוטוקול זה נועד להקרנה של ספריות עם מאות מרין ולכן לא ניתן לספור כל טוב של תאים נגועים. לכן, השלבים שלהלן שימשו להערכת מספרי התאים בכל הבאר כדי להבטיח צפיפות שווה לציפוי.
    1. לקבץ את הבארות משלב 3.9 לתוך 3-4 קבוצות כגון כל הבארות בקבוצה יש צפיפות תא דומה.
    2. טריסינזציה 1 מייצגת כל קבוצה עם 200 μL של טריפסין-EDTA (1x PBS בתוספת 0.5 מ"מ EDTA ו 0.1% טריפסין) עבור 5 דקות ב-37 ° c. לאחר מכן לנטרל את טריפסין-EDTA על ידי הוספת 400 μL של puromycin המכיל מדיה צמיחה מלאה.
    3. לספור כל נציג היטב כדי לקבוע את מספר התא הכולל לדלל את ההשעיה התא מכל נציג היטב 2 x 105 תאים/mL של שימוש במדיה צמיחה מלאה.
    4. הזרע 0.5 mL (1 x 105 תאים) של כל באר משלב 4.1.3 לתוך המיקום המתאים על צלחת חדשה 24-באר ו-דגירה זו צלחת 24-הבאר החדשה ב 37 ° צ' עם 5% CO2 עבור 24 h.
    5. עבור כל קבוצה משלב 4.1.1, השתמש במספר התאים הכולל שנקבע בשלב 4.1.3 כדי לחשב את עוצמת הקול של טריפסין-EDTA כדי להוסיף לכל באר כדי שההשעיה של התאים המתקבלת תהיה 1 x 106 תאים/mL.
    6. הוסף את הנפח המתאים של טריפסין-EDTA לכל הטוב והדגירה עבור 5 דקות ב 37 ° c.
      הערה: לקבלת מסך גדול יותר, מומלץ לוחיות הרישוי של 24 הצלחות להיות טריסינטזציה ולציפוי מחדש בקבוצות ולא בבת אחת כדי להבטיח את הכדאיות של התאים.
    7. במהלך הדגירה לעיל, להשתמש בצינורות מרובת ערוצים כדי להוסיף 400 μL של puromycin-המכיל מדיה צמיחה מלאה לבארות המתאימות על צלחת חדשה 24-היטב.
    8. העבר 100 μL של השעיית תא (כ 1x 10 בתאים) מכל טוב למיקום המקביל על הצלחות החדשות 24-היטב שהוכנו בשלב 4.1.7.
    9. חזור על שלבים ה4.1.6 באמצעות 4.1.8 עבור כל הלוחות של בארות מקובצות משלב 4.1.1, צלחת אחת בכל פעם.
  2. מודיית את התאים ב 37 ° צ' עם 5% CO2 עבור 24 שעות.

5. העברה של כתב כפול-לוציפראז

  1. Transfect כל טוב משלב 4.2 עם העיתונאי כפול לוציפראז מבנים כדלקמן.
    הערה: הסכום הכולל של ה-DNA ואת היחס האופטימלי של גחלילית העיתונאי ללוציפראז לשלוט renilla לוציפראז וקטור צריך להיקבע לפני התחלת הקביעה הזאת. כאן, 400 ng של תערובת DNA המכילה 20 חלקים גחלילית הכתב לוציפראז ו 1 בקרת חלק renilla ללוציפראז היה בשימוש.
    1. הפוך את התערובת לדילול העור (צינור A) ודילול הכתב לתערובת (Tube B) על ידי ערבוב הכרכים המצוינים של כל מגיב (שולחן 1) כפול מהמספר הכולל של הטרנסלימות (ועוד כמה).
      הערה: פרוטוקול זה מותאם במיוחד לצורך העברה מגיב 2 (ראה טבלת חומרים). אם נעשה שימוש בשימוש מגיב שונה, יש למטב את ההעברה לפני שלב זה.
    2. מערבבים את התערובת לדילול העור (צינור A) עם שילוב של כתבת דילול (Tube B) ומודריאט בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות כדי לייצר תערובת הזיהום.
    3. במהלך הדגירה לעיל, לשטוף כל 24-טוב משלב 4.2 עם 0.25 mL של פוספט מאגר פוספטים (PBS), ולהוסיף 447 μL של מדיית צמיחה מלאה לכל טוב.
    4. לאחר הדגירה של 15 דקות, השתמש בפיפטה מרובה ערוצים כדי להפיץ 53 μL של ערבוב העברה לכל הטוב של הצלחות 24.
  2. מודיית את התאים ב 37 ° צ' עם 5% CO2 עבור 24 שעות.

6. קוונפיקציה של פעילות כפולה לוציפראז

  1. למדוד פעילות לוציפראז באמצעות קורא לוחית ומערכת שיטת כפול ללוציפראז הכתב כמתואר להלן.
    הערה: פרוטוקול זה ממוטב עבור ערכת המידע המצוינת של העיתונאי (ראה טבלת חומרים) ומעקב אחר הפרוטוקול המומלץ של היצרן.
    1. להכין מספיק 1 x מאגר לפירוק פסיבי עבור כל בארות פלוס מספר נוסף (75 μL נדרש לכל טוב) על ידי דילול מאגר לפירוק פסיבי 5x (שסופקו בערכה) 1 אל 5 עם מים מוהים. גם להפשיר מגיב A ו מגיב B מאגר (שסופקו בערכה, 100 μL של כל אחד נדרש עבור כל טוב).
    2. מחלק את התקשורת מכל באר של הצלחת 24-היטב משלב 5.2.
    3. הוסף 75 μL של מאגר פירוק פסיבי של 1x לכל טוב ומארג בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות עם טלטול מדי פעם.
    4. הכנת B מגיב על ידי לדלל 50x מגיב B המצע (שסופקו בערכה) 1:50 עם מאגר מגיב הופר B.
    5. הוסף 30 μL של מאגר פירוק פסיבי של 1x ל -4 בארות לפריסה (ראה טבלה משלימה 2).
    6. העברה 30 μL של ליפוסט משלב 6.1.3 לתוך בארות כפולות של 96-היטב שטוח התחתון לוחית שטוחה לבנה.
    7. השתמש בצינורות מרובי ערוצים כדי להוסיף 50 μL של מגיב לכל טוב ולקרוא את האות גחלילית לוציפרז עם קורא צלחת.
    8. השתמש בפיפטה מרובה ערוצים כדי להוסיף 50 μL של מגיב B משלב 6.1.4 לכל טוב ולקרוא את האות Renilla לוציט עם קורא צלחת.
  2. עבד את הנתונים הגולמיים כדלקמן (לקבלת תיאור מפורט, ראה טבלה משלימה 2).
    1. אל תכלול דגימות עם אות מאוד נמוך Renilla לוציפראז כמו ערכים נמוכים מצביעים על כך המבנה הנגיפי היה רעיל או כי מעטים מדי התאים היו מזוהמים.
      הערה: כפי שהוסבר בדיון, משמעותית "נמוך" האות renilla ללוציפראז יכול לגרום לתוצאות חריגות. כאן, בארות שבו האות Renilla לוציפראז היה יותר מ 1 סטיית תקן מתחת לממוצע לא נכללו (ראה טבלה משלימה 2). זה היה מבוסס על מחקרים קודמים שבוצעו באמצעות מערכת כתבת אלה בתאים14, אבל יכול להיות שונה קווי תאים אחרים.
    2. לנרמל את הערך הגולמי גחלילית לוציפראז של כל טוב לערך Renilla raw לוציפראז של אותו היטב כדי לקבל את היחס גחלילית/renilla .
    3. ממוצע את היחס גחלילית/Renilla של כל שכפול בארות בקרה ולאחר מכן לחלק את היחס גחלילית/renilla של כל היתר גם על ידי מספר זה כדי לקבל שינוי מתקפל.
    4. הקצה את דגימת הבקרה וקבע את ערך היחס שלה לגחלילית/Renilla ל-1.
    5. ממוצע יחסי גחלילית/Renilla של בארות כפולות ועלילה עם סטיית התקן.
      הערה: סטיית התקן אינה משמשת לניתוח סטטיסטי, אלא כאמצעי לזיהוי בארות בהן המשכפלת שונות באופן משמעותי.

