Method Article
אנו מציגים את פרוטוקול התיוג הממוטב המותאם לשני הכוללים מידע מפורט עבור כל אחד מהצעדים הבאים: חילוץ חלבונים, כימות, משקעים, עיכול, תיוג, הגשה למתקן הפרוטאוניקס וניתוחי מידע.
טכנולוגיות פרוטאוממית הן מתודולוגיות רבות עוצמה שיכולות לסייע לנו בהבנת מנגנוני פעולה במערכות ביולוגיות על ידי מתן השקפה גלובלית של ההשפעה של מחלה, טיפול, או תנאי אחר על פרוטאום כולו. דו ח זה מספק פרוטוקול מפורט להפקת, כימות, משקעים, עיכול, תיוג וניתוח נתונים שלאחר מכן של דגימות חלבונים. פרוטוקול התיוג הממוטב שלנו דורש ריכוז תוויות תגים נמוך יותר ומשיג נתונים אמינים בעקביות. השתמשנו בפרוטוקול זה כדי להעריך פרופילים של ביטוי חלבונים במגוון של רקמות העכבר (כלומר, לב, שריר השלד, ואת המוח), כמו גם תאים המתורבית מבחנה. בנוסף, אנו מדגימים כיצד להעריך אלפי חלבונים מערכת הנתונים הנוצרת.
המונח "פרוטאומניקס" הוגדר לראשונה כאפיון בקנה מידה גדול של משלים החלבון כולו של תא, רקמה או אורגניזם1. מנתח פרוטאוממית מאפשר חקירה של מנגנונים ותהליכים סלולריים המעורבים בפיתוח מחלות, מסלולים טיפוליים, ומערכות בריאות באמצעות טכניקות לבצע כימות יחסית של רמות ביטוי חלבונים2. התיאורים הראשוניים של מחקרים כאלה פורסמו בשנת 1975 והפגינו שימוש בשני מימדים של האלקטרופורזה ג'ל מגנטית (2d-PAGE) למטרה זו1,3. השיטה הדו מפרידה חלבונים המבוססים על תשלום (איזואלקטריים התמקדות, הארה ב) ומסה מולקולרית (נתרן dodecyl סולפט אלקטרופורזה ג'ל לג, או sds-PAGE)4. במשך שנים, השילוב של דף דו-ממדי וספקטרומטר המסה העוקבות המבוצעים על כל רכיב ג'ל היה השיטה הנפוצה ביותר לניתוח ביטוי חלבון בלתי ממוקד, שבוצעה וזיהתה מספר רב של פרופילי חלבון לא ידועים בעבר,5,6. חסרונות כלליים הגישה 2d-עמוד הם שזה זמן רב, לא עובד טוב עבור חלבונים הידרופובי, ויש מגבלות במספר הכולל של חלבונים המשוער בשל רגישות נמוכה7,8.
האיזוטופ היציב תיוג על ידי חומצות אמינו בשיטת התרבות התא (SILAC) הפך הגישה הפופולרית הבאה כדי לזהות ולכמת שפע חלבון בדגימות9. הוא מורכב תיוג מטבולית של תאים שאינם מודבטים בינונית חסר חומצת אמינו חיוניים סטנדרטיים והוא שיושלם עם גרסה מתויג איזוטופ של חומצת אמינו ספציפית זו10. היתרון של טכניקה זו הוא יעילותו ותיוג מדויק9. המגבלה העיקרית של הגישה SILAC היא בעיקר את שיעור הצמיחה של התא מופחת הנגרמת על ידי התאגדות התווית איזוטופ, אשר יכול להיות מאתגר במיוחד בקווי התאים רגיש יחסית מידול מחלות אדם11.
בשנת 2003, הוצגה בפני השדה12טכניקת הפרוטאומיקס החדשנית והאיתנה הכוללת מדבקות בצמד המסה (מתורה). התיוג הכולל הוא שיטה רבת-עוצמה בשל רגישותו המוגברת לזיהוי רמות ביטוי החלבון היחסיות והשינויים בפוסט-שינוי13. מתאריך פרסום זה פותחו ערכות מתורה שיכולות לתייג בו 6, 10, 11 או 16 דגימות. כתוצאה מכך, ניתן למדוד שפע של פפטיד בתנאים מרובים עם שכפול ביולוגי באותו זמן14,15,16. השתמשנו לאחרונה בכולל כדי לאפיין את הפרופיל הפרוטאומית לב של מודל העכבר של תסמונת Barth (BTHS)17. בכך, הצלחנו להפגין שיפור נרחב בפרופילי הלב של העכברים BTHS שטופלו בטיפול גנטי ולזהות חלבונים הרומן המושפעים על ידי BTHS שחשף מסלולים טיפוליים הרומן מעורב cardiomyopathies.
כאן, אנו מתארים שיטה מפורטת לביצוע מערכות מתאר כמותיים מתאר כמותי באמצעות דגימות רקמה או כדורי תא. זה יכול להיות מועיל לבצע את ההכנה לדוגמה ותיוג לפני ההגשה לליבה כי הפפטידים הטריפטיים המסומנים הם יציבים יותר מאשר מדגמים קפואים גולמיים, לא כל הליבות יש ניסיון טיפול בכל סוגי המדגם, והכנת דגימות במעבדה יכול לחסוך זמן עבור ליבות, אשר לעתים קרובות יש יומני חזרה ארוכה. לתיאורים מפורטים של חלק הספקטרוסקופיית ההמוני בתהליך זה נא לראות את קירשבאום ואח ' ו-perumal ואח '18,19.
פרוטוקול ההכנה לדוגמה מורכב מהצעדים העיקריים הבאים: חילוץ, כימות, משקעים, עיכול ותיוג. היתרונות העיקריים של פרוטוקול ממוטב זה הם שהוא מפחית את העלויות של תיוג, משפר את חילוץ החלבון, ומייצר בעקביות נתונים באיכות גבוהה. בנוסף, אנו מתארים כיצד לנתח את נתוני הכולל כדי להקרין אלפי חלבונים במשך זמן קצר. אנו מקווים כי פרוטוקול זה מעודד קבוצות מחקר אחרות לשקול שילוב מתודולוגיה רבת עוצמה זו ללימודיו.
הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש מאוניברסיטת פלורידה אישרה את כל לימודי החיות.
1. הכנת ריאגנטים
2. הפקת חלבון
3. מדידת חלבון
4. הפחתה/הפחתת טיפול מגיב
5. מתנול/כלורופורם משקעים20
6. עיכול החלבון
7. פפטיד תיוג
8. ספקטרוסקופיית מסה
9. ניתוח נתונים
10. שיטות להערכת כניסות משמעותיות
11. העלאת נתונים פרוטאוממית לבנק מאגר
תאים בריאים וחולים היו לאחר מאגר בחורים, הכין כמפורט בשיטה שלנו תיוג מציון, והוגשה לאוניברסיטת פלורידה המרכז הבינתחומי למחקר ביוטכנולוגיה (UF-ICBR) פרוטאומניקס ליבה עבור כרומטוגרפיה נוזלית עם ספקטרומטר מסה מאסיבית. בעקבות רכישת נתונים ומשלוח מהמרכז, ערכת הנתונים נפתחה בתוכנה שסופקה על-ידי היצרן ומסנני הקיצוץ הבאים הוחלו: ≥ 2 פפטידים ייחודיים, יוני עיתונאי עבור כל דגימת חלבון הקיימת בכל הערוצים, וכוללים רק חלבונים ששונו באופן משמעותי (p ≤ 0.05). טבלה 1 מסכמת את הנתונים: 39,653 כולל פפטידים, אשר 7,211 יש שווה או גדול יותר משני פפטידים ייחודיים, ו 3,829 כוללים יוני כתב עבור כל הערוצים. ערכי p עבור אלה 3,829 פפטידים חושבו על ידי מבחן t של הסטודנט p ≤ 0.05 נחשב משמעותי. בנוסף, חיתוך שינוי קיפול שימש כדי לקבוע את ההתפלגות היחסית של חלבונים מפני חולים בהשוואה לתאים בריאים: מוסדרות (כחול) או upregulated (אדום) (איור 1).
הרשימה של ביטוי חלבון באופן משמעותי מוסדר הוערך באמצעות מערכת הדיאונטולוגיה של הפנתר וניתוחי מחרוזות. ניתוח הפנתר הראה רשימה מחולקת לקטגוריות של חלבונים המבוססים על נמוך באופן משמעותי (איור 2א) או שפע גבוה יותר בתאים חולים המבוססים על פונקציה מולקולרית (איור 2ב). ניתוח מחרוזות של חלבונים בעלי מספר נמוך באופן משמעותי (איור 2ג) ומעלה (איור 2ד) שפע זיהה אינטראקציות מרובות ואסוציאציות חזקות בין חלבונים.
איור 1: העלילה הר הגעש הצגת חלבונים אשר השפע לא שונה באופן משמעותי (שחור), הוריד באופן משמעותי (כחול), או גדל באופן משמעותי (אדום) בתאי בקרה לעומת חולה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הערכות מייצגות של להיטים מוסדרים באופן משמעותי המזוהים על ידי פנתר (A, B) ו-String (C, D) של חלבונים שפע נמוך או גבוה באופן משמעותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
פפטידים כולל | סה כ זוהו | ≥ 2 פפטידים ייחודי | חלבונים בעלי כימות | חלבונים ששונו באופן משמעותי | |
נמוך | גבוהה | ||||
39653 | 7211 | 4457 | 3829 | 296 | 108 |
טבלה 1: טבלה מייצגת של חלבונים הניתנים לכימות לכל ניתוח של ערכת נתונים.
כדי להכין בהצלחה דוגמאות לניתוח פרוטאומית באמצעות מתודולוגיות מבוססות מחקר של מתודולוגיה יציבה מבוססת על מערכות חלבונים, חשוב לבצע עקירת חלבון בזהירות רבה ב-4 ° c ולהשתמש במאגר פירוק המכיל קוקטייל מעכב פרוטאז24,25. הקוקטייל מעכב פרוטאז הוא מגיב מכריע כדי למנוע השפלה חלבון בלתי צפוי במהלך עיכול החלבון. הבדל מפתח אחד בין הפרוטוקול שלנו לבין הנוכחי שסופק על ידי הספק הוא שאנו ממליצים בחום על השימוש במאגר הליזה בחורים המבוססים על הניסיון שלנו עם תאים ורקמות. אנו מציעים גם באמצעות גישה משקעים מתנול/כלורופורם חלבון עבור כדורי תא ורקמות.
באופן אידיאלי, חילוץ חלבונים, מדידה, הפחתה/הפחתת טיפולים מגיב, ו מתנול/כלורופורם מצמצמים מבוצעים באותו יום. לאחר המלצה זו תגרום לריכוזי חלבון מדויקים יותר עבור תיוג הבאים. צעד המשקעים בחלבון חשוב להסרת ריאגנטים שיתערב בספקטרומטר מסה דו-מושביים. כולל שלב המשקעים מגביר באופן משמעותי את הרזולוציה של הכולל26. בסיכום, היתרונות העיקריים של פרוטוקול התורה שלנו הם היעילות של התיוג הגבוה לסוגים שונים של דגימות, התוכונות והנתונים האמינים שנרכשו.
כמו הטבע של האסטרטגיה הפרוטמניקה מתורה זו ממשיכה להתרחב, זה יהיה בהדרגה לשפר את היכולת של חוקרים ברחבי מגוון רחב של שדות כדי ליצור תגליות הרומן. במיוחד בתחום ביו-רפואי, אנחנו ואחרים מצאנו את הטכנולוגיה הזאת אינפורמטיבי יותר ויותר במחקרים לחקור מנגנונים חדשניים של פעולה במחלות והשפעות יחסיות של therapeutics שונים. מכל הסיבות הללו, טכנולוגיה רבת עוצמה זו משלימה את הרפרטואר של גישות אחרות של OMICS המשמשות במחקרי מחקר מודרניים ומספקת מידע מפתח שיכול להדריך את ההתפתחות הטיפולית.
. למחברים אין מה לגלות
היינו רוצים להכיר את UF-ICBR מתקן פרוטאוניקס על העיבוד שלהם של דגימות שלנו. עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות R01 HL136759-01A1 (CAP).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 M Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 50 mL | Thermo Fisher | 90114 | Reagent for protein labeling |
50% Hydroxylamine, 5 mL | Thermo Fisher | 90115 | Reagent for protein labeling |
Acetic acid | Sigma | A6283 | Reagent for protein digestion |
Anhydrous acetonitrile, LC-MS Grade | Thermo Fisher | 51101 | Reagent for protein labeling |
Benzonaze nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | DNA shearing |
Bond-Breaker TCEP solution, 5 mL | Thermo Fisher | 77720 | Reagent for protein labeling |
BSA standard | Thermo | 23209 | Reagent for protein measurement |
CHAPS | Thermo Fisher | 28300 | Reagent for protein extraction |
Chloroform | Fisher | BP1145-1 | Reagent for protein precipitation |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 4693132001 | Reagent for protein extraction |
DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | Reagent for protein measurement |
Excel | Microsoft Office | Software for data analyses | |
Heat block | VWR analog | 12621-104 | Equipment for protein digestion incubation |
HEPES | Sigma | RDD002 | Reagent for protein extraction |
Methanol | Fisher | A452-4 | Reagent for protein precipitation |
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Fisher | 90058 | Reagent for protein digestion |
Potassium chloride | Sigma | 46436 | Reagent for protein extraction |
Sigma Plot 14.0 | Sigma Plot 14.0 | Software for data analyses | |
Sonicator | Fisher Scientific | FB120 | DNA shearing |
Spectra Max i3x Multi-Mode Detection Platform | Molecular Devices | Plate reader for protein measurement | |
Thermo Scientific Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Reagent for protein measurement |
Thermo Scientific Pierce Quantitative Fluorescent Peptide Assay | Thermo Fisher | 23290 | Reagent for protein measurement |
Thermo Scientific Proteome Discoverer Software | Thermo Fisher | OPTON-30945 | Software for data analyses |
TMT 10plex Isobaric Label Reagent Set 0.8 mg, sufficient reagents for one 10plex isobaric experiment | Thermo Fisher | 90110 | Reagent for protein labeling |
TMT11-131C Label Reagent 5 mg | Thermo Fisher | A34807 | Reagent for protein labeling |
Water, LC-MS Grade | Thermo Fisher | 51140 | Reagent for protein extraction |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved