Caracterização de estruturas amilóides em Envelhecimento C. Elegans usando imagem de fluorescência ao longo da vida

Resumo

A fluorescência de imagens ao longo da vida monitora, quantifica e distingue as tendências de agregação de proteínas em modelos de doença susturais de C. elegans vivos, envelhecidos e estressados.

Resumo

Fibrilas amilóides estão associadas a uma série de doenças neurodegenerativas, como Huntington, Parkinson ou Doença de Alzheimer. Essas fibrilas amilóides podem sequestrar proteínas metastáveis endógenas, bem como componentes da rede de proteotase (PN) e, assim, exacerbar a proteína dobrável na célula. Há um número limitado de ferramentas disponíveis para avaliar o processo de agregação de proteínas amilóides dentro de um animal. Apresentamos um protocolo de microscopia vitalícia de fluorescência (FLIM) que permite o monitoramento, bem como a quantificação da fibrilização amiloide em células específicas, como neurônios, de forma não invasiva e com a progressão do envelhecimento e após perturbação de o PN. FLIM é independente dos níveis de expressão do flúor e permite uma análise do processo de agregação sem qualquer maior coloração ou branqueamento. Fluoróforos são extintos quando estão próximos de estruturas amilóides, o que resulta em uma diminuição da vida útil da fluorescência. A saciedade correlaciona-se diretamente com a agregação da proteína amilóide. FLIM é uma técnica versátil que pode ser aplicada para comparar o processo de fibrilização de diferentes proteínas amilóides, estímulos ambientais ou origens genéticas in vivo de forma não invasiva.

Introdução

A agregação proteica ocorre tanto no envelhecimento quanto na doença. Os caminhos que levam à formação e deposição de grandes amilóides ou inclusões amorfas são difíceis de seguir e seus cinéticos são igualmente desafiadores para desvendar. As proteínas podem se desdobrar devido a mutações intrínsecas dentro de suas sequências de codificação, como no caso de doenças genéticas. As proteínas também se desdobram porque a rede de proteota (PN) que as mantém solúveis e devidamente dobradas é prejudicada, como acontece durante o envelhecimento. A PN inclui acompanhantes moleculares e máquinas de degradação e é responsável pela biogênese, dobramento, tráfico e degradação de proteínas¹.

C. elegans emergiu como um modelo para estudar o envelhecimento e a doença devido à sua curta vida útil, natureza isogênica e facilidade de manipulação genética. Várias cepas transgênicas C. elegans que expressam proteínas causadoras de doenças humanas em tecidos vulneráveis foram criadas. É importante ressaltar que muitas das cepas que contêm proteínas propensas à agregação recapitulam a marca registrada de distúrbios amilóides, a formação de grandes inclusões. Graças ao corpo transparente de C. elegans, esses agregados podem ser visualizados in vivo, não invasiva e não destrutivo². Gerar qualquer proteína de interesse (POI) em fusão com um flúor permite investigar suas localizações, tráfico, rede de interação e destino geral.

Apresentamos um protocolo para monitorar a agregação de proteínas causadoras de doenças em vivos e envelhecimento s c. elegans via fluorescência de imagem ao longo da vida (FLIM). FLIM é uma técnica poderosa baseada na vida de um fluoróforo, em vez de seus espectros de emissão. A vida útil (tau, τ) é definida como o tempo médio exigido por um fóton para decair de seu estado animado de volta ao seu estado terrestre. A vida útil de uma determinada molécula é calculada com a técnica de domínio temporal da contagem de fótons únicos correlacionados com o tempo (TCSPC). No TCSPC-FLIM, a função de decaimento fluorescente é obtida por excitar o fluoróforo com pulsos laser curtos e de alta frequência e medir os tempos de chegada do fóton emitido a um detector em relação aos pulsos. Ao digitalizar uma amostra, um conjunto de dados tridimensional é criado para cada pixel: o array inclui informações sobre a distribuição dos fótons em suas coordenadas espaciais x,y e sua curva de decaimento temporal. Uma determinada amostra torna-se, portanto, um mapa de vidas revelando informações sobre a estrutura, a ligação e o ambiente da proteína^3,4. Cada proteína fluorescente possui uma vida útil intrínseca e precisamente definida, geralmente de alguns nanossegundos (ns), dependendo de suas propriedades fisioquímicas. É importante ressaltar que a vida útil de um flofófono é independente de sua concentração, intensidade fluorescente e da metodologia de imagem. No entanto, dentro de um sistema biológico, pode ser afetado por fatores ambientais como pH, temperatura, concentrações de íons, saturação de oxigênio e seus parceiros de interação. As vidas também são sensíveis a mudanças estruturais internas e orientação. Fundir um florofófono a um POI resulta em uma mudança em sua vida útil e, consequentemente, informações sobre o comportamento da proteína fundida. Quando um fluoróforo é cercado ou encapsulado em um ambiente bem ligado, como as folhas beta antiparalelas de uma estrutura amilóide, ele perde energia não radiativamente, um processo conhecido como saciamento⁵. A saciedade do flúor resulta em um encurtamento de sua vida aparente. Quando solúvel, a vida útil de uma proteína permanecerá mais próxima de seu valor original e mais alto. Em contraste, quando uma proteína começa a se agregar, sua vida útil inevitavelmente mudará para um valor mais baixo^6,7. Assim, torna-se possível monitorar a propensão de agregação de qualquer proteína formadora de amilóide em diferentes idades em c. elegansvivos .

Aqui descrevemos um protocolo para analisar a agregação de uma proteína de fusão que compreende diferentes trechos de poliglutamina (CAG, Q) (Q40, Q44 e Q85). Ilustramos como a técnica pode ser aplicada igualmente a diferentes fluoróforos, como proteína fluorescente de ciano (PCP), proteína fluorescente amarela (FpS) e proteína fluorescente vermelha monórica (mRFP); e em todos os tecidos de C. elegans,incluindo os neurônios, músculos e o intestino. Além disso, no contexto da proteotase, a FLIM é uma ferramenta muito útil para observar mudanças no esgotamento das acompanhantes moleculares. Derrubar uma das principais acompanhantes moleculares, a proteína de choque térmico 1 (hsp-1), através da interferência do RNA produz o desdobramento prematuro das proteínas. O aumento da carga de agregação como resultado do envelhecimento, doença ou acompanhantes deficientes, é então medido como uma diminuição na vida útil da fluorescência.

Protocolo

1. Sincronização de C. elegans

1. Sincronize C. elegans através do tratamento da solução de hipoclorito alcalino ou através de um simples ovo por 4 h a 20 °C⁸.
2. Cultivar e manter nematóides a 20 °C em placas médias de crescimento de nematóides (NGM) semeadas com OP50 E. coli de acordo com os procedimentos padrão⁹. Idade dos nematóides até o estágio ou dia de desenvolvimento desejado.
   NOTA: Neste protocolo, adultos jovens são imagem no dia 4 e nematóides velhos são imagem no 8º dia de vida.

2. R. RMS mediado por maquinaria de acompanhante através da alimentação

NOTA: Realize o knockdown da proteína de choque térmico 1 (hsp-1) acompanhante alimentando o vetor RNAi correspondente aos nematoies¹⁰. O plasmídeo hsp-1 RNAi foi obtido da biblioteca Ahringer (ID do clone: F26D10.3).

1. Cresça o HT115 (DE3) E. coli expressando o plasmídeo hsp-1 RNAi por 6 h a noite no meio Luria Bertani (LB) contendo ampicillina de 50 μg/mL.
2. Prepare placas de ágar NGM frescas contendo isopropílico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; 1 mM) e ampicillina (25 μg/mL) e sementes com a bactéria Hsp-1 RNAi. Deixe as placas secarem e induza em temperatura ambiente por 1-3 dias.
3. Coloque ovos sincronizados em uma placa de siRNA e deixe chocar, ou coloque nematóides gravid e deixe colocar ovos por 4h a 20 °C antes de remover. Cresça os nematóides até a idade ou estágio desejado.
   NOTA: A segunda geração de nematóides pode apresentar um fenótipo mais forte do knockdown. O protocolo siRNA e as condições aqui descritas são gerais e adaptados ao hsp1. A interferência de RNA via siRNA de um clone/gene específico precisa ser estabelecida e otimizada pelo usuário final. É importante notar que nem todos os siRNA têm a mesma eficiência e, portanto, recomenda-se testar a eficácia do knockdown por quantificação por recorrentação reversa quantitativa de reação em cadeia (RT-qPCR) ou mancha ocidental.

3. Preparação de slides de microscopia

1. No dia da imagem, comece preparando os slides de imagem. Derreta aagarose em ddH₂O a uma concentração de 3% (c/v) e deixe esfriar ligeiramente.
2. Corte a ponta de uma ponta de pipeta de 1 mL e tome cerca de 200 μL de agarose derretida. Pipa a agarose em um deslizamento de vidro limpo e imediatamente coloque um segundo em cima, evitando a formação de quaisquer bolhas. Deixe secar e retire suavemente a lâmina de vidro superior. O resultado é um deslizamento de vidro com uma superfície de agarose uniforme onde os nematoides serão posicionados.
   NOTA: Cada slide será usado para visualizar entre 5-10 nematóides. Os slides podem ser preparados e armazenados por algumas horas em uma caixa humificada para evitar que a agarose seque.

4. Montagem de nematoides em slides de microscopia

NOTA: A FLIM exige que os nematóides sejam imobilizados. Realize esta etapa assim que a configuração de imagem (por exemplo, microscópios, lasers, detectores) estiver pronta para uso.

1. Usando uma palheta de fio de platina, coloque nematóides da idade desejada em uma placa fresca não semeada e deixe-os rastejar para remover o excesso de bactérias OP50 de seus corpos.
2. Prepare o composto anestésico (azida de sódio ou levamisole) para imobilizar o nematóide. Mantenha um estoque de 500 mM NaN₃ no escuro a 4 °C e diluir em ddH_{fresco 2}O para uma concentração final de 250 mM. Se utilizar levamisole, diluir um estoque de 20 mM para uma solução de trabalho de 2 mM em ddH₂O.
   ATENÇÃO: A zida de sódio (NaN₃) é altamente tóxica. Use luvas e óculos de proteção e trabalhe sob um capô ventilado.
3. Trabalhando um microscópio estereomicroscópio, coloque uma gota de 10 μL de composto anestésico em uma almofada de agarose e transfira suavemente 5-10 nematóides para ele. Use uma ponta de cílios para separar os nematóides. Mantenha-os juntos, mas não tocando para permitir uma localização mais fácil dos nematoides durante a aquisição de imagens.
4. Sobreponha cuidadosamente os nematóides com um deslizamento de cobertura. Faça medições dentro de 1 h após a montagem.
   NOTA: Ambos os anestésicos acabarão por matar C. elegans. Os nematóides devem estar completamente imóveis durante a imagem, porque o mapa da vida é registrado a partir de cada pixel. Qualquer movimento dos parâmetros x,y impede a leitura da vida no mesmo pixel animado.

5. Aquisição de dados FLIM

NOTA: Neste protocolo, a vida útil do flúor é adquirida através do método TCSPC de domínio temporal. FLIM requer um pulso de luz para ser gerado pelo laser a uma taxa de repetição definida e constante. A taxa de repetição varia de acordo com o tipo de laser e precisa ser conhecida pelo usuário. As medições de vida são obtidas por detectores e equipamentos eletrônicos instalados ao lado de um microscópio convencional. Neste protocolo, as medições são realizadas em três microscópios confocais de varredura a laser diferentes com detectores e software fornecidos por duas empresas diferentes (Tabela de Materiais) para aquisição de vida smFP, CFP e YFP, respectivamente. Verifique se os filtros corretos de emissão/excitação estão no lugar e minimize qualquer fundo ou monitor de luz de fundo antes de iniciar. Antes de iniciar qualquer experimento, estabeleça a fotoestabilidade do flúor escolhido. Se o fluoróforo clarear em um curto espaço de tempo dentro dos tecidos nematoides, não é adequado para medidas FLIM em C. elegans.

1. Abra o software de aquisição da FLIM. O software FLIM também permite o controle do microscópio confocal. Localize a guia/botão para permitir que as saídas do detector sejam ativadas e pressione Habilitar saídas.
2. Adquira a função de resposta do instrumento (IRF), que descreve a precisão de tempo da configuração instrumental.
   NOTA: Esta etapa deve ser realizada preferencialmente antes da montagem dos nematóides.
   1. Se disponível, remova os filtros de excitação/emissão.
   2. Coloque um deslizamento de cobertura vazio acima do objetivo e encontre sua superfície. Registre o sinal de dispersão obtido a partir do deslizamento de cobertura para um mínimo de 30 s.
      NOTA: Para vidas de vários nanossegundos, o software de aquisição pode estimar automaticamente o deslocamento do IRF. A aquisição de um IRF é sempre recomendada.
3. Coloque o slide com os C. elegans montados no palco. Utilizando uma lente de ampliação de 10x no modo de transmissão e localize a posição dos nematóides no slide.
4. Remova o slide, mude o objetivo para uma lente de ampliação de 63x e aplique o meio de imersão necessário (por exemplo, óleo). Substitua o slide no palco e localize os nematóides.
5. Localize o Gerenciador pinhole no software de aquisição e abra-o ao Máximo. Comece a digitalizar a amostra, selecione uma região de interesse (por exemplo, cabeça, parte superior do corpo) e concentre-se em seu plano de projeção máxima.
6. Monitore a taxa de pulso de laser e os outros três valores presentes na interface do software: O Discriminador de Fração Constante (CFD), o Tempo de Amplitude (TAC) e o Conversor Analógico-para-Digital (ADC).
   NOTA: O laser deve ter um portão máximo de 1 x 10⁸ contagens de fótons únicos. Este número representa o número máximo de fótons fornecidos pelo laser. O CFD fornece informações sobre o recebimento do pulso de fóton único em referência ao pulso de laser pelo detector. Este valor deve ser aproximadamente 1 x 10⁵. O TAC discrimina entre o momento em que um fóton foi detectado e o próximo pulso de laser. Finalmente, a ADC converte a tensão TAC em um sinal de memória estorável¹¹. O CFD, tac e ADC devem ter valores semelhantes para garantir que os fótons emitidos pelo flúor não sejam perdidos. A avaliação correta desses parâmetros garante que fótons suficientes estão sendo coletados para criar um mapa de vida preciso.
7. Na interface do software FLIM, visualize o número de fótons detectados: o valor de ADC deve ser entre 1 x 10⁴ e 1 x 10⁵. Se necessário, mude o foco em um plano diferente ou aumente a potência do laser para coletar mais fótons.
   NOTA: Em geral, o número de fótons registrados por segundo não deve exceder 1% da taxa de repetição do laser.
8. Na barra de menu, selecione a guia para definir os parâmetros de aquisição. Selecione scansync in para permitir a detecção de fótons únicos.
9. Defina a aquisição como um período fixo de tempo ou um número fixo de fótons. Por exemplo, adquira uma curva de decaida vitalícia por 2 min ou até que um único pixel atinja uma contagem de fótons de 2.000 eventos únicos. Pressione Comece a iniciar a aquisição.
   NOTA: Diferentes fluoróforos exigirão diferentes lasers e filtros de excitação e emissão. De acordo com o brilho da amostra, a potência do laser também pode ser ajustada, o que não interferirá com a vida útil. Estes protocolos utilizam as seguintes configurações de excitação/emissão: YFP ex500/em520-50 nm, mRFP ex561/em580-620 nm. Um laser de dois fótons pulsado foi empregado para medições de PCP usando ex800/em440 nm. A quantidade de tempo e contagem de fótons necessários para a aquisição de um mapa FLIM precisará ser empiricamente estabelecida para cada configuração e cada finalidade experimental.

6. Análise de dados FLIM usando software FLIMfit

NOTA: Realize a análise de dados usando a ferramenta de software FLIMfit desenvolvida no Imperial College London¹² (ver Figura 1).

1. Abra o software e importe arquivos de dados FLIM via File | Carregar dados FLIM. Carregar todas as amostras de uma condição, mesmo que obtidas em sessões diferentes e de diferentes repetições biológicas.
2. Se necessário, segmente um único nematóide de qualquer imagem FLIM via Segmentação | Gerente de Segmentação. Arraste a ferramenta de corte ao redor da área de interesse até que ela seja destacada. Uma vez concluído, pressione OK.
   NOTA: A segmentação deve ser feita para todas as imagens.
3. Selecione uma pequena região onde a imagem baseada em intensidade de um C. elegans aparece(Figura 1, Setas 1). A curva de decaida dessa região aparecerá na grande janela de decomposição no lado direito da interface(Figura 1, Seta 2).
   NOTA: A decomposição pode ser exibida linearmente ou logaritmo.
4. Defina os parâmetros corretos para extrapolar a vida útil através do algoritmo do software, conforme descrito nas etapas 6.5-6.8.
5. Na guia Dados (Figura 1,Seta 3):
   1. Defina um valor mínimo integrado arbitrário para excluir quaisquer pixels que sejam muito fracos para produzir um bom ajuste. Dependendo da amostra c. elegans este valor varia de 40-300. Insira valores diferentes até que uma visualização satisfatória seja alcançada.
   2. Selecione um número De Min de Tempo e Um Máximo de Tempo para limitar o sinal FLIM a esses valores. Todos os eventos que aparecerem antes e depois deste limite serão excluídos.
      NOTA: Por exemplo, para a análise do mRFP, foram excluídos os eventos anteriores a 800 cv e após 4.000 cv. Esses valores dependem da vida útil do fluoróforo e precisam ser determinados pelo usuário final.
   3. Não altere a contagem predefinida/Fóton de 1.
   4. Insira a Taxa de Repetição,em MHz, do laser utilizado durante a aquisição.
      NOTA: Para o protocolo atual, diferentes lasers foram utilizados com várias taxas de repetição. O laser de dois fótons utilizado para aquisição de vida de CFP possui uma taxa de repetição de 80 MHz, para YFP o laser se repete a 40 MHz, e para mRFP o valor é de 78,01 MHz. Esses valores foram inseridos no FLIMfit de acordo com a amostra analisada.
   5. Insira um valor gate max para excluir todos os pixels saturados.
      NOTA: Para medições vitalícias em C. elegans,este valor é definido para qualquer número grande (por exemplo, 1 x 10⁸).
6. Na guia Lifetime, selecione um encaixe global a ser usado (por exemplo, um encaixe em sentido de pixel). Ver Figura 1,Seta 4.
   NOTA: Um encaixe em sentido pixel produzirá uma decadência instalada em cada pixel individual. Um ajuste em termos de imagem produzirá um ajuste global de cada imagem individual e exibirá um único valor de vida por imagem. Um ajuste global produzirá um único encaixe em todo o conjunto de dados. Um único valor vitalício é fornecido para todas as imagens.
7. Não altere nenhum outro parâmetro, exceto o Nº. Seleção de Exp se for sabido que a decaida de fluorescência escolhida é multiexponencial e exibe mais de uma vida útil.
   NOTA: No presente protocolo, esta função foi utilizada para calcular as vidas do fluoróforo biexponencial cfp.
8. Faça upload do IRF através do menu IRF: IRF | Carregar IRF. Para estimar o turno do IRF, selecione IRF | Estimativa irf shift. Um conjunto de valores aparecerá automaticamente na guia IRF. Uma vez estabelecido, não altere nenhum outro parâmetro desta guia.
9. Uma vez definidos todos os parâmetros, pressione O conjunto de dados de ajuste (Figura 1,Seta 5). O algoritmo produzirá um ajuste para a curva de decaimento e estabelecerá um valor vitalício para cada imagem.
   NOTA: O ajuste resultante, destacado em uma linha azul, deve se sobrepor a todos os eventos. Um bom ajuste é obtido quando todos os eventos estão alinhados ao longo do ajuste.
10. Clique na guia Parâmetros (Figura 1, Seta 6), localizada nos menus superior direito da interface do software, e selecione Estatística: w_mean (média ponderada) e verifique se o valor chi2 está o mais próximo possível de 1.
    NOTA: Um chi2 próximo a um garante a precisão do ajuste. O valor vitalício da imagem selecionada é, portanto, revelado como tau_1.
11. Exportar qualquer informação de interesse: Arquivo | Imagens de intensidade de exportação/tabela de resultados de ajuste/imagens/histogramas. Salvar as configurações de dados usadas para calcular a vida útil: Arquivo | Salvar configurações de dados.
    NOTA: Os parâmetros utilizados serão salvos para análise futura das amostras selecionadas.

7. Representações gráficas de dados FLIM

NOTA: As vidas coletadas de diferentes amostras podem ser representadas visualmente de várias maneiras. Selecione para denotar os valores de vida em nanossegundos ou picosegundos.

1. Mostre a qualidade do ajuste e a precisão da curva exportando a curva de decaimento diretamente da FLIMfit.
2. Representar a distribuição dos fótons plotando a freqüência da contagem de fótons versus o valor vitalício em um histograma.
3. Finalmente, para comparação estatística, se comparar duas ou mais amostras, coloque valores de vida mais desvio padrão da média em um gráfico de barra de gráfico de dispersão. Realize qualquer análise estatística desejada.

Resultados

O protocolo mostra como monitorar com precisão a formação de espécies agregadas em C. elegansvivos, tanto durante seu envelhecimento natural quanto quando submetidos ao estresse. Selecionamos quatro cepas diferentes de nematóides transgênicos que expressam proteínas de poliglutamina de repetições de 40T, 44T ou 85Q. Essas proteínas são sintetizadas em diferentes tecidos e foram fundidas a diferentes floróforos. As cepas C. elegans expressaram Q40-mRFP nos mú...

Discussão

O protocolo aqui apresentado descreve uma técnica baseada em microscopia para identificar espécies agregadas no sistema modelo C. elegans. FLIM pode caracterizar com precisão a presença de espécies agregadas e solúveis fundidas a um fluoróforo através da medição de suas decaidas ao longo da vida de fluorescência. Quando uma proteína de fusão começar a agregar sua vida média registrada passará de um valor mais alto para um valor mais baixo¹⁶. A propensão da agregação pod...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-Agar Kobe I	Carl Roth GmbH + Co. KG	5210.2	NGM component
Ahringer Library hsp-1 siRNA	Source BioScience UK Limited	F26D10.3
Ampicillin	Carl Roth GmbH + Co. KG	K029.3	Antibiotic
B&H DCS-120 SPC-150	Becker & Hickl GmbH		FLIM Aquisition software
B&H SPC830-SPC Image	Becker & Hickl GmbH		FLIM Aquisition software
BD Bacto Peptone	BD-Bionsciences	211677	NGM component
C. elegans iQ44-YFP	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OG412
C. elegans iQ85-YFP			Kind gift from Morimoto Lab
C. elegans mQ40-RFP			Kind gift from Morimoto Lab
C. elegans nQ40-CFP			Kind gift from Morimoto Lab
Deckgläser-18x18mm	Carl Roth GmbH + Co. KG	0657.2	Cover slips
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)	Carl Roth GmbH + Co. KG	2316.4
Leica M165 FC	Leica Camera AG		Mounting Stereomicroscope
Leica TCS SP5	Leica Camera AG		Confocal Microscope
Levamisole Hydrochloride	AppliChem GmbH	A4341	Anesthetic
OP50 Escherichia coli	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OP50
PicoQuant PicoHarp300	PicoQuant GmbH		FLIM Aquisition software
Sodium Azide	Carl Roth GmbH + Co. KG	K305.1	Anesthetic
Sodium Chloride	Carl Roth GmbH + Co. KG	3957.2	NGM component
Standard-Objektträger	Carl Roth GmbH + Co. KG	0656.1	Glass slides
Universal Agarose	Bio & Sell GmbH	BS20.46.500
Zeiss AxioObserver.Z1	Carl Zeiss AG		Confocal Microscope
Zeiss LSM510-Meta NLO	Carl Zeiss AG		Confocal Microscope