Характеристика амилоидных структур в старении C. Elegans использованием флуоресценции пожизненной визуализации

Резюме

Флуоресценция жизни визуализации мониторов, количественно и отличает агрегации тенденции белков в жизни, старение, и подчеркнул C. elegans модели болезни.

Аннотация

Амилоидные фибрилки связаны с рядом нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Гентингтона, Паркинсона или болезнь Альцгеймера. Эти амилоидные фибриллы могут секвестировать эндогенные метастабильные белки, а также компоненты сети протеостаза (PN) и тем самым усугубить неправильное сворачивание белка в клетке. Существует ограниченное количество инструментов для оценки процесса амилоидных белков в животном. Мы представляем протокол для флуоресценции жизни микроскопии (FLIM), что позволяет контролировать, а также количественноать амилоидной фибрилизации в конкретных клетках, таких как нейроны, в неинвазивной образом и с прогрессированием старения и при возмущении PN. FLIM не зависит от уровня экспрессии фторофора и позволяет анализпроцесса агрегации без каких-либо дальнейших окрашивания или отбеливания. Флюорофоры угасают, когда они находятся в непосредственной близости от амилоидных структур, что приводит к снижению срока службы флуоресценции. Закалка напрямую коррелирует с агрегацией амилоидного белка. FLIM является универсальным методом, который может быть применен для сравнения процесса фибрилизации различных амилоидных белков, экологических стимулов, или генетических фонов in vivo в неинвазивной манере.

Введение

Агрегация белка происходит как при старении, так и при заболеваниях. Пути, которые приводят к образованию и осаждению крупных амилоидов или аморфных включений трудно следовать и их кинетика также сложно разгадать. Белки могут неправильно сложиться из-за внутренних мутаций в их последовательности кодирования, как и в случае генетических заболеваний. Белки также неправильно, потому что протеостаз сети (PN), что держит их растворимыми и правильно сложены нарушается, как это происходит во время старения. PN включает в себя молекулярные сопровождающие и машины деградации и отвечает за биогенез, складные, торговые и деградации белков¹.

C. elegans стала моделью для изучения старения и болезней из-за его короткой продолжительности жизни, изогенной природы и простоты генетических манипуляций. Было создано несколько трансгенных штаммов C. elegans, которые выражают белки, вызывающие болезни человека, в уязвимых тканях. Важно отметить, что многие штаммы, содержащие агрегации подверженных белков резюме отличительной чертой амилоидных расстройств, формирование крупных включений. Благодаря прозрачному телу C. elegans, эти агрегаты могут быть визуализированы in vivo, неинвазивно и неразрушительно². Генерация любого белка, представляющих интерес (POI) в синтезе с фторфором позволяет исследовать его местоположение, торговлю людьми, сеть взаимодействия и общую судьбу.

Мы представляем протокол для мониторинга агрегации болезнетворных белков в жизни и старения C. elegans с помощью флуоресценции визуализации микроскопии (FLIM). FLIM является мощным методом, основанным на жизни фторфора, а не его спектры выбросов. Срок службы (тау, ) определяется как среднее время, требуемое фотоном для распада от возбужденного состояния обратно в его наземное состояние. Срок службы данной молекулы рассчитывается с помощью метода временной домены учета одного фотона (TCSPC). В TCSPC-FLIM функция флуоресцентного распада получается путем захватывающих флюорофора с короткими, высокочастотными лазерными импульсами и измерения времени прибытия испускаемого фотона на детектор по отношению к импульсам. При сканировании образца для каждого пикселя создается трехмерный массив данных: массив содержит информацию о распределении фотонов в их x,y пространственных координатах и кривой временного распада. Таким образом, данный образец становится картой жизней, раскрывающей информацию о структуре белка, связывании и окружающей среде^3,,4. Каждый флуоресцентный белок обладает внутренней и точно определенной продолжительности жизни, как правило, в несколько наносекунд (нс), в зависимости от его физиохимических свойств. Важно отметить, что срок службы флюорофора не зависит от его концентрации, флуоресцентной интенсивности и методологии визуализации. Тем не менее, в биологической системе, это может быть влияние экологических факторов, таких как рН, температура, концентрации ионов, насыщение кислородом, и его партнеров взаимодействия. Сроки службы также чувствительны к внутренним структурным изменениям и ориентации. Слияние фторофора с POI приводит к изменению в его жизни и, следовательно, информация о поведении слитого белка. Когда фторофор окружен или инкапсулирован в плотно связанной среде, такой как антипараллельные бета-листы амилоидной структуры, он теряет энергию нерадиационно, процесс, известный как закалка⁵. Утоления фторофора приводит к сокращению его очевидной жизни. Когда растворимый, срок службы белка будет оставаться ближе к его первоначальной, более высокой стоимости. В отличие от этого, когда белок начинает агрегироваться, его срок службы неизбежно перейдет к более низкому значению^6,,7. Таким образом, становится возможным контролировать склонность к агрегации любого амилоидного белка в разном возрасте в живых C. elegans.

Здесь мы описываем протокол для анализа агрегации белка синтеза, состоящего из различных полиглютамин (CAG, No) тянется (No40, No 44, и No 85). Мы иллюстрируем, как этот метод может быть применен в равной степени к различным флуоророромам, таким как циановый флуоресцентный белок (CFP), желтый флуоресцентный белок (YFP) и мономерный красный флуоресцентный белок (mRFP); и во всех тканях C. elegans, включая нейроны, мышцы и кишечник. Кроме того, в контексте протеостаза, FLIM является очень полезным инструментом для наблюдения за изменениями при истощении молекулярных сопровождающих. Сбив ая расшатывание одного из ключевых молекулярных сопровождающих, белок теплового шока 1(hsp-1),с помощью РНК-интерференции производит преждевременное искажение белков. Увеличение нагрузки агрегации в результате старения, болезни или дефицита сопровождающих, затем измеряется как снижение продолжительности жизни флуоресценции.

протокол

1. Синхронизация C. elegans

1. Синхронизируйте C. elegans либо с помощью щелочной гипохлоритной обработки раствора, либо с помощью простого откладывания яйцеклеток в течение 4 ч при 20 градусах По цельсии^8.
2. Выращивайте и поддерживайте нематоды при 20 градусах по Цельсию на пластинах роста нематод (NGM), посеянных с помощью OP50 E. coli в соответствии со стандартными процедурами⁹. Возраст нематод до желаемой стадии развития или день.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе, молодые взрослые изображены на 4-й день и старые нематоды изображены на 8-й день жизни.

2. РНК-опосредованный нокдаун сопровождающего оборудования через кормление

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните нокдаун белка теплового шока 1(hsp-1) сопровождающего путем кормления соответствующего вектора РНК нематодами¹⁰. Плазмида hsp-1 RNAi была получена из библиотеки Ahringer (клон ID: F26D10.3).

1. Расти HT115 (DE3) E. coli выражая hsp-1 РНК-1 РНК плазмид для 6 ч на ночь в Лурия Бертани (LB) среды, содержащей 50 мкг /мл ампициллин.
2. Приготовьте свежие агарные пластины NGM, содержащие изопропил-Д-1-тиогалактопиранозид (IPTG; 1 мМ) и ампициллин (25 мкг/мл) и семена с бактериями hsp-1 РНК. Оставьте тарелки высохнуть и вызвать при комнатной температуре в течение 1-3 дней.
3. Поместите синхронизированные яйца на тарелку siRNA и оставьте люк, или место gravid нематод и позволяют откладывать яйца в течение 4 ч при 20 градусах Цельсия, прежде чем удалить. Выращивайте нематоды до желаемого возраста или стадии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Второе поколение нематод может представить более сильный фенотип нокдауна. Протокол siRNA и описанные здесь условия являются общими и адаптированы к hsp1. РНК-интерференция через siRNA конкретного клона/гена должна быть установлена и оптимизирована конечным пользователем. Важно отметить, что не все siRNA имеют одинаковую эффективность, и поэтому рекомендуется проверить эффективность нокдауна путем количественной обратной транскрипции цепной реакции (RT-qPCR) или западной подись.

3. Подготовка слайдов микроскопии

1. В день визуализации начните с подготовки слайдов изображений. Растопить агарозу в ddH₂O при концентрации 3% (w/v) и немного остыть.
2. Вырежьте кончик наконечника пипетки 1 мл и примите примерно 200 л расплавленной агарозы. Пипетка агароуз на чистую стеклянную горку и сразу же поместите второй на вершине, избегая образования любых пузырьков. Оставьте высохнуть и аккуратно снимите верхнюю стеклянную горку. Результатом является стеклянная горка с ровной поверхностью агарозы, где будут расположены нематоды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый слайд будет использоваться для изображения между 5-10 нематод. Слайды могут быть подготовлены и храниться в течение нескольких часов в humified поле, чтобы предотвратить агарозу от высыхания.

4. Установка нематод на микроскопии слайды

ПРИМЕЧАНИЕ: FLIM требует, чтобы нематод были обездвижены. Выполните этот шаг после установки изображений (например, микроскопы, лазеры, детекторы) будет готово к использованию.

1. Используя платиновый выбор проволоки, место нематод желаемого возраста на свежие unseeded пластины и дайте им ползать, чтобы удалить избыток бактерий OP50 из их тела.
2. Приготовьте обезболеватое соединение (азид натрия или левамизол) для обездвиживания нематод. Держите 500 мМ NaN₃ в темноте при 4 градусах Цельсия и разбавьте в свежем ddH₂O до конечной концентрации 250 мМ. При использовании левамизола разбавьте 20 мМ бульона до 2 мМ рабочего раствора в ddH₂O.
   ВНИМАНИЕ: Азид натрия (NaN₃) является высокотоксичным. Используйте перчатки и защитные очки и работайте под вентилируемым капюшоном.
3. Работая под стереомикроскопом, поместите 10 л капли анестетика на агарозную площадку и аккуратно перенесите в нее 5-10 нематод. Используйте наконечник ресниц, чтобы отделить нематод. Держите их близко друг к другу, но не касаясь, чтобы обеспечить более легкую локализацию нематод во время приобретения изображения.
4. Тщательно наложить нематод с крышкой. Проведите измерения в течение 1 ч после монтажа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оба анестезии в конечном итоге убить C. elegans. Нематоды должны быть полностью неподвижными во время визуализации, так как карта жизни записывается с каждого пикселя. Любое движение параметров x,y предотвращает чтение жизни в том же возбужденном пикселе.

5. Приобретение данных FLIM

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе срок службы фторофора приобретается с помощью метода TCSPC. FLIM требует импульса света, который будет генерироваться лазером с установленной скоростью и постоянной скоростью повторения. Скорость повторения варьируется в зависимости от типа лазера и должна быть известна пользователю. Пожизненные измерения достигаются детекторами и электронным оборудованием, установленным рядом с обычным микроскопом. В этом протоколе, измерения выполняются на трех различных лазерных сканирования конфокальных микроскопов с детекторами и программное обеспечение, предоставляемые двумя различными компаниями(Таблица материалов) для приобретения mRFP, CFP, и YFP жизни, соответственно. Убедитесь, что правильные фильтры выбросов / возбуждения на месте и свести к минимуму любой фон или мониторинг подсветки перед запуском. Перед началом любого эксперимента установите фотостабильность выбранного фторофора. Если фторофор отключит в течение короткого времени в нематод тканях, он не подходит для измерений FLIM в C. elegans.

1. Откройте программное обеспечение для приобретения FLIM. Программное обеспечение FLIM также позволяет управлять конфокальный микроскоп. Найдите вкладку/кнопку, чтобы можно было включить выходы детектора и нажмите на выводы включить.
2. Приобретите функцию реакции инструмента (IRF), которая описывает точность синхронизации инструментальной установки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен предпочтительно перед монтажом нематод.
   1. При наличии, удалите фильтры возбуждения/выброса.
   2. Поместите пустой покрывало над целью и найдите ее поверхность. Запись рассеяния сигнала, полученного от крышки как минимум 30 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В течение нескольких наносекунд программное обеспечение приобретения может автоматически оценивать сдвиг IRF. Приобретение IRF всегда рекомендуется.
3. Поместите горку с установленными C. elegans на сцене. Использование 10-раз увеличенного объектива в режиме передачи и локализовать положение нематод на слайде.
4. Удалите слайд, переключите цель на объектив увеличения 63x и нанесите требуемую среду погружения (например, масло). Замените горку на сцене и локализуйте нематоды.
5. Найдите Pinhole Manager на программном обеспечении для приобретения и откройте его для максимального. Начните сканирование образца, выберите интересуемую область (например, головка, верхняя часть тела) и сосредоточьтесь на максимальной плоскости проекции.
6. Мониторинг частоты лазерного импульса и трех других значений, присутствующих на интерфейсе программного обеспечения: Постоянный дискриминатор фракции (CFD), Время к амплитуде (TAC), и Аналог-к-цифровой конвертер (ADC).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Лазер должен иметь максимальный ворота 1 х 10⁸ одного фотона рассчитывает. Это число представляет собой максимальное количество фотонов, поставляемых лазером. CFD предоставляет информацию о получении одного фотонный импульс со ссылкой на лазерный импульс детектором. Это значение должно быть примерно 1 х 10⁵. TAC различает время обнаружения одного фотона и следующий лазерный импульс. Наконец, ADC преобразует напряжение TAC в сигнал памяти^11. CFD, TAC и ADC должны иметь одинаковые значения, чтобы гарантировать, что фотоны, испускаемые флюорофором, не теряются. Правильная оценка этих параметров гарантирует, что достаточно фотонов собирается для создания точной карты жизни.
7. На интерфейсе программного обеспечения FLIM просмотрите количество обнаруженных фотонов: значение ADC должно быть между 1 x 10⁴ и 1 x 10^5. При необходимости сместите фокус на другую плоскость или увеличьте мощность лазера для сбора большего количества фотонов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, количество записанных фотонов в секунду не должно превышать 1% от частоты повторения лазера.
8. В панели меню выберите вкладку для настройки параметров приобретения. Выберите синхронизацию сканирования, чтобы обеспечить обнаружение одного фотона.
9. Установите приобретение на фиксированное количество времени или фиксированное количество фотонов. Например, приобрести кривую распада жизни в течение 2 минут или до тех пор, пока один пиксель не достигнет количества фотонов в 2000 одиночных событий. Нажмите Начать, чтобы начать приобретение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Различные фторофоры потребует различных возбуждения и выбросов лазеров и фильтров. В соответствии с яркостью образца, лазерная мощность также может быть скорректирована, что не будет мешать жизни. В этих протоколах используются следующие параметры возбуждения/выбросов: YFP ex500/em520-50 nm, mRFP ex561/em580-620 nm. Импульсный двухсотливый фотонный лазер был использован для измерений CFP с использованием ex800/em440 нм. Количество времени и количество фотонов, необходимое для приобретения карты FLIM, должно быть эмпирически установлено для каждой установки и каждой экспериментальной цели.

6. Анализ данных FLIM с использованием программного обеспечения FLIMfit

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните анализ данных с помощью программного инструмента FLIMfit, разработанного в Имперском колледже^{Лондона 12} (см. рисунок 1).

1. Откройте программное обеспечение и импортируйте файлы данных FLIM через файл Загрузите данные FLIM. Загрузите все образцы от одного состояния, даже если получены в разных сеансах и из разных биологических повторов.
2. При необходимости отведать один нематод из любой фотографии FLIM через сегментацию Менеджер сегментации. Перетащите инструмент обрезки вокруг области интереса, пока он не выделен. После завершения, нажмите OK.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сегментация должна быть сделана для всех изображений.
3. Выберите небольшой регион, где появляется изображение C. elegans на основе интенсивности(рисунок 1, Стрелки 1). Кривая распада этой области появится в большом окне распада на правой стороне интерфейса(рисунок 1, Стрелка 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Распад может отображаться линейно или logarithmically.
4. Установите правильные параметры для экстраполирования срока службы с помощью алгоритма программного обеспечения, описанного в шагах 6.5-6.8.
5. На вкладке данных (рисунок 1, Стрелка 3):
   1. Установите произвольное интегрированное минимальное значение, чтобы исключить любые пиксели, которые слишком тусклые, чтобы произвести хорошую посадку. В зависимости от образца C. elegans это значение варьируется от 40-300. Ввод различных значений до удовлетворительного предварительного просмотра не будет достигнут.
   2. Выберите номер Time Min и Time Max, чтобы ограничить сигнал FLIM этими значениями. Все события, которые появляются до и после этого порога, будут исключены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, для анализа mRFP, события до 800 ps и после 4000 ps были исключены. Эти значения зависят от продолжительности жизни флюорофора и должны определяться конечным пользователем.
   3. Не изменяйте предустановленные графы/Фотон 1.
   4. Ввешай частоту повторения,в МГц, лазера, использованного во время приобретения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для текущего протокола, различные лазеры были использованы с различными показателями повторения. Два фотона лазера, используемых для приобретения CFP жизни обладает скоростью повторения 80 МГц, для YFP лазер повторяется на 40 МГц, а для mRFP значение 78,01 МГц. Эти значения были введены в FLIMfit в соответствии с проанализированным образцом.
   5. Ввечёте значение Gate Max, чтобы исключить все насыщенные пиксели.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерений продолжительности жизни в C. elegans, это значение устанавливается для любого большого числа (например, 1 х 10⁸).
6. На вкладке Lifetime выберите глобальную примерку для использования (например, примерка с пикселем). См. Рисунок 1, Стрелка 4.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пиксель-мудрый фиттинг будет производить распада установлены на каждом отдельном пикселе. Установка по образу и образу подобию создаст глобальную установку каждого отдельного изображения и отобразит одно значение жизни на изображение. Глобально-мудрый фиттинг будет производить одну установку по всему набору данных. Для всех изображений предусмотрено единое значение продолжительности жизни.
7. Не изменяйте другой параметр, за исключением Но. Exp выбор, если известно, что выбранный распад флуоресценции является многоэкспоненциальным и экспонатов более одной жизни.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем протоколе эта функция была использована для расчета продолжительности жизни двухэкспопоненциального фторофора CFP.
8. Загрузите IRF через меню IRF: IRF Нагрузка IRF. Для оценки смены IRF выберите IRF Оценка IRF Shift. Набор значений будет автоматически отображаться на вкладке IRF. Как только это установлено, не изменяйте никаких других параметров этой вкладки.
9. После установки всех параметров нажмите Fit Dataset (рисунок 1, Стрелка 5). Алгоритм будет производить подгонку кривой распада и устанавливать значение продолжительности жизни для каждого изображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В результате подходят, подчеркнул в синей линии, должны перекрываться со всеми событиями. Хорошая подгонка получена, когда все события выровнены вдоль припадка.
10. Нажмите на вкладку Параметры (рисунок 1, Стрелка 6), расположенная в правом верхнем виде меню интерфейса программного обеспечения, и выберите Статистику: w_mean (взвешенное среднее) и убедитесь, что значение chi2 максимально приближено к 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: chi2 близко к одному обеспечивает точность пригонки. Таким образом, значение продолжительности жизни выбранного изображения раскрывается как tau_1.
11. Экспорт любой информации, представляющих интерес: Файл Экспорт Интенсивность Изображения / Fit Результат Таблица / Изображения / Гистограммы. Сохраните параметры данных, используемые для расчета продолжительности жизни: Файл Сохранение настроек данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые параметры будут сохранены для дальнейшего анализа выбранных образцов.

7. Графические представления данных FLIM

ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки, собранные из различных образцов, могут быть визуально представлены различными способами. Выберите для обозначения значений продолжительности жизни в наносекундах или пикосекундах.

1. Показать качество подгонки и точность кривой, экспортируя кривую распада непосредственно из FLIMfit.
2. Представлять распределение фотонов путем построения частоты количества фотонов по сравнению со значением продолжительности жизни в гистограмме.
3. Наконец, для статистического сравнения, при сравнении двух или более образцов, место значения продолжительности жизни плюс стандартное отклонение среднего в графике рассеивания участка бар. Выполняйте любой желаемый статистический анализ.

Результаты

Протокол показывает, как точно контролировать формирование агрегированных видов в живых C. elegans,как во время его естественного старения и при воздействии стресса. Мы отобрали четыре различных штамма трансгенных нематод, выражающих полиглутамин белки либо 40 ", 44" и?...

Обсуждение

Представленный здесь протокол описывает метод на основе микроскопии для выявления агрегированных видов в модели системы C. elegans. FLIM может точно охарактеризовать наличие как агрегированных, так и растворимых видов, слитых с фторфором, путем измерения их распада флуоресценции. Когд?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-Agar Kobe I	Carl Roth GmbH + Co. KG	5210.2	NGM component
Ahringer Library hsp-1 siRNA	Source BioScience UK Limited	F26D10.3
Ampicillin	Carl Roth GmbH + Co. KG	K029.3	Antibiotic
B&H DCS-120 SPC-150	Becker & Hickl GmbH		FLIM Aquisition software
B&H SPC830-SPC Image	Becker & Hickl GmbH		FLIM Aquisition software
BD Bacto Peptone	BD-Bionsciences	211677	NGM component
C. elegans iQ44-YFP	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OG412
C. elegans iQ85-YFP			Kind gift from Morimoto Lab
C. elegans mQ40-RFP			Kind gift from Morimoto Lab
C. elegans nQ40-CFP			Kind gift from Morimoto Lab
Deckgläser-18x18mm	Carl Roth GmbH + Co. KG	0657.2	Cover slips
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)	Carl Roth GmbH + Co. KG	2316.4
Leica M165 FC	Leica Camera AG		Mounting Stereomicroscope
Leica TCS SP5	Leica Camera AG		Confocal Microscope
Levamisole Hydrochloride	AppliChem GmbH	A4341	Anesthetic
OP50 Escherichia coli	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OP50
PicoQuant PicoHarp300	PicoQuant GmbH		FLIM Aquisition software
Sodium Azide	Carl Roth GmbH + Co. KG	K305.1	Anesthetic
Sodium Chloride	Carl Roth GmbH + Co. KG	3957.2	NGM component
Standard-Objektträger	Carl Roth GmbH + Co. KG	0656.1	Glass slides
Universal Agarose	Bio & Sell GmbH	BS20.46.500
Zeiss AxioObserver.Z1	Carl Zeiss AG		Confocal Microscope
Zeiss LSM510-Meta NLO	Carl Zeiss AG		Confocal Microscope