יישום של מיקרוסקופ כוח אטומי כדי לזהות אוסטיאוארתריטיס מוקדם

Summary

אנו מציגים שיטה לחקור שינויים אוסטאופתית מוקדם ברמה התאית בסחוס הפרקולריות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM).

Abstract

תכונות ביומכאניות של תאים ורקמות לא רק לווסת את צורתם ואת התפקוד אלא גם חיוני לשמירה על החיוניות שלהם. שינויים אלסטיות יכול להפיץ או להפעיל את תחילתה של מחלות גדולות כמו סרטן או אוסטיאוארתריטיס (OA). המיקרוסקופיה של הכוח האטומי (AFM) התפתחה ככלי חזק לאיכות ולכימות המאפיינים את התכונות הביומכאניות של מבני יעד ביולוגיים ספציפיים בקנה מידה מיקרוסקופי, כוחות מדידה בטווח מ קטן כמו piconewton אל מיקרואוטון. תכונות ביומכאניות הן בעלות חשיבות מיוחדת ברקמות שריר השלד, אשר חשופים לרמות גבוהות של מתח. OA כמחלה ניוונית של הסחוס תוצאות השיבוש של המטריצה הפראיסלנדי lular (PCM) ואת הסידור המרחבי של כונדרוציטים מוטבע מטריצה החילוץ שלהם (ECM). שיבוש PCM ו ECM כבר שויך שינויים בתכונות הביומכאניות של סחוס. במחקר הנוכחי השתמשנו AFM לכמת את השינויים האלה ביחס השינויים דפוס מרחבית ספציפיים של כונדרוציטים. עם כל שינוי דפוס, שינויים משמעותיים אלסטיות נצפו עבור ה-PCM ו-ECM. מדידת האלסטיות המקומית ובכך מאפשרת רישום מסקנות ישירות על מידת ניוון רקמות מקומיות OA.

Introduction

הסחוס הנמק העצם. הוא רקמה מיועלת כונדרוציטים בדלילות לייצר, לארגן, ולשמור על מטריצה החילוץ ולקיבולת (ECM) שאליו הם מוטבעים. כחלק ברור ומיוחד של ECM, כונדרוציטים מוקפים בשכבה דקה של מטריצה מיוחדת המכונה מטריצה הפראיסלנדי lular (PCM). ה-PCM משמש ממשק מטריצות של מטריצת תאים¹ המגן על כונדרוציטים² ומודול התגובה הביוסינתטית שלהם³. כפי שתוארה בעבר⁴, ב סחוס בריא, כונדרוציטים מסודרים דפוסים ספציפיים, ברורים מרחביים, כי הם ספציפיים עבור כל שכבת רקמה משותף^4,5 ותלוי במנגנון משותף ספציפי הטעינה מכני⁶. דפוסים אלה משתנים מזוגות ומיתרים בסחוס בריא כדי כפול מחרוזות עם תחילתה של אוסטיאוארתריטיס (OA). עם התקדמות נוספת של המחלה כונדרוציטים הטופס אשכולות קטנים, הגדלת בהדרגה בגודל לאשכולות גדולים OA מתקדם. אובדן מוחלט של כל מבנה ארגוני אינדוקציה של אפופטוזיס הוא נצפה בסוף השלב OA. כך, הסדר הסלולר כchondrocyte יכול לשמש כסמנים מבוססי תמונה עבור התקדמות OA⁴.

תכונות ביומכאניות של תאים ורקמות לא רק לווסת את צורתם ואת התפקוד אלא גם חיוני לשמירה על החיוניות שלהם. שינויים אלסטיות יכול להפיץ או להפעיל את תחילתה של מחלות גדולות כמו סרטן או OA. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) התפתחה ככלי רב-עוצמה לאפיון ולכימות המאפיינים הביומכאניות של מבני יעד ביולוגיים ספציפיים בקנה מידה מיקרוסקופי, מדידת מגוון רחב של כוח, מ piconewton ל מיקרוקטון. היישום העיקרי של AFM הוא למדוד את הטופוגרפיה פני השטח ותכונות מכניות של דגימות ברזולוציה subnanometer⁷. התקן המדידה כולל שלושה מרכיבים עיקריים: 1) בדיקה AFM, שהיא עצה חדה הנטענת על הזיז ומשמשת לאינטראקציה ישירה עם פני השטח של המדגם. כאשר הכוח מוחל על הזיז, העיוות של האחרון מתרחש על פי המאפיינים של רקמת נמדד. 2) מערכת אופטית המשעלת קרן לייזר על הזיז, המשתקף לאחר מכן ליחידת מגלאי. 3) גלאי פוטודיודה התופס את האור החוצה מהזיז. הוא ממיר את המידע שהתקבל על הסטה לייזר על ידי הזיז לתוך עקומת כוח שניתן לנתח.