תוצאות

שלנו מבנה הכתב שלנו, שלנו (pGL3-5xmcat (SV)-492,14,15) מכיל מינייזם sv-49 מינימלי עם 5 חוזר של אלמנט האיגוד הקאנוני (mcat)15 המניע את הגנים גחלילית לוציפראז (איור 1). זה שיתוף מעורב לתוך תאים יחד עם PRL-TK שליטה וקטו...

Discussion

במחקר זה, אנו מדגימים גישה עבור הקרנת תפוקה בינונית של ספריות ויראליות מסודר בשילוב עם שיטת dual-לוציפראז מבוססי הכתב המבוסס שניתן להשתמש כדי לזהות ולבדוק הרגולטורים הרומן של גורמים שעתוק. זה קריטי לאפיין ולייעל את מערכת הכתב עבור כל קו תא לפני כל מסך. יש לעשות ניסויים כדי לוודא כי העיתונאי ?...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

היינו רוצים להודות לאמילי נורטון ומיקילן קוקצ'רי-סטלירוס על כך שהיא עזרה בהכנת וקטורים מרין. עבודה זו היתה נתמכת בחלקו על ידי המענק סוזן G. Komen Catalyst הוענק J.M.L. (#CCR17477184).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2.0 ml 96-well deep well polypropylene plateUSA Scientific1896-2000For bacterial mini-prep
Trypsin - 2.50%Gibco15090-046Component of trypsin-EDTA
96 well flat bottom white assay plateCorning3922For dual-luciferase assay
Ampicillin - 100 mg/mlSigma-Aldrich45-10835242001-EAFor bacterial mini-prep
Bacto-tryptone - powderSigma-Aldrich95039Component of LB broth
Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) - KitPromegaE1960For dual-luciferase assay
Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red - 9.6 g/LHimediaTS1006For PBS
EDTA - 0.5 MVWR97061-406Component of trypsin-EDTA
Ethanol - 100%Pharmco-AAPER111000200For bacterial mini-prep
Foetal Bovine Serum - 100%VWR97068-085Component of complete growth media
Hexadimethrine bromide (Polybrene) - 8 mg/mlSigma-Aldrich45-H9268For virus infection
HyClone DMEM/High glucose - 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvateGE Healthcare life sciencesSH30243.01Component of complete growth media
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EAMolecular devicesFor dual-luciferase assay
L-Glutamine - 200 mMGibco25030-081Component of complete growth media
Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) - 100%Life technologiesL3000008For transfections
Molecular Biology Water - 100%VWR02-0201-0500For dilution of shRNA vector for virus packaging
NaCl - powderBDHBDH9286Component of LB broth
NanoDrop One Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo scientificFor measuring vector DNA concentration
Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100%Gibco31985-062For transfections
Penicillin Streptomycin - 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin)Gibco15140-122Component of complete growth media
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - KitThermo Fisher ScientificK210010For bacterial mini-prep
Puromycin - 2.5 mg/mlSigma-Aldrich45-P7255For antibiotic selection after infection
TC20 automated cell counterBio-RadFor cell counting
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) - 100%Roche6365787001For virus packaging
Yeast extract - powderVWRJ850Component of LB broth
P3000 (Transfection Reagent 3) - 100%Life technologiesL3000008For transfections

