אפיון מבני עמילואיד בהזדקנות C. אלגיה באמצעות הדמיה של תקופת החיים הפלואורסצנטית

Summary

הדמיה של מסכי החיים של הקרינה הפלואורסצנטית, כימות ומבדיל את נטיות הצבירה של חלבונים בחיים, הזדקנות, והדגיש מודלים של מחלות C.

Abstract

סיבים עמילואיד קשורים מספר מחלות ניווניות כגון הנטינגטון, פרקינסון, או אלצהיימר. העמילואיד הללו יכול להתאים חלבונים אנדוגניים, כמו גם רכיבים של רשת פרוטאוסטזיס (PN) ובכך להחריף את החלבון misfolding בתא. יש מספר מוגבל של כלים הזמינים כדי להעריך את תהליך הצבירה של חלבונים עמילואיד בתוך בעל חיים. אנו מציגים פרוטוקול עבור מיקרוסקופ לכל החיים של הזריחה (FLIM) המאפשר ניטור כמו גם כימות של העמילואיד בתאים ספציפיים, כגון נוירונים, בצורה לא פולשנית ועם ההתקדמות של הזדקנות על הפרטורציה של PN. FLIM אינה תלויה ברמות הביטוי של הפלואורוופפור ומאפשרת ניתוח של תהליך הצבירה ללא כתמים או הלבנה נוספים. Fluorophores הם מורהים כאשר הם בקרבת מבנים עמילואיד, אשר גורמת לירידה של תקופת החיים הפלואורסצנטית. הקוצ'ינג מתואם ישירות לצבירת חלבון ה-עמילואיד. FLIM היא טכניקה רב-תכליתית שניתן להחיל כדי להשוות את תהליך fibrilization של חלבונים עמילואיד שונים, גירויים סביבתיים, או רקע גנטי vivo באופן לא פולשני.

Introduction

צבירת חלבונים מתרחשת הן בהזדקנות והן במחלה. המסלולים להוביל היווצרות והתצהיר של amyloids גדול או אמורפיות קשה לעקוב אחר הקינטיקה שלהם הם דומים מאתגרת לפענח. חלבונים יכול להטעות בשל מוטציות פנימיות בתוך רצפי הקידוד שלהם, כמו במקרה של מחלות גנטיות. חלבונים גם misfold כי הרשת פרוטאוסטזיס (PN) שמשאיר אותם מסיסים ומקופל כראוי הוא לקוי, כפי שקורה במהלך ההזדקנות. ה-PN כולל מלווים מולקולריים וmachineries השפלה והוא אחראי על ביוגנזה, קיפול, סחר והשפלה של חלבונים¹.

ג. אלגיה התפתחה כמודל לחקר הזדקנות ומחלות בשל תוחלת החיים הקצרה שלה, הטבע האיזוגני וקלות התפעול הגנטי. מספר זנים של C. אלגיה המבטאים את החלבונים הגורמים למחלות אנושיות ברקמות פגיעות נוצרו. חשוב מכך, רבים מבין הזנים המכילים חלבונים הנוטים לצבור לכידה של סימן ההיכר של הפרעות עמילואיד, היווצרות של הכללות גדולות. הודות לגוף השקוף של ה-"אלאלגיה" , ניתן לדמיין את האגרגטים האלה בvivo, באופן בלתי פולשני ובלתי מורגש². יצירת חלבון כלשהו של עניין (פוי) ב פיוז ' ן עם fluorophore מאפשר לחקור את מיקומם, סחר, אינטראקציה ברשת, והגורל הכללי.

אנו מציגים פרוטוקול לנטר את צבירת החלבונים הגורמים למחלות בחיים ובהזדקנות באמצעות מיקרוסקופהדמיה מתקופת החיים הפלואורסצנטית (flim). FLIM היא טכניקה רבת עוצמה המבוססת על החיים של fluorophore ולא ספקטרום הפליטה שלה. החיים (טאו, τ) מוגדר כזמן הממוצע הנדרש על ידי פוטון להירקב מהמצב הנרגש שלו בחזרה למדינה הקרקע שלה. תקופת החיים של מולקולה נתונה מחושבת עם טכניקת הזמן-תחום של מתאם הפוטון בודד הזמן (TCSPC). ב TCSPC-FLIM, הפונקציה ריקבון פלורסנט מושגת על ידי מרגש fluorophore עם קצר, בתדר גבוה פולסים לייזר ומדידת זמני הגעתו של פוטון הנפלט גלאי ביחס לפולסים. בעת סריקת דוגמה, נוצר מערך נתונים תלת-מימדי עבור כל פיקסל: המערך כולל מידע על התפלגות הפוטונים בקואורדינטות x, y מרחבית ועקומת הדעיכה שלהם. דוגמה נתונה הופכת למפת תקופות חיים החושפת מידע על מבנה החלבון, הכריכה והסביבה^3,4. כל חלבון פלורסנט בעל חיים מהותיים ומוגדרים בדיוק, בדרך כלל של כמה ננושניות (ns), התלויים במאפיינים הפיזיוכימיים שלו. וחשוב מכך, תקופת החיים של פלואורואופלפור אינה תלויה בריכוז שלה, בעוצמת הפלורסנט ובמתודולוגיה של הדמיה. עם זאת, בתוך מערכת ביולוגית, זה יכול להיות מושפע גורמים סביבתיים כגון pH, טמפרטורה, ריכוזי יונים, רווית חמצן, ואת השותפים אינטראקציה שלה. משך החיים רגיש גם לשינויים ולאוריינטציה פנימיים של המבנה. החדרת פלואורואופלפור ל-פוי גורמת לשינוי בתקופת חייו וכתוצאה מכך מידע על התנהגות החלבון התמזגו. כאשר fluorophore מוקף או כפוף בסביבה מאוגד היטב, כגון גיליונות בטא אנטי מקבילי של מבנה עמילואיד, הוא מאבד את האנרגיה בלתי-קרינה, תהליך המכונה מקוצ'ינג⁵. קוצ'ינג של fluorophore תוצאות קיצור של החיים לכאורה שלה. כאשר מסיסים, חיי החלבון יישארו קרובים יותר לערך המקורי, הגבוה יותר. לעומת זאת, כאשר חלבון מתחיל לצבור, החיים שלו באופן בלתי נמנע משתנה לערך נמוך יותר^6,7. לכן, ניתן לנטר את הנטייה של הצבירה של כל חלבון היוצר עמילואיד בגילאים שונים בחיים C. אלגיה.

כאן אנו מתארים פרוטוקול לנתח את הצבירה של חלבון היתוך המורכב polyglutamine שונים (הקאג, Q) מותח (Q40, Q44, ו Q85). אנו ממחישים כיצד ניתן ליישם את הטכניקה באופן שווה לצבעים שונים, כגון חלבון פלורסנט כחול (CFP), חלבון פלורסנט צהוב (YFP) ו חלבון פלורסנט monomeric (mRFP); ובכל הרקמות של הג, כולל הנוירונים, השרירים והמעיים. יתר על כן, בהקשר של פרוטאוסטזיס, FLIM הוא כלי שימושי מאוד להתבונן שינויים על דלדול של מלווים מולקולריים. הורסים את אחד מהמלווים המולקולריים המרכזיים, חלבון הלם חום 1 (hsp-1), באמצעות הפרעות RNA מפיקה חוסר מוקדמות של חלבונים. הגידול בעומס מצבור כתוצאה של הזדקנות, מחלות או מלווים לקויה, נמדד אז כירידה בחיים הפלואורסצנטית.

Protocol

1. סנכרון הג

1. סינכרון C. אלגיה או באמצעות הטיפול היפוכלוריט פתרון אלקליין או דרך הנחת ביצה פשוטה עבור 4 h ב 20 ° צ'⁸.
2. לגדול ולתחזק נמטודות ב 20 ° c על הצמיחה נמטודות בינונית (ngm) צלחות שנזרע עם OP50 E. coli על פי הליכים סטנדרטיים⁹. גיל הנמדות עד לשלב או ליום ההתפתחותי המבוקש.
   הערה: בפרוטוקול זה, מבוגרים צעירים מתתמונות ביום 4 והנמטודות הישנים מתתמונות ביום 8 של החיים.

2. RNAi-בתיווך הסתרה של מכונות המלווה באמצעות האכלה

הערה: ביצוע הנוק-אין של חלבון הלם חום 1 (hsp-1) המלווה על ידי הזנת וקטור rnai המקביל ל-נמטודות¹⁰. התקן hsp-1 rnai באמצע התקבל מספריית האנגר (מזהה שיבוט: f26d 10.3).

1. לגדל את HT115 (DE3) E. coli המבטא את הפלבין הראשון rnai-1 במשך 6 h אל הלילה לוריא ברטני (LB) בינונית המכילה 50 μg/mL אמפיצילין.
2. להכין לוחות NGM אגר טריים המכילים איזופרופיל β-D-1-thioגלאוסייד (IPTG; 1 מ"מ) ו אמפיצילין (25 μg/mL) וזרע עם חיידקים hsp-1 rnai. השאירו צלחות יבש לזרז בטמפרטורת החדר עבור 1-3 ימים.
3. המקום ביצים מסונכרן על צלחת sirna ולצאת לבקוע, או למקם נמטודות ולאפשר להטיל ביצים עבור 4 h ב 20 ° c לפני הסרת. הגדל את הנמטודות עד הגיל או השלב הרצויים.
   הערה: הדור השני של נמטודות עשוי להציג פנוטיפ חזק יותר של הנוק-אין. פרוטוקול siRNA והתנאים המתוארים כאן הם כלליים ומותאמים ל- hsp1. RNA הפרעה דרך siRNA של שיבוט ספציפי/גן צריך להיות מותאם וממוטב על ידי משתמש הקצה. חשוב לציין כי לא כל siRNA יש את היעילות זהה, ולכן מומלץ לבדוק את היעילות של הנוק-אין על ידי כימות על ידי כמותית הפוכה התגובה שרשרת פולימראז (RT-qPCR) או כתם המערבי.

3. הכנת שקופיות מיקרוסקופית

1. ביום ההדמיה, התחל בהכנת שקופיות ההדמיה. ממיסים את הצמח ב-ddH₂O בריכוז של 3% (w/v) ולתת מגניב מעט.
2. חותכים את הקצה של טיפ 1 mL ולוקח בערך 200 μL של העלה נמס. פיפטה התעורר על שקופית זכוכית נקייה ומיד מניחים השני על גבי, הימנעות היווצרות של בועות כלשהן. השאר להתייבש ולהסיר בעדינות את מגלשת הזכוכית העליונה. התוצאה היא שקופית זכוכית עם משטח מעלה אפילו היכן הנמטודות יהיה ממוקם.
   הערה: כל שקופית תשמש לתמונה בין 5-10 nematodes. ניתן להכין שקופיות ולאחסנו במשך מספר שעות בתיבת humified, כדי למנוע את התייבשות הצמח.

4. הרכבה על שקופיות מיקרוסקופית

הערה: FLIM דורשת שהנמטודות יהיו ללא קיבוע. בצע שלב זה לאחר הגדרת ההדמיה (למשל, מיקרוסקופים, לייזרים, גלאים) מוכן לשימוש.

1. שימוש בתיל פלטינה לבחור, מקום נמטודות של הגיל הרצוי על לוחית חדשה unseeded ולתת להם לזחול כדי להסיר את עודף חיידקים OP50 מגופם.
2. הכן את תרכובת ההרדמה (נתרן אזיד או levamisole) כדי לשתק את הנמטודה. לשמור על 500 mM נאן₃ מניות בחושך על 4 ° c ולדלל את רענן ddh₂O לריכוז הסופי של 250 mM. אם באמצעות levamisole, לדלל מלאי 20 מ"מ כדי 2 מ"מ פתרון עבודה ב ddH₂O.
   התראה: נתרן עזידה (נאן₃) הוא רעיל מאוד. השתמש בכפפות ובמשקפי מגן ועבוד תחת המכסה המאוורר.
3. עבודה תחת stereomicroscope, המקום 10 μl ירידה של תרכובת הרדמה על כרית agarose בעדינות להעביר 5-10 נמטודות לתוך זה. השתמש בעצת עפעף כדי להפריד את הנמטדות. שמור אותם קרוב ביחד אבל לא לגעת כדי לאפשר לוקליזציה קלה יותר של נמטודות במהלך רכישת תמונה.
4. שכבת בזהירות על הנמדות עם שמיכות. לקחת מדידות בתוך 1 h לאחר ההרכבה.
   הערה: שתי ההרדמה בסופו של דבר יהרגו את הג. הנמטודות חייבים להיות משותק לחלוטין במהלך ההדמיה, מכיוון שמפת החיים מוקלטת מכל פיקסל. כל תנועה של x, הפרמטרים y מונע את הקריאה של החיים באותו פיקסל נרגש.

5. רכישת נתוני FLIM

הערה: בפרוטוקול זה, אורך החיים של הפלואורואופפור נרכש באמצעות שיטת הזמן התחום TCSPC. FLIM דורשת פעימת אור שתיווצר על-ידי הלייזר בקצב חזרה קבוע וקבוע. קצב החזרה משתנה בהתאם לסוג הלייזר וצריך להיות מוכר על ידי המשתמש. מדידות החיים מושגת על ידי גלאים וציוד אלקטרוני המותקנים לצד מיקרוסקופ קונבנציונאלי. בפרוטוקול זה, מדידות מתבצעות על שלושה שונים סריקת לייזר קונפוקלית יקרוסקופים מיקרוסקופ עם גלאים ותוכנה שסופקו על ידי שתי חברות שונות (טבלה של חומרים) לרכישת mrfp, CFP, ו yfp אורך חיים, בהתאמה. בדוק כי המסננים הנכונים של פליטה/עירור נמצאים במקומם ומצמצמים את כל הרקע או המסך לפני שמתחילים. לפני שמתחילים כל ניסוי, ליצור את הפוטויציבות של fluorophore שנבחרו. אם הפלואורופור מלבנה תוך זמן קצר בתוך רקמות נמטודות, זה לא מתאים מדידות flim ב- C...

1. פתח את תוכנת הרכישה של FLIM. התוכנה flim מאפשרת גם שליטה של המיקרוסקופ קונפוקלית וקד. אתר את הכרטיסיה/לחצן כדי לאפשר לפלטי הגלאי להיות זמינים ולחץ על אפשר פלטי מדפסת.
2. השג את פונקציית התגובה של המכשיר (IRF), המתארת את דיוק התזמון של הכיוונון האינסטרומנטלי.
   הערה: יש לבצע שלב זה רצוי לפני טעינת הנמטודות.
   1. אם הוא זמין, הסר את מסנני העירור/פליטה.
   2. מניחים שמיכות ריקות מעל המטרה ולמצוא את פני השטח שלו. הקלט את אות הפיזור שהתקבל מהכיסויים למינימום של 30 s.
      הערה: למשך תקופות חיים של מספר ננושניות, תוכנת הרכישה יכולה להעריך באופן אוטומטי את משמרת ה-IRF. מומלץ תמיד לרכוש מעין IRF.
3. מקם את השקופית עם ה -C. אלגיה הרכוב על הבמה. שימוש בעדשת הגדלה של 10x במצב שידור ומיקום המיקום של הנמטודות בשקופית.
4. הסר את השקופית, העבר את המטרה לעדשת הגדלה של 63 x ויישם את אמצעי הטבילה הנדרש (למשל, שמן). החלף את השקופית על הבמה והחלק את הנמטודות.
5. אתר את מנהל Pinhole בתוכנת הרכישה ופתח אותה למקסימום. התחל לסרוק את המדגם, בחר אזור מעניין (למשל, ראש, גוף עליון) והתמקד במישור ההקרנה המירבי שלו.
6. נטר את קצב הדופק של הלייזר ואת שלושת הערכים האחרים הקיימים בממשק של התוכנה: מבדיל השבר הקבוע (CFD), הזמן לשרעת (TAC), והממיר האנלוגי לדיגיטלי (ADC).
   הערה: לייזר צריך שער מקסימלי של 1 x 10⁸ הפוטון בודד. מספר זה מייצג את המספר המירבי של פוטונים שסופקו על-ידי הלייזר. CFD מספק מידע על קבלת פולס פוטון יחיד בהתייחסות לפעימת לייזר על ידי הגלאי. ערך זה אמור להיות בערך 1 x 10⁵. . והדופק הבא של הלייזר לבסוף, ה-ADC ממיר את מתח ה-TAC לזיכרון שניתן לשדר¹¹. CFD, TAC, ו-ADC צריך להיות לכולם ערכים דומים כדי להבטיח כי פוטונים הנפלטים על ידי fluorophore לא יאבדו. הערכה נכונה של פרמטרים אלה מבטיחה כי מספיק פוטונים נאספים כדי ליצור מפת חיים מדויקת.
7. בממשק של התוכנה FLIM, תצוגה מקדימה של מספר הפוטונים שאותרו: ערך ADC צריך להיות בין 1 x 10⁴ ו-1 x 10⁵. אם יש צורך, להעביר את המוקד על מישור אחר או להגדיל את כוח הלייזר כדי לאסוף פוטונים יותר.
   הערה: באופן כללי, מספר הפוטונים הנרשמים לשנייה אינו עולה על 1% מקצב החזרה של הלייזר.
8. בשורת התפריטים, בחר את הכרטיסיה כדי להגדיר את פרמטרי הרכישה. בחר ' סרוק סינכרון ' כדי לאפשר זיהוי פוטון בודד.
9. הגדר את הרכישה לפרק זמן קבוע או למספר קבוע של פוטונים. לדוגמה, לרכוש עקומת ריקבון לכל החיים עבור 2 דקות או עד שפיקסל אחד מגיע לספירת פוטון של 2,000 אירועים בודדים. לחץ על התחל כדי להתחיל ברכישה.
   הערה: fluorophores שונים ידרוש עירור שונים לייזרים פליטה ומסננים. על פי הבהירות של המדגם, כוח הלייזר יכול להיות גם מותאם, אשר לא יפריעו החיים. פרוטוקולים אלה משתמשים בהגדרות עירור/פליטה הבאות: YFP ex500/em520-50 ננומטר, mRFP ex561/em580-620 nm. לייזר פוטונים פעמו שני היה מועסק עבור מדידות CFP באמצעות ex800/em440 nm. כמות הזמן וספירת הפוטונים הנדרשים לרכישת מפת FLIM צריכה להיות מבוססת במידה מדעית עבור כל הגדרה וכל מטרה ניסיונית.

6. ניתוח נתוני FLIM באמצעות תוכנת FLIMfit

הערה: בצע ניתוח נתונים באמצעות כלי התוכנה FLIMfit שפותחה באימפריאל קולג '¹² (ראה איור 1).

1. פתח את התוכנה ויבא קבצי נתונים של FLIM באמצעות הקובץ | טעינת נתוני FLIM. טען את כל הדגימות מתנאי אחד, גם אם התקבל בהפעלות שונות ומחזרה ביולוגית שונה.
2. במידת הצורך, מחלקים נמטודה בודדת מכל תמונה FLIM באמצעות פילוח | פילוח מנהל. גררו את כלי החיתוך מסביב לאזור העניינים עד שיסומן. לאחר השלמתו, לחץ על אישור.
   הערה: יש לבצע פילוח עבור כל התמונות.
3. בחר אזור קטן שבו התמונה מבוססת העוצמה של C. אלגיה מופיעה (איור 1, חיצים 1). עקומת הדעיכה של אזור זה תופיע בחלון הריקבון הגדול בצד הימני של הממשק (איור 1, חץ 2).
   הערה: ניתן להציג את הדעיכה בצורה לינארית או עברו וגריתמית.
4. הגדר את הפרמטרים הנכונים כדי להסיק את משך החיים דרך האלגוריתם של התוכנה כמתואר בשלבים 6.5-6.8.
5. בכרטיסיה נתונים (איור 1, חץ 3):
   1. הגדר ערך מינימום משולב שרירותי כדי שלא לכלול פיקסלים שאינם עמומים מדי כדי ליצור התאמה טובה. בהתאם לדגם C. אלגיה , ערך זה משתנה מ-40-300. קלט ערכים שונים עד להשגת תצוגה מקדימה משביעת רצון.
   2. בחר באפשרות מינימום ומספר מירבי של זמן כדי להגביל את האות flim לערכים אלה. כל האירועים המופיעים לפני ואחרי הסף הזה לא ייכללו.
      הערה: לדוגמה, לניתוח של mRFP, האירועים לפני 800 ps ולאחר 4,000 ps לא נכללו. ערכים אלה תלויים באורך החיים של fluorophore וצריך להיקבע על ידי משתמש הקצה.
   3. אין לשנות את הסעיפים המוגדרים מראש /פוטון של 1.
   4. להזין את קצב החזרה, ב MHz, של הלייזר מנוצל במהלך הרכישה.
      הערה: עבור הפרוטוקול הנוכחי, לייזרים שונים היו מנוצלים עם שיעורי חזרה שונים. שני לייזר פוטון המשמש לרכישת תקופות חיים של CFP יש שיעור חזרה של 80 MHz, עבור YFP לייזר חוזר על 40 MHz, ו-mRFP הערך הוא 78.01 MHz. ערכים אלה הFLIMfit בהתאם למדגם.
   5. קלט ערך מירבי של שער כדי שלא יכלול את כל הפיקסלים הרוויים.
      הערה: עבור מדידות לכל החיים ב -C. אלגיה, ערך זה מוגדר לכל מספר גדול (לדוגמה, 1 x 10⁸).
6. בכרטיסיה ' חיים ', בחר התאמה כללית לשימוש (לדוגמה, התאמה מחוכמת פיקסל). ראה איור 1, חץ 4.
   הערה: התאמה מחוכמת פיקסל תפיק ריקבון מותאם לכל פיקסל בודד. תמונה- התאמה נבונה תפיק התאמה גלובלית של כל תמונה בודדת ותציג ערך חיים בודד לכל תמונה. התאמה גלובלית ומתאימה תפיק התאמה אחת בכל קבוצת הנתונים. ערך של תקופת חיים בודדת מסופק עבור כל התמונות.
7. אל תשנה פרמטר אחר פרט ל -No. Exp בחירה אם ידוע כי ריקבון הקרינה הנבחר הוא רב מעריכי ומציג יותר מאשר תקופת חיים אחת.
   הערה: בפרוטוקול הנוכחי, פונקציה זו הייתה מנוצל כדי לחשב את משך החיים של ה-מעריכי הביואקספוננציאלי של CFP fluorophore.
8. העלה את ה-IRF באמצעות תפריט IRF: irf | טען את IRF. כדי להעריך את התזוזה של IRF, בחר irf | הערכת משמרת IRF. קבוצת ערכים תופיע באופן אוטומטי בכרטיסיה Irf . לאחר הקמת הפעולה, אל תשנה פרמטרים אחרים של כרטיסיה זו.
9. לאחר הגדרת כל הפרמטרים, לחץ על התאם ערכת נתונים (איור 1, חץ 5). האלגוריתם יפיק התאמה לעקומת ריקבון וליצור ערך לכל החיים עבור כל תמונה.
   הערה: ההתאמה המתקבלת, המסומנת בקו כחול, צריכה לחפוף את כל האירועים. התאמה טובה מתקבלת כאשר כל האירועים מיושרים לאורך ההתאמה.
10. לחץ על הכרטיסיה פרמטרים (איור 1, חץ 6), הממוקם בתוך התפריטים הימניים העליונים של ממשק התוכנה ובחר סטטיסטיקה: w_mean (ממוצע משוקלל) ובדוק שהערך chi2 קרוב ככל האפשר ל-1.
    הערה: A chi2 קרוב לאחד מבטיח את הדיוק של ההתאמה. ערך תקופת החיים של התמונה שנבחרה יתגלה כtau_1.
11. יצא כל מידע מעניין: קובץ | ייצוא עוצמה תמונות/התאמה הטבלה התוצאה/תמונות/היסטגרמות. שמור את הגדרות הנתונים המשמשות לחישוב משך החיים: קובץ | שמירת הגדרות נתונים.
    הערה: הפרמטרים המועסקים יישמרו לניתוח עתידי של הדגימות שנבחרו.

7. ייצוגים גרפיים של נתוני FLIM

הערה: ניתן לייצג את משך החיים שנאסף מדגימות שונות בדרכים שונות. בחר באפשרות זו כדי לציין את ערכי משך החיים בננו-שניות או ב-picoseconds ניות.

1. הצג את איכות ההתאמה ואת דיוק העקומה על-ידי ייצוא עקומת הריקבון ישירות מ-FLIMfit.
2. מייצגים את התפלגות הפוטונים על ידי התוויית התדירות של ספירת פוטון לעומת ערך החיים בהיסטוגרמה.
3. לבסוף, לצורך השוואה סטטיסטית, אם השוואת שני דגימות או יותר, הצב ערכי חיים בתוספת סטיית תקן של הממוצע בגרף של שורת התוויה של פיזור. בצע כל ניתוח סטטיסטי רצוי.

תוצאות

הפרוטוקול מראה כיצד לפקח באופן מדויק על היווצרות מינים צבורים בתוך החיים,הן במהלך ההזדקנות הטבעית וכאשר הם חשופים ללחץ. בחרנו ארבעה זנים שונים של נמטודות המבטא חלבונים polyglutamine של או 40q, 44q, או 85 q חוזר על עצמו. חלבונים אלה מסונתז ברקמות שונות התמזגו fluorophores שונים. ה -C. ?...

Discussion

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר טכניקה מבוססת-מיקרוסקופית לזיהוי מינים צבורים במערכת המודל של C. אלגיה . FLIM יכולה לאפיין במדויק את הנוכחות של מינים צבורים ומסיסים התמזגו לפלואורופור באמצעות מדידה של תקופת החיים הפלואורסצנטית שלהם. כאשר חלבון היתוך מתחיל לצבור חיים ממוצע מוקלט שלה יעבור מגב...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-Agar Kobe I	Carl Roth GmbH + Co. KG	5210.2	NGM component
Ahringer Library hsp-1 siRNA	Source BioScience UK Limited	F26D10.3
Ampicillin	Carl Roth GmbH + Co. KG	K029.3	Antibiotic
B&H DCS-120 SPC-150	Becker & Hickl GmbH		FLIM Aquisition software
B&H SPC830-SPC Image	Becker & Hickl GmbH		FLIM Aquisition software
BD Bacto Peptone	BD-Bionsciences	211677	NGM component
C. elegans iQ44-YFP	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OG412
C. elegans iQ85-YFP			Kind gift from Morimoto Lab
C. elegans mQ40-RFP			Kind gift from Morimoto Lab
C. elegans nQ40-CFP			Kind gift from Morimoto Lab
Deckgläser-18x18mm	Carl Roth GmbH + Co. KG	0657.2	Cover slips
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)	Carl Roth GmbH + Co. KG	2316.4
Leica M165 FC	Leica Camera AG		Mounting Stereomicroscope
Leica TCS SP5	Leica Camera AG		Confocal Microscope
Levamisole Hydrochloride	AppliChem GmbH	A4341	Anesthetic
OP50 Escherichia coli	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OP50
PicoQuant PicoHarp300	PicoQuant GmbH		FLIM Aquisition software
Sodium Azide	Carl Roth GmbH + Co. KG	K305.1	Anesthetic
Sodium Chloride	Carl Roth GmbH + Co. KG	3957.2	NGM component
Standard-Objektträger	Carl Roth GmbH + Co. KG	0656.1	Glass slides
Universal Agarose	Bio & Sell GmbH	BS20.46.500
Zeiss AxioObserver.Z1	Carl Zeiss AG		Confocal Microscope
Zeiss LSM510-Meta NLO	Carl Zeiss AG		Confocal Microscope