לפיכך, העיקרון העיקרי של AFM הוא גילוי של הכוח הפועל בין הבדיקה AFM ואת מבנה היעד של המדגם. עקומות הכוח השיגו לתאר את התכונות המכאניות של מבני היעד על פני השטח לדוגמה כמו גמישות, הפצת הטעינה, מגנטיזציה, מתח התשואה, ואת עיוות פלסטיק אלסטי הדינמיקה⁸. יתרון חשוב של AFM על טכניקות דימות אחרות היא כי AFM ניתן להשתמש כדי למדוד את התכונות המכאניות של תאים חיים בינונית או רקמות במצב מקורי מבלי לפגוע ברקמה. AFM יכול לפעול הן בתנאי נוזלי או יבש. אין דרישה להכנה לדוגמא. AFM מספק את האפשרות לדמות דגימה ולמדוד את תכונותיו המכאניות בו זמנית בדגימות הסמוכות לתנאים פיזיולוגיים. במחקר הנוכחי אנו מתארים גישה הרומן להעריך התקדמות OA על ידי מדידת האלסטיות של ה-PCM ו ECM בסחוס מקורי המתאר. המתאם של הארגון המרחבי של כונדרוציטים עם מידת ניוון רקמות מקומיות מספק פרספקטיבה חדשה לחלוטין לגילוי מוקדם של OA. עם זאת, הרלוונטיות הפונקציונלית של תבניות אלה לא הוערכו עד כה. מכיוון שתפקידה העיקרי של הסחוס הראשי הוא טעינת הנושאת בחיכוך נמוך, הרקמה חייבת להיות בעל תכונות אלסטיים. AFM מאפשר למדוד לא רק את האלסטיות של ECM אלא גם של דפוסי הסלולר מרחבי מוטבע ב-PCM שלהם. המתאם הנצפה של אלסטיות עם שינוי דפוס מרחבי של כונדרוציטים הוא כל כך חזק מדידת אלסטיות לבד יכול לאפשר ריבוד של ניוון רקמות מקומיות.

אלסטי מודולים של ה-PCM ו ECM העריכו בסעיפים 35 μm-דק באמצעות מערכת AFM משולב לתוך מיקרוסקופ לעומת שלב הפוכה שאיפשר ויזואליזציה סימולטני של דגימת הסחוס. פרוטוקול זה מבוסס על מחקר כבר פורסם מהמעבדה שלנו⁹ ובמיוחד מתאר כיצד לאפיין את ההסדר המרחבי של כונדרוציטים וכיצד למדוד את האלסטיות של ה-PCM שלהם ו-ecm הקשורים. עם כל שינוי דפוס של כונדרוציטים, שינויים משמעותיים אלסטיות יכול גם להיות נצפתה הן PCM ו-ECM, המאפשר טכניקה זו כדי לשמש ישירות למדוד את השלב של ניוון של הסחוס.

גישה זו מאומתת פותחת דרך חדשה להערכת התקדמות OA והשפעות טיפוליות בשלבים המוקדמים לפני השפלה רקמות מאקרוסקופי למעשה מתחיל להופיע. ביצוע מדידות AFM באופן עקבי הוא תהליך מפרך. בפרוטוקול הבא נתאר כיצד להכין את המדגם שנמדד על ידי AFM, כיצד לבצע את מדידות AFM בפועל החל בהכנת הזיז, כיצד לכייל את ה-AFM, ולאחר מכן כיצד לבצע את המידות. הוראות שלב אחר שלב נותנות גישה ברורה ותמציתית כדי לקבל נתונים אמינים ולספק אסטרטגיות בסיסיות לעיבוד ולפענוח זה. סעיף הדיון מתאר גם את החסרונות הנפוצים ביותר של שיטה קפדנית זו ומספק עצות מועילות לפתרון בעיות.

Protocol

דגימות הסחוס האנושי הושגו מחולים שעברו מפרק הברך הכולל במחלקה לכירורגיה אורתופדיים של בית החולים של האוניברסיטה של טואבינגן, גרמניה, וויגעופר-בית חולים, רוטנבורג a.N., גרמניה, עבור השלב הסופי OA של הברך. אישור מחלקתי מלא, מוסדי, והוועדה אתית מקומית התקבלו לפני תחילת המחקר (מספר פרוייקט 674/2016BO2). הסכמה מושכלת בכתב התקבלה מכל המטופלים לפני השתתפות. השיטות בוצעו בהתאם להנחיות שאושרו.

1. הכנה לדוגמא

1. הכנת הסחוס להקפאה
   1. כדי להעריך שינויים ניווניות במפרק הברך, לקחת דגימות סחוס המוח המתקבל מהאזור הנושאת העומס של condyles הירך לאחר כריתת רקמות מהחולים.
      הערה: דגימות שנחקרו עדיין צריך להכיל לפחות שכבה דקה של עצם subchondral כדי לאפשר זיהוי ברור של התמצאות רקמות ביחס למשטח הפנימי והחיצוני, ובכך גם לאפשר הקציר רקמה סטנדרטית של שכבת הסחוס העליון. הסחוס יכול לשמש מדידות AFM עד 24 שעות לאחר הניתוח. הרקמה יכולה להיות מאוחסן סרום ללא שינוי מדיום של הנשר שונה של העיט (DMEM) עם 2% (v/v) פניצילין-סטרפטומיצין ו 1.2% (v/v) אמפוריטיצין B לפני השימוש. אחסון הדגימות עבור יותר מ -24 שעות יכול לגרום לפריטים במדידות AFM בשל נפיחות ברקמות, עם זאת.
   2. חותכים את הסחוס הפרקולארית כמכלול מעצם subchondral בעזרת אזמל ולאחר מכן להטביע את דגימת הסחוס במדיום הטבעה מסיסים במים על כפתור קריוטומה כי קופא תחת טמפרטורה נמוכה במכשיר קריוטום.
      הערה: המדיום הקפוא מייצב את הרקמה שהיא עוטפת. זה גם התוצאה הקפאה של דגימת הסחוס יחד עם מדיום הטבעה. כאשר חותכים את הסחוס מן העצם, לעקוב אחר כיוון הרקמה. הרקמה המוטבעת עבור הקריודורים חייב להיות ממוקם בצורה כזאת, כי השכבה העליונה (כלומר, משטח פרקיות) של הסחוס פונה ללהב. שימו לב כי הרקמה צריכה להיות מכוסה לחלוטין על ידי מדיום הטבעה.
2. קריוטום שאיפה של הסחוס
   1. באמצעות קריוטומה סטנדרטי, מקטע את הרקמה בעובי של 35 יקרומטר מן השכבה העליונה (כלומר, משטח פרקיות) של הסחוס הפרקולארית המוטבע במדיום הטבעה מסיסים במים קפואים.
      הערה: בסך הכל, עד 300 יקרומטר (המתאים לתשעה מקטעים) ניתן להגדיר ולהשתמש בהם לניתוח. המגבלה המוצעת של 300 יקרומטר מקבילה לעומק החדירה החזותית שניתן בדרך כלל לקבל עם מיקרוסקופ הזריחה בסחוס ההיאלין כגון סחוס הפרקולארית. כך, ניתן למיין את הסחוס על פי התבנית המרחבית מקומי השולט ולאחר מכן למדוד דפוסים אלה בסעיפים המתאימים.
   2. לאסוף את הסעיפים על שקופית זכוכית ולשטוף את סעיפים 3x עם מלוחים באגירה פוספט (PBS) כדי להסיר את מדיום הטבעה מסיסים במים.
3. הדבקת חתכי סחוס על צלחת פטרי תואמת AFM
   הערה: מכיוון ש-AFM אוסף נתונים על-ידי כניסה מכנית על המדגם, הסעיפים צריכים להיות קבועים במקום כדי לאפשר מדידות מדויקות.
   1. הדבק בעדינות את החלקים העבים של 35 יקרומטר עם דבק מדגם ביולוגי על מנות תרבות הרקמה התואמות להתקן afm. כדי לעשות זאת, לקחת 2-3 טיפות של הדבק ולשים אותם על הצלחת תרבות הרקמה במקום שבו קצה המקטע יהיה בסופו של דבר. עכשיו לשים את סעיף הסחוס על הדבק ולאפשר לו לדבוק בחוזקה על פני השטח של הצלחת תרבות רקמות.
      הערה: מקטעים עבים של 35 יקרומטר של הסחוס החילין אינם נוטים מאוד סלסול. עם זאת, אם הסלסול מתרחש בעת הסרת דגימות מתוך המדיום מאגר, ודא כי כמעט נוזל ככל האפשר מקלות לדגימות. ברגע עודף המים מתייבש, הפיצו ישירות את הרקמה על הכתמים המפוזרים של הדבק כך שהוא יתוקן אל פני השטח של הצלחת תרבות התא. הדבק מוחל בשכבה דקה רק בקצות הדגימה ולא במקטע כולו. למדוד רק את החלק הזה של המדגם כי הוא רחוק מהאזור מודבק כדי לחסל את האפשרות של הדבק מפריעה המידות.
   2. מודטת את הסעיפים בטמפרטורת החדר (RT) עבור 2 דקות כדי לאפשר את הדבק והרקמה להיקשר כראוי. לאחר מכן לכסות את הסעיפים עם L-15 בינוני של ליבוביץ ללא L-גלוטמין וללא נתרן ביקרבונט, כך שהם שקועים לחלוטין.
      הערה: תנועות פתאומיות של המדגם במהלך קיבעון או יישום דבק מספיק הם טעויות נפוצות כי התוצאה של ניתוק הרקמה מן הצלחת התרבות. יתרה מזאת, יש לבצע את המדיום ליבוביץ בצורה עדינה, כדי לא לנתק את המדגם מהמשטח עקב "גלים" שנוצרו על-ידי המדיום.
   3. הניחו את צלחת הפטרי עם הסעיפים המודבקים בחממה הסטנדרטית לתרבות התא ב-37 ° צ' עד לביצוע המדידות.
      הערה: ודא שמקטעי הרקמה יציבים ואינם מתנתק מפני השטח של המנה התרבותית של הרקמה על-ידי ביצוע כל צעד באיטיות.