References

  1. Chen, K. S., Lim, J. W. C., Richards, L. J., Bunt, J. The convergent roles of the nuclear factor I transcription factors in development and cancer. Cancer Letters. 410, 124-138 (2017).
  2. Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), E2441-E2450 (2012).
  3. Liu, C. Y., Yu, T., Huang, Y., Cui, L., Hong, W. ETS (E26 transformation-specific) up-regulation of the transcriptional co-activator TAZ promotes cell migration and metastasis in prostate cancer. Journal of Biological Chemistry. 292 (22), 9420-9430 (2017).
  4. Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: oxygen homeostasis and disease pathophysiology. Trends in Molecular Medicine. 7 (8), 345-350 (2001).
  5. Willmer, T., Cooper, A., Peres, J., Omar, R., Prince, S. The T-Box transcription factor 3 in development and cancer. Bioscience Trends. 11 (3), 254-266 (2017).
  6. Zhu, C., Li, L., Zhao, B. The regulation and function of YAP transcription co-activator. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 47 (1), 16-28 (2015).
  7. Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the 'undruggable' cancer targets. Nature Reviews: Cancer. 17 (8), 502-508 (2017).
  8. Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
  9. Hansen, C. G., Moroishi, T., Guan, K. L. YAP and TAZ: a nexus for Hippo signaling and beyond. Trends in Cell Biology. 25 (9), 499-513 (2015).
  10. Yu, F. X., Zhao, B., Guan, K. L. Hippo Pathway in Organ Size Control, Tissue Homeostasis, and Cancer. Cell. 163 (4), 811-828 (2015).
  11. Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers. 10 (4), (2018).
  12. Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  13. Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the Roots of Cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
  14. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
  15. Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 217-225 (2005).
  16. Codelia, V. A., Sun, G., Irvine, K. D. Regulation of YAP by mechanical strain through Jnk and Hippo signaling. Current Biology. 24 (17), 2012-2017 (2014).
  17. Cosset, E., et al. Glut3 Addiction Is a Druggable Vulnerability for a Molecularly Defined Subpopulation of Glioblastoma. Cancer Cell. 32 (6), 856-868 (2017).
  18. de Cristofaro, T., et al. TAZ/WWTR1 is overexpressed in papillary thyroid carcinoma. European Journal of Cancer. 47 (6), 926-933 (2011).
  19. Densham, R. M., et al. MST kinases monitor actin cytoskeletal integrity and signal via c-Jun N-terminal kinase stress-activated kinase to regulate p21Waf1/Cip1 stability. Molecular and Cellular Biology. 29 (24), 6380-6390 (2009).
  20. Eda, H., Aoki, K., Marumo, K., Fujii, K., Ohkawa, K. FGF-2 signaling induces downregulation of TAZ protein in osteoblastic MC3T3-E1 cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 366 (2), 471-475 (2008).
  21. Elbediwy, A., et al. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
  22. Enomoto, M., Igaki, T. Src controls tumorigenesis via JNK-dependent regulation of the Hippo pathway in Drosophila. EMBO Reports. 14 (1), 65-72 (2013).
  23. Enomoto, M., Kizawa, D., Ohsawa, S., Igaki, T. JNK signaling is converted from anti- to pro-tumor pathway by Ras-mediated switch of Warts activity. Developmental Biology. 403 (2), 162-171 (2015).
  24. Fan, R., Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Regulation of Hippo pathway by mitogenic growth factors via phosphoinositide 3-kinase and phosphoinositide-dependent kinase-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (7), 2569-2574 (2013).
  25. Feng, R., et al. MAPK and Hippo signaling pathways crosstalk via the RAF-1/MST-2 interaction in malignant melanoma. Oncology Reports. 38 (2), 1199-1205 (2017).
  26. Fisher, M. L., et al. Transglutaminase Interaction with alpha6/beta4-Integrin Stimulates YAP1-Dependent DeltaNp63alpha Stabilization and Leads to Enhanced Cancer Stem Cell Survival and Tumor Formation. Cancer Research. 76 (24), 7265-7276 (2016).
  27. Haskins, J. W., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Neuregulin 1-activated ERBB4 interacts with YAP to induce Hippo pathway target genes and promote cell migration. Science Signaling. 7 (355), (2014).
  28. Hoeing, K., et al. Presenilin-1 processing of ErbB4 in fetal type II cells is necessary for control of fetal lung maturation. Biochimica et Biophysica Acta. 1813 (3), 480-491 (2011).
  29. Hwang, J. H., et al. Extracellular Matrix Stiffness Regulates Osteogenic Differentiation through MAPK Activation. PloS One. 10 (8), e0135519 (2015).
