Aplicação de microscopia de força atômica para detectar osteoartrite precoce

Resumo

Apresentamos um método para investigar alterações osteoartríticas precoces no nível celular na cartilagem articular usando microscopia de força atômica (AFM).

Resumo

As propriedades biomecânicas das células e tecidos não apenas regulam sua forma e função, mas também são cruciais para manter sua vitalidade. Mudanças na elasticidade podem propagar ou desencadear o início de doenças graves como câncer ou osteoartrite (OA). A microscopia de força atômica (AFM) emergiu como uma forte ferramenta para caracterizar qualitativamente e quantitativamente as propriedades biomecânicas de estruturas-alvo biológicas específicas em escala microscópica, medindo forças em uma faixa tão pequena quanto o piconewton até o micronewton. As propriedades biomecânicas são de especial importância nos tecidos musculoesqueléticos, que são submetidos a altos níveis de tensão. AA como uma doença degenerativa da cartilagem resulta na ruptura da matriz pericelular (PcM) e no rearranjo espacial dos condrócitos incorporados em sua matriz extracelular (ECM). A interrupção no PCM e no ECM tem sido associada a alterações nas propriedades biomecânicas da cartilagem. No presente estudo utilizou-se a AFM para quantificar essas alterações em relação às mudanças específicas do padrão espacial dos condrócitos. A cada mudança de padrão, foram observadas mudanças significativas na elasticidade tanto para o PCM quanto para o ECM. Medir a elasticidade local permite, assim, tirar conclusões diretas sobre o grau de degeneração do tecido local em OA.

Introdução

Cartilagem articular é um tecido avascular, aneural. Os condrócitos pouco dispersos produzem, organizam e mantêm uma matriz extracelular expansiva (ECM) na qual estão incorporados. Como parte distinta e especializada do ECM, os condrócitos são cercados por uma fina camada de matriz especializada conhecida como matriz pericelular (PCM). O PCM atua como uma interface mecanosensível de matriz celular¹ que protege os condrócitos² e modula sua resposta biossintética³. Como descrito anteriormente⁴, na cartilagem saudável, os condrócitos são dispostos em padrões espaciais específicos e distintos que são específicos para cada camada tecidual e articulação^4,5 e dependem de mecanismos de carga mecânicos específicos da articulação⁶. Esses padrões mudam de pares e cordas em cartilagem saudável para cordas duplas com o início da osteoartrite (OA). Com a progressão da doença, os condrócitos formam pequenos aglomerados, aumentando gradualmente em tamanho para grandes aglomerados em OA avançado. Observa-se uma perda completa de qualquer estrutura organizacional e indução de apoptose no estágio final. Assim, o arranjo celular condrócito pode ser usado como um biomarcador baseado em imagem para progressão de OA⁴.

As propriedades biomecânicas das células e tecidos não apenas regulam sua forma e função, mas também são cruciais para manter sua vitalidade. Mudanças na elasticidade podem propagar ou desencadear o início de doenças graves como câncer ou OA. A microscopia de força atômica (AFM) emergiu como uma poderosa ferramenta para caracterizar qualitativamente e quantitativamente as propriedades biomecânicas de estruturas-alvo biológicas específicas em escala microscópica, medindo uma ampla gama de força, do piconewton ao micronewton. A principal aplicação da AFM é medir a topografia superficial e as propriedades mecânicas das amostras na resolução subnanômetro⁷. O dispositivo de medição consiste em três componentes principais: 1) Uma sonda AFM, que é uma ponta afiada montada em um cantilever e é usada para a interação direta com a superfície da amostra. Quando a força é aplicada ao cantilever, a deformação deste último ocorre de acordo com as propriedades do tecido medido. 2) Um sistema óptico que projeta um raio laser no cantilever, que é então refletido em uma unidade detectora. 3) Um detector de fotodiodo que capta a luz desviada do cantilever. Ele converte as informações recebidas sobre a deflexão do laser pelo cantilever em uma curva de força que pode ser analisada.

Assim, o princípio principal da AFM é a detecção da força atuando entre a sonda AFM e a estrutura-alvo da amostra. As curvas de força obtidas descrevem as propriedades mecânicas das estruturas-alvo na superfície da amostra como elasticidade, distribuição de carga, magnetização, estresse de rendimento e dinâmica de deformação plástica elástica⁸. Uma vantagem importante da AFM em relação a outras técnicas de imagem é que a AFM pode ser usada para medir as propriedades mecânicas das células vivas em médio ou tecido em um estado nativo sem danificar o tecido. A AFM pode operar tanto em condições líquidas quanto secas. Não há necessidade de preparação da amostra. A AFM oferece a possibilidade de visualizar um espécime e medir suas propriedades mecânicas simultaneamente em espécimes próximos a condições fisiológicas. No presente estudo descrevemos uma nova abordagem para avaliar a progressão da OA medindo a elasticidade do PCM e do ECM na cartilagem articular nativa. A correlação da organização espacial dos condrócitos com o grau de degeneração do tecido local fornece uma perspectiva completamente nova para a detecção precoce de OA. A relevância funcional desses padrões não foi avaliada até agora, no entanto. Como a principal função da cartilagem articular é o rolamento de carga em baixo atrito, o tecido deve possuir propriedades elásticas. A AFM permite medir não apenas a elasticidade do ECM, mas também os padrões celulares espaciais incorporados em seu PCM. A correlação observada de elasticidade com a mudança de padrão espacial dos condrócitos é tão forte que medir a elasticidade sozinha pode permitir a estratificação da degeneração do tecido local.

Moduli elástico do PCM e ECM foram avaliados em seções de 35 μm-thin utilizando um sistema AFM integrado em um microscópio de contraste de fase invertido que permitiu a visualização simultânea da amostra de cartilagem. Este protocolo baseia-se em um estudo já publicado em nosso laboratório⁹ e descreve especificamente como caracterizar o arranjo espacial dos condrócitos e como medir a elasticidade de seu PCM e ECM associados. A cada mudança de padrão dos condrócitos, mudanças significativas na elasticidade também podem ser observadas tanto para o PCM quanto para o ECM, permitindo que essa técnica seja usada para medir diretamente o estágio de degeneração da cartilagem.

Esta abordagem validada abre uma nova maneira de avaliar a progressão da OA e os efeitos terapêuticos em estágios iniciais antes que a degradação do tecido macroscópico realmente comece a aparecer. Realizar medições de AFM de forma consistente é um processo árduo. No protocolo a seguir descrevemos como preparar a amostra a ser medida pela AFM, como realizar as medições aftosas reais começando com a preparação do cantilever, como calibrar o AFM e, em seguida, como realizar as medições. As instruções passo a passo fornecem uma abordagem clara e concisa para obter dados confiáveis e fornecer estratégias básicas para processá-los e interpretá-los. A seção de discussão também descreve as armadilhas mais comuns deste método rigoroso e fornece dicas úteis para solucionar problemas.

Protocolo

As amostras de cartilagem humana foram obtidas de pacientes submetidos a artroplastia total do joelho no Departamento de Cirurgia Ortopédica do Hospital Universitário de Tuebingen, Alemanha, e no Hospital Winghofer, Rottenburg a.N., Alemanha, para o estágio final do joelho. A aprovação do comitê de ética departamental, institucional e local foi obtida antes do início do estudo (projeto nº 674/2016BO2). O consentimento informado por escrito foi recebido de todos os pacientes antes da participação. Os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas.

1. Preparação da amostra

1. Preparando a cartilagem para secção criotome
   1. Para avaliar as alterações degenerativas na articulação do joelho, leve amostras de cartilagem articular obtidas da zona de suporte de carga dos condículos femorais após a ressecção tecidual dos pacientes.
      NOTA: As amostras investigadas ainda devem conter pelo menos uma fina camada de osso subcondral para permitir a identificação clara da orientação tecidual em relação à superfície interna e externa, permitindo também uma colheita padronizada de tecido da camada superior da cartilagem. A cartilagem pode ser usada para medições de AFM até 24h após a cirurgia. O tecido pode ser armazenado no meio de Águia (DMEM) modificado de Dulbecco com 2% (v/v) de penicilina-estreptomicina e 1,2% (v/v) de anfotericina B antes do uso. O armazenamento das amostras por mais de 24 h pode causar artefatos nas medidas de AFM devido ao inchaço do tecido, no entanto.
   2. Corte a cartilagem articular como um todo do osso subcondral com a ajuda de um bisturi e depois incorpore a amostra de cartilagem em meio de incorporação solúvel em água no botão criotome que congela sob baixa temperatura no dispositivo criotome.
      NOTA: O meio congelado estabiliza o tecido que envolve. Também resulta no congelamento da amostra de cartilagem junto com o meio de incorporação. Ao cortar a cartilagem do osso, acompanhe a orientação do tecido. O tecido embutido para as criosesessecções deve ser colocado de tal forma que a camada superior (ou seja, superfície articular) da cartilagem enfrente a lâmina. Observe que o tecido deve estar totalmente coberto pelo meio de incorporação.
2. Secção criotome da cartilagem
   1. Utilizando um criotomo padrão, seção do tecido a uma espessura de 35 μm da camada superior (ou seja, superfície articular) da cartilagem articular que está embutida no meio de incorporação de água congelada solúvel.
      NOTA: No total, até 300 μm (o que corresponde a cerca de nove seções) podem ser seccionados e utilizados para as análises. O limite proposto de 300 μm corresponde à profundidade de penetração visual que geralmente pode ser obtida com microscopia de fluorescência na cartilagem hialina, como cartilagem articular. Assim, é possível classificar a cartilagem de acordo com o padrão espacial local predominante e, em seguida, medir esses padrões nas seções correspondentes.
   2. Coletar as seções em uma lâmina de vidro e enxaguar as seções 3x com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover o meio de incorporação solúvel em água.
3. Colagem de seções de cartilagem em uma placa de Petri compatível com AFM
   NOTA: Como a AFM coleta dados por recuo mecânico na amostra, as seções precisam ser fixadas no local para permitir medições precisas.
   1. Cole suavemente as seções de 35 μm de espessura com cola de amostra biocompatível em pratos de cultura de tecido compatíveis com o dispositivo AFM. Para fazer isso, pegue 2-3 gotas da cola e coloque-as no prato de cultura de tecido no local onde a borda da seção vai acabar. Agora coloque a seção de cartilagem na cola e deixe-a grudar firmemente na superfície do prato de cultura de tecido.
      NOTA: As seções de 35 μm de espessura da cartilagem articular hialina não são muito propensas a enrolar. No entanto, se ocorrer curling ao remover as amostras do meio tampão, certifique-se de que o mínimo de fluido possível grude nas amostras. Assim que o excesso de água secou, espalhe diretamente o tecido nos pontos dispersos de cola para que ele seja fixado à superfície do prato de cultura celular. A cola é aplicada em uma camada fina apenas nas bordas da amostra e não em toda a seção. Medir apenas a porção da amostra que está longe da área colada para eliminar a possibilidade da cola interferir nas medidas.
   2. Incubar as seções à temperatura ambiente (RT) por 2 min para permitir que a cola e o tecido se conectem corretamente. Em seguida, cubra as seções com o meio L-15 de Leibovitz sem L-glutamina e sem bicarbonato de sódio para que estejam totalmente submersos.
      NOTA: Movimentos repentinos da amostra durante a fixação ou aplicação insuficiente da cola são erros comuns que resultam no desprendimento do tecido do prato de cultura. Além disso, a aplicação do meio Leibowitz deve ser feita de forma suave, de modo a não separar a amostra da superfície devido às "ondas" criadas pelo meio.
   3. Coloque a placa de Petri com as seções coladas na incubadora padrão de cultura celular a 37 °C até que as medições sejam realizadas.
      NOTA: Certifique-se de que as seções teciduais estão estáveis e não se desgrude medem da superfície do prato de cultura tecidual realizando cada passo lentamente.

2. Preparação cantilever (colagem das microesferas)

1. Preparando o dispositivo AFM e diluindo as microesferas
   1. Coloque o cantilever no bloco de vidro especificado para medições de ar, fixe-o com a mola e monte o bloco de vidro na cabeça AFM.
   2. Diluir as microesferas em 100% etanol (100 partículas/10 μL) e ultrassonolo para 10 s, de modo que as microesferas sejam separadas e não se agrupam.
2. Preparando a configuração para colagem
   1. Limpe um escorregador de vidro com 70% de etanol e monte-o no suporte de amostra no dispositivo AFM.
      NOTA: A limpeza do slide evita que partículas de poeira que possam interferir no processo de colagem se acumulem na superfície do escorregador.
   2. Coloque 2 μL da suspensão da microsfera no meio do escorregador e 2 μL de cola perto da suspensão da microsfera.
      NOTA: É recomendável colocar a suspensão da microsfera e a cola próximas umas das outras, para permitir uma transição rápida do cantilever entre a cola e as microesferas. Se a transição entre mergulhar o cantilever na cola e fazer contato com uma microsfera for muito longa, a cola acabará por endurecer, perdendo assim suas propriedades adesivos.
   3. Deixe o líquido de etanol na microesfera secar a ar, deixando as microesferas no lugar.
3. Colando as microesferas na ponta cantilever
   1. Mergulhe o cantilever manualmente na cola com a ajuda do motor de passo sinuoso em passos de 10 μm até que a ponta esteja coberta por cola. Realize este passo rapidamente, pois a cola seca rápido.
   2. Retraia o cantilever novamente em 100 μm, mova-o em direção às microesferas e posicione a ponta cantilever diretamente acima de uma única microesfera.
   3. Execute uma medição de espectroscopia de força para mergulhar a ponta cantilever na microesfera selecionada com os parâmetros mostrados na Tabela 1.
      NOTA: Ao executar esta etapa, uma medição da superfície da microesfera é usada para estabelecer contato entre a ponta do cantilever e a microesfera. O tempo de contato relativamente longo mostrado na Tabela 1 permite um amplo tempo de ligação entre a cola e a microesfera. A curva de distância de força obtida durante esta etapa é gerada como um subproduto da colagem da microesfera na ponta cantilever e não é processada para análise posterior.
   4. Uma vez que uma microesfera é anexada ao cantilever, retraia o bloco de vidro com o cantilever montado em cima e, em seguida, remova a cabeça AFM do microscópio. Por último, desmonte o bloco de vidro e cantilever da cabeça AFM.
   5. Incubar o cantilever a 65 °C por 2 h e deixe secar durante a noite em RT antes de iniciar as medições.
      NOTA: A incubação do cantilever melhora as propriedades adesivos da cola, tornando o complexo cantilever-microsfera mais estável.

3. Preparar o dispositivo AFM para medições

1. Ajuste um bloco de vidro especificado para medir em um ambiente líquido no suporte de AFM para que a superfície superior fique reta e paralela ao suporte de AFM.
2. Com a ajuda de pinças, monte cuidadosamente o cantilever selecionado na superfície do bloco de vidro, de modo que a ponta AFM com a microesfera se projete sobre o plano óptico polido.
   NOTA: A ponta do cantilever precisa se projetar sobre o plano polido para poder refletir o laser da AFM no fotodetector. Tenha muito cuidado ao colocar o cantilever no AFM para não arranhar a superfície óptica polida do bloco de vidro. Arranhar o bloco de vidro pode resultar em dificuldades no ajuste do alinhamento do laser e pode interferir nas medidas subseqüentes.
3. Como o cantilever estará sujeito à pressão mecânica, ele precisa ser fixado no lugar. Estabilize o cantilever no bloco de vidro deslizando a mola metálica para a ranhura do bloco e prendendo a parte superior do cantilever com a mola com a ajuda de pinças.
4. Coloque cuidadosamente o bloco de vidro com o cantilever na cabeça AFM e fixe-o com o mecanismo de travamento integrado. Certifique-se de que a mola está voltada para o lado esquerdo para que o cantilever seja colocado na orientação correta. Em seguida, monte a cabeça AFM com o cantilever no dispositivo AFM.

4. Carregando a amostra e a calibração do cantilever

NOTA: Aqui, a calibração do dispositivo é realizada executando uma curva de força na superfície limpa da placa de Petri cheia do meio de Leibovitz sem qualquer tecido amostral. A calibração também pode ser realizada usando um prato AFM de controle separado preenchido apenas com o meio AFM sem a amostra.

1. Montagem da amostra no dispositivo AFM
   1. Coloque a placa de Petri preparada na etapa 1.3.3 no suporte de amostra AFM.
   2. Ligue o aquecedor da placa de Petri e coloque-o a 37 °C. Permita que o prato de cultura tecidual atinja a temperatura ideal (ou seja, 20 min).
   3. Coloque uma folha protetora na base do conjunto cantilever para evitar a condensação do meio na cabeça AFM.
2. Calibração do dispositivo
   1. Abra o software(Tabela de Materiais),seguido pela janela de alinhamento a laser, e a janela que retrata as configurações do parâmetro de aproximação. Em seguida, ligue o motor do passo a passo, a luz laser e a câmera CCD.
   2. Use a câmera CCD no microscópio para visualizar e identificar o cantilever. Usando a função motora do passo, abaixe o cantilever em passos de 100 μm até que o cantilever esteja totalmente submerso no meio.
      NOTA: A submersão do cantilever no líquido é visualmente identificável através da câmera CCD. Quando quebra a superfície da água, a ponta cantilever cria reflexos circulares facilmente perceptíveis na água.
   3. Direcione o laser para cima do cantilever usando os parafusos de ajuste.
      NOTA: Não supere os parafusos, pois isso danificará o mecanismo de alinhamento do laser. O cantilever é visto de baixo e o raio laser vem de cima.
   4. Uma vez posicionado o laser sobre o cantilever, ajuste o feixe de laser com a ajuda de parafusos no dispositivo AFM para que o feixe refletido caia sobre o centro do fotodetector. Continue monitorando a posição do feixe de laser usando a função de alinhamento a laser.
      NOTA: O detector capta a deflexão do raio laser refletida pelo cantilever e converte-o em um sinal elétrico.
   5. Após o ajuste laser-cantilever, o sinal de soma deve ser de 1 V ou acima, enquanto as deflexões laterais e verticais devem estar próximas de 0. Se esses valores não forem obtidos, ajuste o fotodetector.
3. Obtenção da curva de força de calibração
   1. Para alcançar a superfície da antena AFM para iniciar as medições, execute um scanner Abordagem com os parâmetros de aproximação dados na Tabela 2. Uma vez que a parte inferior do prato de cultura de tecido é alcançado, retraia o cantilever por 100 μm.
      NOTA: Neste ponto, a sonda está exatamente 100 μm acima da parte inferior do prato de cultura de tecido.
   2. Configure os parâmetros RUN e ajuste os parâmetros exibidos na Tabela 3. Clique no botão RUN para iniciar uma medição e obter uma curva de distância de força de calibração.
      NOTA: A curva de força obtida aqui é mostrada na Figura 1.
   3. Na curva de distância de força de calibração, selecione a região para um ajuste linear da curva retraída no software.
      NOTA: O ajuste linear é feito para medir a sensibilidade do cantilever. Uma vez que o ajuste linear esteja no lugar, os valores serão salvos pelo software. A medição constante da mola ou o ruído térmico do cantilever é calculado pelo software posteriormente.
   4. Como as medições são realizadas em média a uma temperatura de 37 °C, defina a variável de temperatura em 37 °C no software para imitar as condições fisiológicas o mais próximo possível.
      NOTA: Ao final da calibração, a deflexão vertical é salva e exibida na unidade de força, o Newton (N), em vez de volts (V), que é a unidade do registro original pelo detector de fotodiodo.

5. Caracterização biomecânica do ECM e PCM por meio da realização de medidas de elasticidade via AFM

1. Identificando os padrões de condrócitos na seção de cartilagem
   1. Observe a seção de cartilagem sob um microscópio de contraste de fase integrado no sistema AFM e identifique os padrões celulares específicos¹⁰ da cartilagem articular do joelho osteoartrértico: cordas simples (áreas de tecido saudável), cordas duplas (degeneração do tecido inicial), pequenos e grandes aglomerados (ambos degeneração tecidual avançada). Ver Figura 2A-D.
   2. Uma vez identificado o padrão específico desejado, meça dois locais por padrão escolhido por tipo de matriz (PCM ou ECM) e realize nove repetições de medição em cada local de medição(Figura 2E,F). Certifique-se de um tamanho de amostra grande o suficiente para explicar possíveis imprecisões.
      NOTA: Para as medidas de PCM, coloque o cantilever próximo às células (como mostrado pelos círculos vermelhos na Figura 2E,F). Para realizar as medições do ECM, selecione uma região sem células (mostrada pela área azul na Figura 2E,F) e realize o recuo conforme descrito na etapa 5.2.
2. Recuo do local alvo
   1. Realize uma abordagem seguida de uma retração para que o cantilever esteja posicionado 100 μm acima do tecido, que será a posição inicial para as medidas subsequentes.
   2. Concentre-se no PCM ou ECM do padrão a ser medido e corrija o mouse do computador nesse ponto.
      NOTA: O mouse servirá como marcador visual para o local de recuo. Uma vez que o foco muda para a ponta cantilever, as estruturas teciduais se tornarão indistinguíveis ou borradas.
   3. Agora foque na sonda e mova a ponta da sonda para o ponto previamente corrigido pela seta do computador. Em seguida, inicie as medições com RUN,utilizando o parâmetro de ponto de set obtido pela calibração do cantilever.
      NOTA: Uma curva de força exemplar obtida a partir da medição do PCM de uma única corda é mostrada na Figura Suplementar 1.

6. Processamento de dados

NOTA: A análise ou determinação dos dados do módulo elástico é realizada utilizando-se um modelo Hertz como descrito anteriormente^11,12. A forma do indenter foi esférica devido ao uso de microesferas na ponta e a razão de Poisson foi mantida em 0,5 com base na literatura anterior^13,14,15.

1. Abra o software de processamento de dados(Tabela de Materiais)compatível com os dados obtidos a partir do dispositivo AFM.
2. Selecione o modelo Hertz no software para processar as curvas de distância de força. Defina a razão Poisson em 0,5 e selecione a forma da ponta como esférica e um raio de ponta de 12,5 μm.
3. Uma vez que todos os parâmetros são ajustados, os resultados são ajustados, e o módulo do Young é calculado e exibido pelo software.

Resultados

Ao longo do modelo fisiopatológico de cordas a cordas duplas, para pequenos e finalmente para grandes aglomerados, tanto ecm(Figura 3A) quanto PCM(Figura 3B)moduli elástico diminuiu significativamente entre cada mudança de padrão. A única exceção foi a diferença de ECM entre cordas e cordas duplas (p = 0,072). Os resultados mostram que a razão ECM/PCM (Figura 4B) não mudou significativamente, enquanto observou-se uma dimin...

Discussão

Utilizando a AFM como uma técnica nova e poderosa para medir as propriedades biomecânicas dos materiais biológicos em um nível de nanoescala, medimos as propriedades elásticas do ECM e do PCM na cartilagem articular osteoartrítica humana. As amostras de cartilagem foram selecionadas de acordo com seu padrão espacial predominante de organização de condrócitos como um biomarcador à base de imagem para degeneração tecidual local. Como esperado, observou-se forte declínio nos valores de elasticidade tanto do EC...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Merck	A2942
Atomic Force Microscope (AFM)	CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany	JPK00518
AFM head	(CellHesion 200) JPK	JPK00518
Biocompatible sample glue	JPK Instruments AG, Berlin, Germany	H000033
Cantilever	tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria	AIO-TL-10
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany	41966052
Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine	(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)	F1315
Microspheres	Polysciences	07313-5
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Petri dish heater associated with AFM	JPK Instruments AG, Berlin, Germany	T-05-0117
Scalpel	Feather	2023-01
Tissue culture dishes	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	SA6255012