2. הכנת זיז (הדבקת המיקרו-ספירות)

1. הכנת התקן AFM ודילול המיקרוספירות
   1. מניחים את הזיז על בלוק הזכוכית שצוין עבור מדידות האוויר, לתקן את זה עם האביב, ו הר את גוש הזכוכית על הראש AFM.
   2. לדלל את המיקרוספירות ב 100% אתנול (100 חלקיקים/10 μL) ו ultrasonicate עבור 10 s, כך המיקרוספירות מופרדים ולא לקבץ יחד.
2. הכנת הכיוונון להדבקה
   1. נקה שקופית זכוכית עם 70% אתנול ולטעון אותו על מחזיק המדגם במכשיר AFM.
      הערה: ניקוי השקופית מונע כתמים של אבק שעלולים להפריע לתהליך ההדבקה מצבירת במשטח השקופית.
   2. מקום 2 μl של ההשעיה המיקרוספירה באמצע השקופית ו 2 μl של דבק ליד ההשעיה ננו-ספירה.
      הערה: הצבת ההשעיה המיקרוספירה ודבק קרוב זה לזה מומלץ לאפשר מעבר מהיר של הזיז בין הדבק לבין המיקרוספירות. אם המעבר בין לטבול את הזיז לתוך הדבק ויצירת קשר עם מיקרוספירה ארוך מדי, הדבק יהיה בסופו של דבר הקשה, ובכך לאבד את התכונות דבק שלו.
   3. תנו לאתנול להתייבש במיקרו-כדור באוויר, ולהשאיר את המיקרוספירות במקום.
3. הדבקת המיקרוספירות בקצה הזיז
   1. טובלים את הזיז באופן ידני לתוך הדבק בעזרת מנוע stepper ב 10 יקרומטר שלבים עד הקצה מכוסה על ידי דבק. בצע צעד זה במהירות, כאשר הדבק מתייבש מהר.
   2. למשוך את הזיז שוב על ידי 100 μm, להעביר אותו לכיוון המיקרוספירות, ולמקם את קצה הזיז ישירות מעל מיקרוספירה אחת.
   3. הפעל מדידה של כוח ספקטרוסקופיית כדי לטבול את קצה הזיז על המיקרו-ספירה שנבחר עם הפרמטרים המוצגים בטבלה 1.
      הערה: על-ידי ביצוע שלב זה, מדידת משטח המיקרוספירה משמשת ליצירת קשר בין הקצה של הזיז לבין המיקרו-ספירה. זמן יצירת הקשר הארוך יחסית המוצג בטבלה 1 מאפשר זמן מליטה בשפע בין הדבק למיקרו-ספירה. עקומת מרחק הכוח המתקבל במהלך שלב זה נוצרת כתוצר למעלה של הדבקת המיקרו-ספירה על קצה הזיז ואינה מעובדת לצורך ניתוח נוסף.
   4. לאחר מיקרוספירה מחוברת הזיז, למשוך את בלוק זכוכית עם הזיז רכוב על גבי ולאחר מכן להסיר את הראש AFM מן המיקרוסקופ. לבסוף, בטל את הטעינה של בלוק הזכוכית והזיז מראש AFM.
   5. מודאת הזיז ב 65 ° c עבור 2 h ולתת לו להתייבש לילה בשעה RT לפני תחילת המידות.
      הערה: הדגירה של הזיז מגביר את תכונות הדבק של ההדבקה, והוא מחזק את מתחם המיקרו-מיקרוספירה.

3. הכנת מכשיר AFM למדידות

1. כוונן בלוק זכוכית שצוין למדידה בסביבה נוזלית על מחזיק AFM כך שהמשטח העליון יהיה ישר ומקביל למחזיק AFM.
2. בעזרת מלקחיים, לטעון בזהירות את הזיז הנבחר על פני השטח של בלוק זכוכית, כך את הטיפ AFM עם המיקרוספירה בולט מעל המישור האופטי מלוטש.
   הערה: הקצה של הזיז צריך לבלוט מעל המישור המלוטש כדי שיוכל לשקף את לייזר ה-AFM בגלאי התמונות. להיות זהיר מאוד כאשר הצבת את הזיז על AFM כדי לא לשרוט את המשטח האופטי מלוטש של בלוק זכוכית. גירוד בבלוק הזכוכית עלול לגרום לקשיים בהתאמת היישור לייזר ועלול להפריע למידות הבאות.
3. , כי הזיז יהיה כפוף ללחץ מכני. צריך לתקן אותו במקום ייצוב הזיז על בלוק הזכוכית על ידי הזזת המעיין המתכתי לתוך החריץ של הבלוק והסטת החלק העליון של הזיז עם המעיין בעזרת מלקחיים.
4. מניחים בזהירות את בלוק הזכוכית עם הזיז על הראש AFM ולאבטח אותו עם מנגנון נעילה משולב. ודא שהאביב פונה לצד שמאל כך שהזיז מוצב בכיוון הנכון. ואז לטעון את ראש AFM עם הזיז על המכשיר AFM.

4. טעינת המדגם והכיול של הזיז

הערה: כאן, כיול המכשיר מבוצע על-ידי הפעלת עקומת כוח על פני השטח הנקי של צלחת פטרי המלאה במדיום של ליבוביץ ' ללא כל רקמה לדוגמא. ניתן גם לבצע כיול באמצעות צלחת שליטה נפרדת AFM מלא רק עם מדיום AFM ללא המדגם.

1. טעינת המדגם בהתקן AFM
   1. מניחים את צלחת פטרי מוכן בשלב 1.3.3 על מחזיק דגימת AFM.
   2. הפעל את מחמם כלי פטרי והגדר אותה ב-37 ° c. אפשר לצלחת תרבות הרקמה להגיע לטמפרטורה אופטימלית (כלומר, 20 דקות).
   3. מניחים נייר הגנה על בסיס מכלול הזיז כדי למנוע עיבוי של בינוני בראש AFM.
2. כיול ההתקן
   1. פתח את התוכנה (טבלת חומרים), ואחריו חלון יישור לייזר, והחלון המתאר את הגדרות הפרמטרים של הגישה. ואז להפעיל את מנוע stepper, אור לייזר, ואת CCD-מצלמה.
   2. השתמש CCD-מצלמה במיקרוסקופ כדי להמחיש ולזהות את הזיז. באמצעות הפונקציה stepper המנוע, להנמיך את הזיז בשלבים 100 יקרומטר עד הזיז הוא לגמרי שקוע במדיום.
      הערה: מיזוג המשנה של הזיז בנוזל ניתן לזיהוי חזותי באמצעות מצלמות CCD. כאשר הוא שובר את פני המים, קצה הזיז יוצר בקלות השתקפויות מעגליות במים.
   3. לכוון את הלייזר על גבי הזיז באמצעות בורגי ההתאמה.
      הערה: אין למתוח את הברגים, מאחר שפעולה זו תגרום נזק למנגנון יישור הלייזר. הזיז מוצג מלמטה וקרן הלייזר מגיעה מלמעלה.
   4. לאחר הלייזר ממוקם על הזיז, להתאים את קרן הלייזר בעזרת ברגים במכשיר AFM, כך הקרן משתקף נופל על מרכז הגלאי. המשיכו לעקוב אחר מיקום קרן הלייזר באמצעות הפונקציה ליישור לייזר.
      הערה: הגלאי מרים את הסטיה של קרן הלייזר המשתקף על ידי הזיז וממיר אותו לאות חשמל.
   5. לאחר התאמת מסדר הלייזר, האות ' סכום ' חייב להיות 1 V או מעלה, בעוד שהdefלרוחב והאנכי חייבים להיות קרובים ל-0. אם ערכים אלה לא מתקבלים, התאימו את מזהה התמונה.
3. קבלת עקומת כוח הכיול
   1. על מנת להגיע אל פני השטח על מנת AFM להתחיל את המידות, להפעיל גישה סורק עם הגישה פרמטרים שניתנו בטבלה 2. לאחר התחתון של הצלחת תרבות הרקמה הוא הגיע, למשוך את הזיז על ידי 100 μm.
      הערה: בשלב זה הגשוש הוא בדיוק 100 יקרומטר מעל מהחלק התחתון של הצלחת תרבות הרקמה.
   2. הגדר את הפרמטרים של ההפעלה והתאם את הפרמטרים המוצגים בטבלה 3. לחץ על לחצן הפעלה כדי להפעיל מדידה ולקבל עקומת כיול של מרחק.
      הערה: עקומת הכוח המתקבלת כאן מוצגת באיור 1.
   3. בעקומת מרחק של כיול, בחר את האזור להתאמה ליניארית של העקומה המ, בתוכנה.
      הערה: ההתאמה הליניארית נעשית כדי למדוד את רגישות הזיז. לאחר ההתאמה הליניארית נמצאת במקום, הערכים יישמרו על-ידי התוכנה. המדידה המתמדת של האביב או הרעש התרמי של הזיז מחושבת על ידי התוכנה לאחר מכן.
   4. ככל שהמדידות מתבצעות בטמפרטורה של 37 ° c, קבעו את משתנה הטמפרטורה ב-37 ° c בתוכנה לחיקוי התנאים הפיסיולוגיים הקרובים ככל האפשר.
      הערה: בתום הכיול, הסטיה האנכית נשמרת ומוצגת ביחידת הכוח, ניוטון (N), במקום וולט (V), שהיא יחידת הרישום המקורי של גלאי הפוטודיודה.

5. אפיון ביומכאני של ECM ו-PCM על-ידי ביצוע מדידות אלסטיות באמצעות AFM

1. זיהוי דפוסי כונדרוציטים בחלק הסחוס
   1. שימו לב בסעיף הסחוס תחת מיקרוסקופ הניגודיות פאזה משולבים במערכת AFM ולזהות את דפוסי הסלולר הספציפיים¹⁰ של סחוס משני מתוך הברך האוסטאופתית: מחרוזות בודדות (שטחים רקמה בריאים), מחרוזות כפולות (מתחיל ניוון רקמות), אשכולות קטנים וגדולים (שניהם ניוון רקמות מתקדם). ראה איור 2א – ד.
   2. לאחר שהתבנית הרצויה מזוהה, למדוד שני אתרים לכל תבנית שנבחרה לכל סוג מטריצה (PCM או ECM) ולבצע תשע חזרות מדידה על כל אתר מדידה (איור 2E, F). ודא שגודל המדגם גדול מספיק כדי להסביר אי-דיוקים אפשריים.
      הערה: עבור מדידות ה-PCM, הצב את הזיז בסמיכות לתאים (כפי שמוצג על-ידי העיגולים האדומים באיור 2E, F). כדי לבצע מדידות של ECM, בחר אזור ללא תאים (המוצג על-ידי האזור הכחול באיור 2E, F) ובצע את ההזחה כמתואר בשלב 5.2.
2. הזחה של אתר היעד
   1. בצע גישה ואחריו הכחשה כך הזיז ממוקם 100 יקרומטר מעל הרקמה, אשר יהיה המיקום ההתחלתי עבור המידות העוקבות.
   2. התמקד ב-PCM או ב-ECM של התבנית שיש למדוד ולתקן את עכבר המחשב בנקודה זו.
      הערה: העכבר ישמש כסמן חזותי עבור אתר היעד של הכניסות. ברגע שהמוקד משתנה לקצה הזיז, מבני הרקמה יהפכו להיות זהים או מטושטשים.
   3. עכשיו להתמקד במכשיר ולהעביר את קצה הגשוש לנקודה שתוקנה בעבר על ידי חץ המחשב. לאחר מכן, הפעל את המידות בהפעלה, תוך שימוש בפרמטר נקודת הערכה שהושג על-ידי כיול של הזיז.
      הערה: עקומת כוח למופת שמתקבלת ממדידת ה-PCM של מחרוזת אחת מוצגת באיור המשלים 1.

6. עיבוד נתונים

הערה: ניתוח הנתונים או קביעת מודול האלסטי מבוצע באמצעות מודל הרץ כמתואר בעבר^11,12. צורתו של הכניסה הייתה כדורית בשל השימוש במיקרו-כדורים על הקצה ויחס הפואסון נשמר ב-0.5 בהתבסס על הספרות הקודמת^13,14,15.

1. פתח את תוכנת עיבוד הנתונים (טבלת חומרים) התואמת לנתונים שהתקבלו מהתקן afm.
2. בחרו בדגם הרץ בתוכנה לעיבוד עקומות מרחק הכוח. הגדר את יחס הפואסון ב-0.5 ובחר את צורת הקצה כדורית ורדיוס קצה של 12.5 μm.
3. לאחר כל הפרמטרים מותאמים, התוצאות מותאמות, ואת מודולוס של צעירים מחושב ומוצג על ידי התוכנה.

תוצאות

לאורך המודל הphysiopathological ממחרוזות למחרוזות כפולות, קטן ולבסוף לאשכולות גדולים, הן ECM (איור 3A) ו-PCM (איור 3a) אלסטי מודולים ירד באופן משמעותי בין כל שינוי דפוס. החריג היחיד היה ההבדל ב-ECM בין מחרוזות למחרוזות כפולות (p = 0.072). התוצאות מראות כי יחס ECM/PCM (איור...

Discussion

באמצעות AFM כטכניקה חדשנית ורבת עוצמה כדי למדוד את התכונות הביומכאניות של חומרים ביולוגיים ברמת ננו-סקאלה, מדדנו את התכונות האלסטיים של ECM ו-PCM בסחוס הגוף האנושי האוסטאופתית. דגימות סחוס נבחרו על פי דפוס מרחבית השולט שלהם של הארגון כchondrocyte כגון התמונה מבוססת ביואריקר עבור ניוון רקמות מקומיו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Merck	A2942
Atomic Force Microscope (AFM)	CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany	JPK00518
AFM head	(CellHesion 200) JPK	JPK00518
Biocompatible sample glue	JPK Instruments AG, Berlin, Germany	H000033
Cantilever	tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria	AIO-TL-10
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany	41966052
Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine	(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)	F1315
Microspheres	Polysciences	07313-5
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Petri dish heater associated with AFM	JPK Instruments AG, Berlin, Germany	T-05-0117
Scalpel	Feather	2023-01
Tissue culture dishes	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	SA6255012