  30. Kaneko, K., Ito, M., Naoe, Y., Lacy-Hulbert, A., Ikeda, K. Integrin alphav in the mechanical response of osteoblast lineage cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 447 (2), 352-357 (2014).
  31. Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Adhesion to fibronectin regulates Hippo signaling via the FAK-Src-PI3K pathway. Journal of Cell Biology. 210 (3), 503-515 (2015).
  32. Kuser-Abali, G., Alptekin, A., Cinar, B. Overexpression of MYC and EZH2 cooperates to epigenetically silence MST1 expression. Epigenetics. 9 (4), 634-643 (2014).
  33. Liu, N., et al. HDM2 Promotes NEDDylation of Hepatitis B Virus HBx To Enhance Its Stability and Function. Journal of Virology. 91 (16), (2017).
  34. Liu, X., et al. The EZH2- H3K27me3-DNMT1 complex orchestrates epigenetic silencing of the wwc1 gene, a Hippo/YAP pathway upstream effector, in breast cancer epithelial cells. Cellular Signalling. 51, 243-256 (2018).
  35. Omerovic, J., et al. Ligand-regulated association of ErbB-4 to the transcriptional co-activator YAP65 controls transcription at the nuclear level. Experimental Cell Research. 294 (2), 469-479 (2004).
  36. Pegoraro, S., et al. A novel HMGA1-CCNE2-YAP axis regulates breast cancer aggressiveness. Oncotarget. 6 (22), 19087-19101 (2015).
  37. Xia, H., et al. EGFR-PI3K-PDK1 pathway regulates YAP signaling in hepatocellular carcinoma: the mechanism and its implications in targeted therapy. Cell Death & Disease. 9 (3), 269 (2018).
  38. Yan, F., et al. ErbB4 protects against neuronal apoptosis via activation of YAP/PIK3CB signaling pathway in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Experimental Neurology. 297, 92-100 (2017).
  39. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  40. Bonilla, X., et al. Genomic analysis identifies new drivers and progression pathways in skin basal cell carcinoma. Nature Genetics. 48 (4), 398-406 (2016).
  41. Enger, T. B., et al. The Hippo signaling pathway is required for salivary gland development and its dysregulation is associated with Sjogren's syndrome. Laboratory Investigation. 93 (11), 1203-1218 (2013).
  42. Fausti, F., et al. ATM kinase enables the functional axis of YAP, PML and p53 to ameliorate loss of Werner protein-mediated oncogenic senescence. Cell Death and Differentiation. 20 (11), 1498-1509 (2013).
  43. He, J., et al. Positive regulation of TAZ expression by EBV-LMP1 contributes to cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition in nasopharyngeal carcinoma. Oncotarget. 8 (32), 52333-52344 (2017).
  44. Huang, W., et al. The N-terminal phosphodegron targets TAZ/WWTR1 protein for SCFbeta-TrCP-dependent degradation in response to phosphatidylinositol 3-kinase inhibition. Journal of Biological Chemistry. 287 (31), 26245-26253 (2012).
  45. Imada, S., et al. Role of Src Family Kinases in Regulation of Intestinal Epithelial Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 36 (22), 2811-2823 (2016).
  46. Kim, N. G., Koh, E., Chen, X., Gumbiner, B. M. E-cadherin mediates contact inhibition of proliferation through Hippo signaling-pathway components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (29), 11930-11935 (2011).
  47. Lai, J. K. H., et al. The Hippo pathway effector Wwtr1 regulates cardiac wall maturation in zebrafish. Development. 145 (10), (2018).
  48. Li, H., Gumbiner, B. M. Deregulation of the Hippo pathway in mouse mammary stem cells promotes mammary tumorigenesis. Mammalian Genome. 27 (11-12), 556-564 (2016).
  49. Pefani, D. E., O'Neill, E. Hippo pathway and protection of genome stability in response to DNA damage. The FEBS Journal. 283 (8), 1392-1403 (2016).
  50. Serrano, I., McDonald, P. C., Lock, F., Muller, W. J., Dedhar, S. Inactivation of the Hippo tumour suppressor pathway by integrin-linked kinase. Nature Communications. 4, 2976 (2013).
  51. Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
  52. Xie, Q., et al. YAP/TEAD-mediated transcription controls cellular senescence. Cancer Research. 73 (12), 3615-3624 (2013).
  53. Yee, K. S., et al. A RASSF1A polymorphism restricts p53/p73 activation and associates with poor survival and accelerated age of onset of soft tissue sarcoma. Cancer Research. 72 (9), 2206-2217 (2012).
  54. Zhou, Z., et al. Oncogenic Kinase-Induced PKM2 Tyrosine 105 Phosphorylation Converts Nononcogenic PKM2 to a Tumor Promoter and Induces Cancer Stem-like Cells. Cancer Research. 78 (9), 2248-2261 (2018).
  55. Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

157RNAiTAZTEAD

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved