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Resumo

Para identificar novos reguladores de fatores de transcrição, desenvolvemos uma abordagem para tela de bibliotecas RNAi lentivirais ou retrovirais usando um ensaio de repórter transcricional baseado em dupla luciferase. Esta abordagem oferece uma maneira rápida e relativamente barata de selecionar centenas de candidatos em um único experimento.

Resumo

Fatores de transcrição podem alterar a expressão de numerosos genes-alvo que influenciam uma variedade de processos a jusante tornando-os bons alvos para terapias anticâncer. No entanto, direcionar diretamente os fatores de transcrição é muitas vezes difícil e pode causar efeitos colaterais adversos se o fator de transcrição for necessário em um ou mais tecidos adultos. Identificar reguladores a montante que ativam aberrrantamente fatores de transcrição em células cancerosas oferece uma alternativa mais viável, particularmente se essas proteínas são fáceis de drogar. Aqui, descrevemos um protocolo que pode ser usado para combinar bibliotecas lentivirais de média escala e um ensaio de repórter transcricional baseado em dupla luciferase para identificar novos reguladores de fatores de transcrição em células cancerosas. Nossa abordagem oferece uma maneira rápida, fácil e barata de testar centenas de genes em um único experimento. Para demonstrar o uso desta abordagem, realizamos uma tela de uma biblioteca RNAi lentiviral organizada contendo vários reguladores de proteína associada a Sim (YAP) e co-ativador transcricional com motivo de ligação PDZ (TAZ), dois co-ativadores transcritores que são os efeitos a jusante da via Hipopótamo. No entanto, essa abordagem pode ser modificada para os reguladores de praticamente qualquer fator de transcrição ou co-fator e também pode ser usada para tela de bibliotecas CRISPR/CAS9, cDNA ou ORF.

Introdução

O objetivo deste ensaio é usar bibliotecas virais para identificar reguladores de fatores de transcrição de forma relativamente rápida e barata. A atividade transcricional aberrante está associada ao câncer e à metástase1,2,3,4,5,6, então direcionar fatores de transcrição em células cancerosas é uma abordagem terapêutica promissora. No entanto, fatores de transcrição são muitas vezes difíceis de atingir farmacologicamente7 e muitos são necessários para a função celular normal em tecidos adultos8,9,10. Direcionar as vias associadas ao câncer que ativam aberrrantamente fatores de transcrição para conduzir a doença é uma abordagem mais viável com potencial para ter efeitos colaterais menos graves. A disponibilidade comercial de bibliotecas RAi, CRISPR/CAS9, cDNA ou ORF, lentiona ou ré, permite aos pesquisadores testar a importância de inúmeros genes em um único experimento. No entanto, é necessária uma leitura confiável para a atividade transcricional alterada.

Aqui, descrevemos o uso de um ensaio transcricional baseado em duas luciferases e bibliotecas lentivirais organizadas para identificar proteínas que regulam fatores de transcrição em células cancerosas. Neste ensaio, as shRNAs que visam genes associados ao câncer são entregues às células cancerígenas de mamíferos através da transdução lentiviral e as células são selecionadas para integração estável usando puromicina. As células são transfeccionadas em seguida com uma construção de repórter que expressa a luciferase de vagalume impulsionada por um promotor específico para o fator de transcrição que está sendo investigado e um conjunto de controle que expressa a luciferase de Renilla de um promotor constitutivamente ativo que não responde ao fator de transcrição que está sendo investigado. Demonstramos essa abordagem com uma tela de prova de conceito para os reguladores da YAP e da TAZ, os efeitos críticos a jusante da via Hipopótamo88,10,,11. A atividade anormal de YAP e TAZ promove várias etapas da cascata metastática11 e é observada em muitos cânceres11,12,13. No entanto, como yap e TAZ se tornam aberrantemente ativados em algumas células cancerosas ainda não é totalmente compreendido. YAP e TAZ não ligam DNA, mas são recrutados para promotores por outros fatores de transcrição. Os membros da família tea domain (TEAD) de fatores de transcrição são os principais parceiros vinculantes para YAP e TAZ, e são críticos para a maioria das funções dependentes de YAP e TAZ. Nossa construção de repórter expressa a luciferase de vagalumes de um promotor yap/taz-TEAD-responsivo e estudos anteriores demonstraram que detecta fielmente alterações na atividade transcricional YAP-TEAD e TAZ-TEAD2,14,15.

Nossa abordagem é rápida, de médio porte, e não requer instalações de triagem, robôs automatizados ou sequenciamento profundo de bibliotecas agrupadas. Os custos são relativamente baixos e há inúmeras bibliotecas disponíveis comercialmente para escolher. Os equipamentos e reagentes necessários também são relativamente padrão na maioria dos laboratórios. Ele pode ser usado para rastrear reguladores de praticamente qualquer fator de transcrição se um repórter baseado em luciferase existir ou for gerado. Usamos essa abordagem para tela shRNAs em células cancerosas, mas qualquer linha celular que possa ser transfeccionada com eficiência razoável poderia ser usada com qualquer tipo de biblioteca organizada.

Protocolo

NOTA: Um resumo esquemático deste protocolo é mostrado na Figura 1.

1. Preparação da biblioteca vetorial lentiviral

NOTA: A tela demonstrada usou uma biblioteca de shRNA organizada comprada como estoque de glicerol em placas de 96 poços, mas as bibliotecas também podem ser montadas manualmente com base em uma lista de candidatos. Os controles apropriados devem ser considerados e incluídos em qualquer biblioteca. Isso inclui um shRNA (shNTC) de controle, um shRNA de controle direcionado ao fator de transcrição que está sendo investigado e, se possível, um shRNA direcionado à luciferase de vagalume.

  1. Adicionar 1,3 mL de Caldo de Luria (LB) (1% bacto-tripton, 0,5% extrato de levedura, 1% NaCl, pH 7,5) contendo 100 μg/mL de ampicillin a cada poço de uma placa de poço profundo de 96 poços. Inocule cada poço com 2 μL de glicerol e cresça a 37 °C durante a noite com agitação constante a 225 rpm.
  2. Transfira cada cultura bacteriana para um tubo de centrífuga de 1,5 mL e pelota as bactérias por centrifugação a 21.000 x g a 4 °C por 10 min.
  3. Purifique cada vetor usando um mini-kit de preparação bacteriana seguindo o protocolo do fabricante.
  4. Determine a concentração de cada vetor usando um espectrofotômetro.
  5. Armazene os plasmídeos a -20 °C.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

2. Embalagem da biblioteca lentiviral organizada

NOTA: Todo o trabalho envolvendo lentivírus, incluindo embalagem, infecção e posterior cultivo de células infectadas, deve seguir rigorosamente as regras e regulamentos institucionais de biossegurança.

  1. Expanda as células de 293FT usando mídia de crescimento completo (o meio águia modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 4 mM L-glutamina, 4.500 mg/L de glicose e piruvato de sódio, suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 100 unidades/mL de penicilina, 100 μg/mL de esteptomicina e 2 mM
  2. Para cada vetor na biblioteca a partir do passo 1.4, semente um 24-well com 1 x 105 293FT células.
    NOTA: Recomenda-se que alguns poços extras de um vetor viral de controle sejam embalados e utilizados para testar o título do vírus antes de prosseguir para a etapa 3 (veja abaixo).
  3. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 por 24 horas.
    NOTA: Um protocolo geral para embalagem de lentivírus descrito anteriormente14 foi reduzido para 24 poços para este protocolo. Ele usa psPAX2 para embalagem lentiviral e VSVG como uma proteína de casaco. Se o vírus ectrópico for desejado, um vetor que entrega Eco pode ser usado em vez de VSVG. É altamente recomendável que este protocolo seja otimizado para alcançar um título viral que dê entre 30%-70% de eficiência de infecção das células-alvo (ver Discussão). Consulte a Tabela Suplementar 1 para obter uma lista de todos os vetores utilizados.
  4. Configure uma mistura de transfecção para cada vetor viral da Etapa 1.4, conforme descrito abaixo. Cada transfecção deve conter 250 ng do vetor viral, 125 ng de psPAX2, 125 ng de VSVG, 1,25 μL de reagente de transfecção 1 e 23,75 μL de tampão de transfecção (ver Tabela de Materiais).
    1. Diluir cada vetor lentiviral a 50 ng/μL com água sem nuclease e, em seguida, transferir 5 μL (250 ng) para um poço de uma placa PCR de 96 poços.
    2. Faça a super mistura de transfecção misturando 1,25 μL * X do reagente de transfecção 1 e 23,75 μL * X de tampão de transfecção pré-aquecido onde "X" é o número total de transfecções mais várias extras para explicar a perda de volume durante a pipetação.
    3. Incubar a super mistura de transfecção em temperatura ambiente por 5 min.
    4. Adicione 125 ng * X de psPAX2 e 125 ng * X de VSVG ao tubo de transfecção super mix a partir do Passo 2.4.3 e suavemente pipet para cima e para baixo para misturar. Siga rapidamente para o Passo 2.4.5.
    5. Alíquota imediatamente a mistura do Passo 2.4.4 em cada tubo de uma tira PCR e, em seguida, use a pipeta multicanal para transferir 25 μL da mistura para cada poço contendo vetor viral da Etapa 2.4.1.
    6. Incubar em temperatura ambiente por 20 min.
    7. Transfira todos os 30 μLs de cada 96 poços da Etapa 2.4.6 para um poço de 24 poços contendo células de 293 FT do Passo 2.3.
  5. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 por 24 h e, em seguida, substituir a mídia em cada poço da placa de 24 poços com 500 μL de mídia de crescimento completo fresco. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 por mais 24 horas.
  6. Usando uma pipeta multicanal, colete o supernadante viral de cada poço e alíquota 220 μL (suficiente para 1 infecção no Passo 3 mais algum volume extra) em dois poços de 96 cada. Estas são as placas supernatant virais.
  7. Armazene as placas supernatantes virais dispostas a -80 °C.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Também é recomendado testar parte do vírus de controle extra que foi embalado (veja acima) nas células a serem infectadas antes de prosseguir para a Etapa 3. Isto é para garantir que o título seja suficiente para atingir pelo menos 30% de eficiência de infecção.

3. Infecção das células para a tela

NOTA: As células de melanoma humano (A375) foram utilizadas para demonstrar essa abordagem, mas este método pode ser aplicado a quaisquer células aderentes que infectem com lentivírus. No entanto, as condições de cultura celular e de revestimento devem ser otimizadas para cada linha celular (ver Discussão).

  1. Expanda as células para serem infectadas em meios de crescimento completos.
  2. Semente sed24-well placas com 1 x 105 células em 0,5 ml de mídia de crescimento completo por poço. A semente um poço para cada vetor viral a ser testado (incluindo controles) e incluir um poço extra que não será infectado que servirá como um controle para a seleção de medicamentos na Etapa 3.7.
  3. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 por 24 horas.
  4. Infectar cada poço do Passo 3.2 com um sobrenadante viral diferente do sobrenadante lentiviral congelado da seguinte forma.
    1. Prepare a mídia de crescimento completa que contenha 20 μg/mL de polibreno.
    2. Descongele os supernatantes da biblioteca lentiviral da Etapa 2.7 à temperatura ambiente.
    3. Apiratee a mídia de crescimento das placas de 24 poços da Etapa 3.2 e adicione imediatamente 200 μL de mídia de crescimento contendo polibrene a cada poço.
    4. Usando uma pipeta multicanal, transfira 200 μL de supernadante viral de cada 96 poços da Etapa 3.4.2 para os 24 poços da Etapa 3.4.3.
  5. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 por 24 - 48 h.
    NOTA: Algumas linhas celulares podem exigir mais de 24 h para expressar as shRNAs e tornar-se resistentes à puromicina. O vetor viral aqui utilizado fornece um Turbo-GFP-IRES-puroR com um shRNA à base de miR30 no 3'UTR de puroR(Figura 1). A eficiência da infecção e a expressão do gene de resistência à puromicina e do shRNA foram monitorados por proteína fluorescente verde.
  6. Prepare a mídia de crescimento completa que contenha 2,5 μg/mL de puromicina.
    NOTA: A concentração de seleção de puromicina varia entre as linhas celulares. Recomenda-se que uma curva de morte por antibiótico seja realizada para cada linha celular a ser ensaio antes da tela.
  7. Apiratee a mídia de cada poço e substitua por 500 μL de mídia de crescimento completa contendo puromicina.
    NOTA: Certifique-se também de adicionar puromicina a um poço de controle não infectado que pode ser usado em etapas subseqüentes para garantir que a seleção de puromicina esteja completa.
  8. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 por 48 h.
    NOTA: É melhor selecionar por 48 h, por isso a densidade de chapeamento e o título viral devem ser otimizados para que as células não sejam superconfluentes antes das 48 h.
  9. Certifique-se de que as células infectadas estão verdes o microscópio fluorescente, e que as células em um controle não infectado bem tratado sino estão todas mortas antes de seguir para o Passo 4.

4. Células de semeamento para transfecção de repórter de dupla luciferase

NOTA: Uma transfecção de teste deve ser feita para determinar a densidade ideal de semeada para cada nova linha celular.

  1. Tente cada poço a partir do Passo 3.9 e transfira aproximadamente 1 x 105 células para poços na posição correspondente na nova placa de 24 poços da seguinte forma.
    NOTA: Este protocolo foi projetado para a triagem de bibliotecas com centenas de shRNAs, por isso não é viável contar todos os poços de células infectadas. Portanto, as etapas abaixo foram utilizadas para estimar os números das células em cada poço para ajudar a garantir aproximadamente igual densidade de revestimento.
    1. Agrupar os poços do Passo 3.9 em 3 - 4 grupos de tal forma que todos os poços de um grupo têm uma densidade celular semelhante.
    2. Trippsinize 1 representante bem de cada grupo com 200 μL de trypsin-EDTA (1x PBS complementado com 0,5 mM EDTA e 0,1% de tripspsina) para 5 min a 37 °C. Em seguida, neutralizar a tripsina-EDTA adicionando 400 μL de puromicina contendo mídia de crescimento completo.
    3. Conte bem cada representante para determinar o número total da célula e diluir bem a suspensão celular de cada representante para 2 x 105 células/mL de usar mídia de crescimento completa.
    4. Semente 0,5 mL (1 x 105 células) de cada poço do Passo 4.1.3 para a posição correspondente em uma nova placa de 24 poços e incubar esta nova placa de 24 poços a 37 °C com 5% de CO2 para 24 horas.
    5. Para cada grupo da Etapa 4.1.1, use o número total de célula determinado na Etapa 4.1.3 para calcular o volume de trypsin-EDTA para adicionar a cada poço de modo que a suspensão celular resultante seja de 1 x 106 células/mL.
    6. Adicione o volume apropriado de trypsin-EDTA a cada poço e incubar por 5 min a 37 °C.
      NOTA: Para tela maior recomenda-se que as placas de 24 poços sejam tripsinizadas e replacadas em grupos, em vez de todas de uma vez para garantir a viabilidade das células.
    7. Durante a incubação acima, use uma pipeta multicanal para adicionar 400 μL de mídia de crescimento completa contendo puromicina aos poços correspondentes em uma nova placa de 24 poços.
    8. Transfira 100 μL de suspensão celular (aproximadamente 1 x 105 células) de cada poço para a posição correspondente nas novas placas de 24 poços preparadas na Etapa 4.1.7.
    9. Repita as etapas 4.1.6 a 4.1.8 para todas as placas de poços agrupados da Etapa 4.1.1, uma placa por vez.
  2. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 por 24 horas.

5. Transfecção de repórter de dupla luciferase

  1. Transfect cada poço a partir do Passo 4.2 com o repórter de dupla-luciferase constrói da seguinte forma.
    NOTA: A quantidade total de DNA e a proporção ideal de vetor de repórter de luciferase de vagalume para controlar o vetor de luciferase renilla devem ser determinados antes de iniciar este ensaio. Aqui, 400 ng de uma mistura de DNA que contém 20 partes de luciferase de vagalume e 1 parte de controle Renilla luciferase foi usado.
    1. Faça a mistura de diluição de transfecção (Tubo A) e a mistura de diluição do repórter (Tubo B) misturando os volumes indicados de cada reagente(Tabela 1) multiplicados pelo número total de transfecções (mais várias extras).
      NOTA: Este protocolo é otimizado para o reagente de transfecção 2 (ver Tabela de Materiais). Se for utilizado um reagente de transfecção diferente, a transfecção deve ser otimizada antes desta etapa.
    2. Misture a mistura de diluição de transfecção (Tubo A) com a mistura de diluição do repórter (Tubo B) e incubar em temperatura ambiente por 15 min para produzir mistura de transfecção.
    3. Durante a incubação acima, enxágue cada 24-well da Etapa 4.2 com 0,25 mL de solução salina tampão fosfato (PBS) e adicione 447 μL de mídia de crescimento completo a cada poço.
    4. Após a incubação de 15 min, use uma pipeta multicanal para distribuir 53 μL de mistura de transfecção para cada poço das placas de 24 poços.
  2. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 por 24 horas.

6. Quantificação da atividade de dupla luciferase

  1. Meça a atividade da luciferase usando um leitor de placas e um kit de ensaio de repórter de dupla luciferase, conforme descrito abaixo.
    NOTA: Este protocolo é otimizado para o kit de ensaio de repórter indicado (ver Tabela de Materiais) e segue o protocolo recomendado pelo fabricante.
    1. Prepare tampão de lyse passiva suficiente de 1x para todos os poços mais vários extras (75 μL é necessário por poço) diluindo 5x tampão passivo de lyse (fornecido no kit) 1 a 5 com água deionizada. Também descongele o reagente A e o reagente B Buffer (fornecido no kit, 100 μL de cada um é necessário para cada poço).
    2. Aspirar a mídia de cada poço da placa de 24 poços do Passo 5.2.
    3. Adicione 75 μL de tampão de lyse passiva de 1x a cada poço e incubar em temperatura ambiente por 30 min com ocasionalmente tremendo.
    4. Prepare o reagente B diluindo o substrato B de reagente de 50x (fornecido no kit) 1:50 com tampão b descongelado.
    5. Adicionar 30 μL de tampão de lyse passiva de 1x a 4 poços para apagar (ver Tabela Suplementar 2).
    6. Transfira 30 μL de lisato da Etapa 6.1.3 para poços duplicados de uma placa de ensaio branco de fundo plano de 96 poços.
    7. Use uma pipeta multicanal para adicionar 50 μL de reagente A a cada poço e leia o sinal de luciferase de vagalume com um leitor de placas.
    8. Use uma pipeta multicanal para adicionar 50 μL de reagente B da Etapa 6.1.4 para cada poço e leia o sinal de luciferase renilla com um leitor de placas.
  2. Processe os dados brutos da seguinte forma (para uma descrição detalhada, consulte Tabela Suplementar 2).
    1. Exclua amostras com sinal de luciferase renilla muito baixo, pois valores baixos indicam que a construção viral era tóxica ou que poucas células transinfectadas foram ensaios.
      NOTA: Como explicado na Discussão, o sinal de luciferase renilla significativamente "baixo" pode resultar em resultados anômalos. Aqui, foram excluídos os poços em que o sinal de luciferase de Renilla foi mais de 1 desvio padrão abaixo da média (ver Tabela Suplementar 2). Isso foi baseado em estudos anteriores realizados usando este sistema de repórter nestas células14,mas pode diferir em outras linhas celulares.
    2. Normalize o valor bruto da luciferase de mosca-das-marmelade de cada poço para o valor bruto da luciferase renilla do mesmo poço para obter a razão vagalume/Renilla.Renilla
    3. Média das proporçõesfirefly/Renilla de todos os poços de controle de réplica e, em seguida, divide a proporção firefly/Renilla de todos os outros poços por esse número para obter uma mudança de dobra.Renilla
    4. Atribuir a amostra de controle e definir o valor da razãofirefly/Renilla para 1.
    5. Média das relaçõesfirefly/Renilla dos poços duplicados e parcela com o desvio padrão.
      NOTA: O desvio padrão não é utilizado para análise estatística, mas sim como um meio de identificar poços onde as réplicas diferem significativamente.

Resultados

Nosso construto de repórter YAP/TAZ-TEAD (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,15) contém um promotor SV-49 mínimo com 5 repetições do elemento de ligação CANônico TEAD (MCAT)15 que conduz o gene da luciferase de vagalume(Figura 1). É co-transfetado em células juntamente com o vetor de controle PRL-TK (Promega), que expressa a luciferase de R...

Discussão

Neste estudo, demonstramos uma abordagem para a triagem de média-duração de bibliotecas virais organizadas em combinação com um ensaio de repórter transcricional baseado em duas luciferases que pode ser usado para identificar e testar novos reguladores de fatores de transcrição. É fundamental caracterizar e otimizar o sistema de repórteres para cada linha celular antes de qualquer tela. Experimentos devem ser feitos para confirmar que o repórter está respondendo à atividade alterada do fator de transcrição...

Divulgações

Os autores não têm nada para revelar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a Emily Norton e Mikaelan Cucciarre-Stuligross por ajudarna preparação de vetores shRNA. Este trabalho foi apoiado em parte por uma Susan G. Komen Career Catalyst Grant que concedeu a J.M.L. (#CCR17477184).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
2.0 ml 96-well deep well polypropylene plateUSA Scientific1896-2000For bacterial mini-prep
Trypsin - 2.50%Gibco15090-046Component of trypsin-EDTA
96 well flat bottom white assay plateCorning3922For dual-luciferase assay
Ampicillin - 100 mg/mlSigma-Aldrich45-10835242001-EAFor bacterial mini-prep
Bacto-tryptone - powderSigma-Aldrich95039Component of LB broth
Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) - KitPromegaE1960For dual-luciferase assay
Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red - 9.6 g/LHimediaTS1006For PBS
EDTA - 0.5 MVWR97061-406Component of trypsin-EDTA
Ethanol - 100%Pharmco-AAPER111000200For bacterial mini-prep
Foetal Bovine Serum - 100%VWR97068-085Component of complete growth media
Hexadimethrine bromide (Polybrene) - 8 mg/mlSigma-Aldrich45-H9268For virus infection
HyClone DMEM/High glucose - 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvateGE Healthcare life sciencesSH30243.01Component of complete growth media
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EAMolecular devicesFor dual-luciferase assay
L-Glutamine - 200 mMGibco25030-081Component of complete growth media
Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) - 100%Life technologiesL3000008For transfections
Molecular Biology Water - 100%VWR02-0201-0500For dilution of shRNA vector for virus packaging
NaCl - powderBDHBDH9286Component of LB broth
NanoDrop One Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo scientificFor measuring vector DNA concentration
Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100%Gibco31985-062For transfections
Penicillin Streptomycin - 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin)Gibco15140-122Component of complete growth media
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - KitThermo Fisher ScientificK210010For bacterial mini-prep
Puromycin - 2.5 mg/mlSigma-Aldrich45-P7255For antibiotic selection after infection
TC20 automated cell counterBio-RadFor cell counting
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) - 100%Roche6365787001For virus packaging
Yeast extract - powderVWRJ850Component of LB broth
P3000 (Transfection Reagent 3) - 100%Life technologiesL3000008For transfections

Referências

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