Применение атомной микроскопии силы для обнаружения раннего остеоартрита

Биомеханические свойства клеток и тканей не только регулируют их форму и функцию, но и имеют решающее значение для поддержания их жизнеспособности. Изменения в эластичности могут распространяться или вызывать начало основных заболеваний, таких как рак или остеоартрит (ОА). Микроскопия атомной силы (AFM) стала сильным инструментом для качественной и количественной характеристики биомеханических свойств конкретных биологических целевых структур в микроскопическом масштабе, измеряя силы в диапазоне от такой небольшой, как пиконьютон до микроньютона. Биомеханические свойства имеют особое значение в мышечных тканях, которые подвергаются высокому уровню деформации. ОА как дегенеративное заболевание хряща приводит к нарушению периклеточной матрицы (PcM) и пространственной перестановке хондроцитов, встроенных в их внеклеточной матрицы (ECM). Нарушение ПХМ и ECM было связано с изменениями в биомеханических свойствах хряща. В настоящем исследовании мы использовали AFM для количественной оценки этих изменений в связи с конкретными изменениями пространственного шаблона хондроцитов. С каждым изменением шаблона наблюдались значительные изменения в эластичности как для PCM, так и для ECM. Измерение локальной эластичности позволяет делать прямые выводы о степени локальной дегенерации тканей в ОА.

Введение

Суставной хрящ является аваскулярной, аневральной ткани. Разреженные хондроциты производят, организуют и поддерживают экспансивную внеклеточную матрицу (ECM), в которую они встроены. Как отдельная и специализированная часть ECM, хондроциты окружены тонким слоем специализированной матрицы, известной как периклеточная матрица (PCM). PCM действует как mechanosensitive ячейки-матрицы интерфейс^1, который защищает хондроциты² и модулирует их биосинтетической реакции³. Как уже описано ранее⁴, в здоровом хряще, хондроциты расположены в конкретных, различных пространственных моделей, которые являются специфическими для каждого слоя ткани и сустава⁴^,⁵ и зависит от совместного конкретных механических механизмов загрузки⁶. Эти модели меняются от пар и струн в здоровом хряще в двойные струны с началом остеоартрита (ОА). С дальнейшим прогрессированием заболевания хондроциты образуют небольшие кластеры, постепенно увеличиваясь в размерах до больших скоплений в передовых ОА. Полная потеря любой организационной структуры и индукция апоптоза наблюдается в конце этапа ОА. Таким образом, хондроцитов клеточного расположения может быть использован в качестве изображения на основе биомаркера для ОА прогрессии⁴.

Биомеханические свойства клеток и тканей не только регулируют их форму и функцию, но и имеют решающее значение для поддержания их жизнеспособности. Изменения в эластичности могут распространяться или вызывать начало основных заболеваний, таких как рак или ОА. Атомная силовая микроскопия (AFM) стала мощным инструментом для качественной и количественной характеристики биомеханических свойств конкретных биологических целевых структур в микроскопическом масштабе, измеряя широкий спектр силы, от пиконевтона до микроньютона. Основное применение AFM заключается в измерении рельефа поверхности и механических свойств образцов при субнанометровом разрешении^7. Измерительное устройство состоит из трех основных компонентов: 1) зондAFM, который представляет собой острый наконечник, установленный на кантилевере и используется для прямого взаимодействия с поверхностью образца. Когда сила применяется к кантилевер, деформация последнего происходит в соответствии со свойствами измеренной ткани. 2) Оптическая система, которая проецирует лазерный луч на кантилевер, который затем отражается на детекторе. 3) Фотодиод детектор, который ловит свет отклоняется от кантилевера. Он преобразует полученную информацию о лазерном отклонении кантилевером в кривую силы, которая может быть проанализирована.

Таким образом, основным принципом AFM является обнаружение силы, действующей между зондом AFM и целевой структурой образца. Полученные кривые силы описывают механические свойства целевых структур на поверхности образца, такие как эластичность, распределение заряда, намагничиваемость, стресс урожайности и эластичная пластиковая динамика деформации^8. Важным преимуществом AFM по сравнению с другими методами визуализации является то, что AFM может быть использован для измерения механических свойств живых клеток в средних или тканях в родном состоянии, не повреждая ткани. AFM может работать как в жидкостных, так и в сухих условиях. Не требуется для подготовки образца. AFM предоставляет возможность изображения образца и измерения его механических свойств одновременно в образцах, которые находятся вблизи физиологических условий. В настоящем исследовании мы описываем новый подход к оценке прогрессии ОА путем измерения эластичности PCM и ECM в родном суставном хряще. Корреляция пространственной организации хондроцитов со степенью локальной дегенерации тканей дает совершенно новую перспективу для раннего выявления ОА. Однако функциональная значимость этих моделей до сих пор не оценена. Поскольку основной функцией суставного хряща является нагрузка подшипника при низком трении, ткань должна обладать эластичными свойствами. AFM позволяет измерять не только эластичность ECM, но и пространственных клеточных моделей, встроенных в их PCM. Наблюдаемая корреляция эластичности с пространственным изменением узора хондроцитов настолько сильна, что измерение эластичности само по себе может позволить расслоение местной дегенерации тканей.

Упругие модули PCM и ECM оценивались в 35 мкм-тонких секциях с использованием системы AFM, интегрированной в перевернутый фазовый контрастный микроскоп, позволивший одновременно визуализировать образец хряща. Этот протокол основан на исследовании, уже опубликованном в нашей лаборатории⁹ и конкретно описывает, как охарактеризовать пространственное расположение хондроцитов и как измерить эластичность связанных с ними ПХМ и ECM. С каждым изменением шаблона хондроцитов, значительные изменения в эластичности можно также наблюдать как для PCM и ECM, что позволяет использовать этот метод для непосредственного измерения стадии дегенерации хряща.

Этот проверенный подход открывает новый способ оценки прогрессирования ОА и терапевтических эффектов на ранних стадиях до того, как макроскопическая деградация тканей начнет появляться. Выполнение измерений AFM последовательно является трудным процессом. В следующем протоколе мы описываем, как подготовить образец для измерения AFM, как выполнить фактические измерения AFM, начиная с подготовки кантилевера, как откалибровать AFM, а затем как выполнять измерения. Пошаговые инструкции дают четкий и лаконичный подход к получению надежных данных и обеспечивают основные стратегии их обработки и интерпретации. В разделе обсуждения также описаны наиболее распространенные подводные камни этого строгого метода и предоставляются полезные советы по устранению неполадок.

протокол

Образцы хряща человека были получены у пациентов, перенесших полную артропластику коленного сустава в отделении ортопедической хирургии университетской больницы Тубингена, Германия, и в больнице Вингхофер, Роттенбург а.Н., Германия, для конечной стадии ОА колена. Полное одобрение департаментов, институциональных и местных этических комитетов было получено до начала исследования (проект No 674/2016BO2). Письменное информированное согласие было получено от всех пациентов до участия. Методы были осуществлены в соответствии с утвержденными руководящими принципами.

1. Подготовка образца

Подготовка хряща к секциям криотомы
1. Для оценки дегенеративных изменений в коленном суставе, возьмите образцы суставного хряща, полученные из несущей зоны бедренных кондилов после резекции тканей у пациентов.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы, которые исследуются должны по-прежнему содержать по крайней мере тонкий слой подхонной кости, чтобы позволить четкое определение ориентации ткани по отношению к внутренней и внешней поверхности, таким образом, также позволяет стандартизированный урожай ткани верхнего слоя хряща. Хрящ может быть использован для измерения AFM до 24 ч после операции. Ткань может храниться в сыворотке без Dulbecco в модифицированной среде Орла (DMEM) с 2% (v/v) пенициллин-стрептомицин и 1,2% (v/v) амфотерицин B до использования. Хранение образцов для более чем 24 ч может вызвать артефакты в измерениях AFM из-за отеков тканей, однако.
2. Вырежьте суставной хрящ в целом от подхондровой кости с помощью скальпеля, а затем вставлять образец хряща в водорастворимый встраивательный среды на криотоме ручку, которая замерзает при низкой температуре в криотоме устройства.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженная среда стабилизирует ткани, которые она обволакивает. Это также приводит к замораживанию образца хряща вместе с встраивающей средой. При вырезании хряща из кости отслеживайте ориентацию ткани. Ткань, встроенная для криосекций, должна быть помещена таким образом, чтобы верхний слой (т.е. суставная поверхность) хряща вытекло лезвием. Обратите внимание, что ткань должна быть полностью покрыта встраивающей средой.
Криотомирование хряща
1. Используя стандартный криотом, сеяте ткань толщиной 35 мкм от верхнего слоя (т.е. суставной поверхности) суставного хряща, встроенного в замороженную водорастворимые встраивающие сягранную среду.
  ПРИМЕЧАНИЕ: В общей сложности, до 300 мкм (что соответствует примерно девяти разделов) могут быть разделены и использованы для анализа. Предлагаемый предел 300 мкм соответствует глубине проникновения визу, которая обычно может быть получена с помощью флуоресценции микроскопии в гиалиновых хрящах, таких как суставной хрящ. Таким образом, можно сортировать хрящ по преобладающей локальной пространственной схеме, а затем измерять эти закономерности в соответствующих разделах.
2. Соберите секции на стеклянной горке и промыть разделы 3x фосфат-буфером солей (PBS), чтобы удалить водорастворимые встраивающие среды.
Склеивание секций хряща на блюдо, совместимое с AFM, Петри
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку AFM собирает данные с помощью механических отступов на выборке, разделы должны быть зафиксированы на месте, чтобы обеспечить точные измерения.
1. Аккуратно приклейте секции толщиной 35 мкм с биосовместимым образцом клея на блюда культуры тканей, совместимые с устройством AFM. Для этого возьмите 2-3 капли клея и положите их на блюдо культуры тканей в том месте, где край секции будет в конечном итоге. Теперь положите хрящевую секцию на клей и дайте ему твердо прилипнуть к поверхности тарелки культуры ткани.
  ПРИМЕЧАНИЕ: 35 мкм толщиной разделы гиалина суставного хряща не очень склонны к керлингу. Однако, если керлинг происходит при удалении образцов из буферной среды, убедитесь, что как можно меньше жидкости, как можно прилипает к образцам. Как только избыток воды высохнет, непосредственно распределите ткань по рассеянным пятнам клея так, чтобы она была закреплена на поверхности блюда культуры клеток. Клей наносится тонким слоем только по краям образца, а не по всей секции. Измерьте только ту часть образца, которая находится далеко от склееной области, чтобы исключить возможность вмешательства клея в измерения.
2. Инкубировать секции при комнатной температуре (RT) в течение 2 мин, чтобы клей и ткани, чтобы связь правильно. Затем покройте секции с L-15 среды Лейбовица без L-глютамина и без бикарбоната натрия, так что они полностью погружены.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Внезапные движения образца во время фиксации или недостаточного применения клея являются распространенными ошибками, которые приводят к отрешенности ткани от блюда культуры. Кроме того, применение среды Лейбовиц аможет следует делать щадящим способом, чтобы не отсоединить образец от поверхности из-за «волн», созданных средой.
3. Поместите чашку Петри с клеевыми секциями в стандартном инкубаторе культуры клеток при температуре 37 градусов по Цельсию до тех пор, пока не будут проведены измерения.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что секции ткани стабильны и не отделяются от поверхности блюда культуры ткани, выполняя каждый шаг медленно.

2. Препарат кантилевера (склеивание микросфер)

Подготовка устройства AFM и разбавление микросфер
1. Поместите кантилевер на стеклянный блок, указанный для измерения воздуха, зафиксируйте его пружиной и установите стеклянный блок на головке AFM.
2. Разбавить микросферы в 100% этанола (100 частиц/10 л) и ультрасоникат в течение 10 с, так что микросферы отделяются и не слипаются вместе.
Подготовка установки для склеивания
1. Очистите стеклянную горку с 70% этанола и установите его на держатель образца на устройстве AFM.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Очищение слайда предотвращает пылинки пыли, которые могут помешать процессу склеивания от накопления на поверхности слайда.
2. Поместите 2 злицы суспензии микросферы в середине слайда и 2 зл и л клея вблизи суспензии микросферы.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Размещение микросферной подвески и клея близко друг к другу рекомендуется для обеспечения быстрого перехода кантилевера между клеем и микросферами. Если переход между погружением кантилевера в клей и контактом с микросферой слишком долгий, клей в конечном итоге затвердеет, тем самым теряя свои клеевые свойства.
3. Пусть этанол жидкости в микросфере подвески пневмосухой, оставляя микросферы на месте.
Склеивание микросфер на кончике кантилевера
1. Опустите кантилевер вручную в клей с помощью степперного двигателя в 10 мкм шаги, пока кончик не покрыт клеем. Выполните этот шаг быстро, как клей быстро высыхает.
2. Втяните кантилевер снова на 100 мкм, переместите его в сторону микросферы и расположите кончик кантилевера прямо над одной микросферой.
3. Выполнить измерение спектроскопии силы, чтобы окунуть кончик кантилевера на выбранную микросферу с параметрами, показанными в таблице 1.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнение этого шага, измерение поверхности микросферы используется для установления контакта между кончиком кантилевера и микросферы. Относительно длительное время контакта, указанное в таблице 1, позволяет проводить достаточное время связи между клеем и микросферой. Кривая расстояния силы, полученная в ходе этого шага, генерируется как побочный продукт склеивания микросферы на кончике кантилевера и не обрабатывается для дальнейшего анализа.
4. После того, как микросфера крепится к кантилеверу, урежьте стеклянный блок с кантилевером, установленным сверху, а затем снимите голову AFM с микроскопа. Наконец, снять стеклянный блок и кантилевер от головы AFM.
5. Инкубировать кантилевер при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 2 ч и дайте ему высохнуть на ночь на RT перед началом измерений.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация кантилевера усиливает клеевые свойства клея, делая кантилевер-микросферу-комплекс более стабильным.

3. Подготовка устройства AFM к измерениям

Отрегулируйте стеклянный блок, указанный для измерения в жидкой среде на держателе AFM, чтобы верхняя поверхность была прямой и параллельной держателю AFM.
С помощью пинцета тщательно смонтируйте выбранный кантилевер на поверхности стеклянного блока, так что наконечник AFM с микросферой выступает над полированной оптической плоскостью.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кончик кантилевера должен выступать над полированной плоскостью, чтобы иметь возможность отражать лазер AFM на фотодетекторе. Будьте очень осторожны при размещении кантилевера на AFM, чтобы не поцарапать полированную оптическую поверхность стеклянного блока. Царапины стеклянного блока могут привести к трудностям в регулировке лазерного выравнивания и могут помешать последующим измерениям.
Поскольку кантилевер будет подвергаться механическому давлению, он должен быть исправлен на месте. Стабилизировать кантилевер на стеклянном блоке, сдвинув металлическую пружину в паз блока и зажимая верхнюю часть кантилевера с помощью пинцета.
Аккуратно поместите стеклянный блок с кантилевером на головку AFM и закрепите его встроенным механизмом блокировки. Убедитесь, что пружина обращена в левую сторону, чтобы кантилевер был помещен в правильную ориентацию. Затем установите головку AFM с кантилевером на устройстве AFM.

4. Загрузка образца и калибровка кантилевера

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, калибровка устройства осуществляется путем запуска кривой силы на чистой поверхности чашки Петри заполнены среды Лейбовица без каких-либо образцов ткани. Калибровка также может быть выполнена с помощью отдельного управления AFM блюдо заполнено только с AFM среды без образца.

Установка образца на устройстве AFM
1. Поместите блюдо Петри, приготовленное в шаге 1.3.3, на держатель образца AFM.
2. Включите нагреватель чашки Петри и установите его на уровне 37 градусов по Цельсию. Разрешить блюдо культуры ткани для достижения оптимальной температуры (т.е. 20 мин).
3. Поместите защитную фольгу на основание сборки кантилевера, чтобы избежать конденсации среды в головке AFM.
Калибровка устройства
1. Откройте программное обеспечение(Таблица материалов),а затем лазерное окно выравнивания, и окно, изображающее параметры параметра подхода. Затем включите двигатель степпера, лазерный свет и CCD-камеру.
2. Используйте CCD-камеру на микроскопе, чтобы визуализировать и идентифицировать кантилевер. Используя функцию двигателя степпера, опустите кантилевер в 100 мкм шаги, пока кантилевер полностью погружен в среду.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Погружение кантилевера в жидкость визуально идентифицируется с помощью CCD-камеры. Когда он ломает поверхность воды, кончик кантилевера создает легко заметные круговые отражения в воде.
3. Направьте лазер на верхнюю часть кантилевера, используя корректировочные винты.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Не переветрягайвинти, так как это повредит механизм лазерного выравнивания. Кантилевер рассматривается снизу и лазерный луч приходит сверху.
4. После того, как лазер расположен на кантилевере, отрегулируйте лазерный луч с помощью винтов в устройстве AFM так, чтобы отраженный луч упал на центр фотодетектора. Продолжайте следить за положением лазерного луча с помощью лазерной функции выравнивания.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Детектор поднимает отклонение лазерного луча, отраженного кантилевером, и преобразует его в электрический сигнал.
5. После лазерной регулировки кантилевера сигнал Сум должен быть 1 V или выше, в то время как боковые и вертикальные отклонения должны быть близки к 0. Если эти значения не получены, отрегулируйте фотодетектор.
Получение кривой силы калибровки
1. Для того, чтобы достичь поверхности на блюдо AFM, чтобы начать измерения, запустить сканер Подход с параметром подхода, приведенных в таблице 2. Как только дно тарелки культуры ткани достигнут, введете кантилевер 100 мкм.
  ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент зонд точно 100 мкм выше от нижней части ткани культуры блюдо.
2. Настройка параметров RUN и отрегулируйте параметры, отображаемые в таблице 3. Нажмите кнопку RUN, чтобы начать измерение и получить кривую калибровки силы расстояния.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Кривая силы, полученная здесь, показана на рисунке 1.
3. На кривой калибровки силы и расстояния, выберите область для линейного припадка убранной кривой в программном обеспечении.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Линейная подгонка делается для измерения чувствительности кантилевера. Как только линейная подгонка будет на месте, значения будут сохранены программным обеспечением. Весенние постоянные измерения или тепловой шум кантилевера рассчитывается программным обеспечением впоследствии.
4. Как измерения выполняются в среде при температуре 37 градусов по Цельсию, установить температуру переменной в 37 градусов по Цельсию в программном обеспечении, чтобы имитировать физиологические условия как можно ближе.
  ПРИМЕЧАНИЕ: К концу калибровки, вертикальное отклонение сохраняется и отображается в единице силы, Ньютон (N), вместо вольт (V), который является единицей первоначальной регистрации на фотодиод детектор.

5. Биомеханическая характеристика ECM и PCM путем выполнения измерений эластичности с помощью AFM

Определение узоров хондроцитов в секции хряща
1. Наблюдайте за секцией хряща под фазовым контрастным микроскопом, интегрированным в систему AFM, и определите специфические клеточные узоры¹⁰ суставного хряща из остеоартритного колена: одиночные струны (здоровые области тканей), двойные струны (начало дегенерации тканей), малые и большие кластеры (как продвинутая дегенерация тканей). Смотрите рисунок 2A-D.
2. После того, как конкретный желаемый шаблон определен, измерьте два участка на выбранный шаблон на матричную тип (PCM или ECM) и выполните девять повторений измерений на каждом месте измерения(рисунок 2E,F). Убедитесь, что размер выборки достаточно большой, чтобы учесть возможные неточности.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерений PCM поместите кантилевер в непосредственной близости от клеток (как показано красными кругами на рисунке 2E,F). Для проведения измерений ECM выберите область без каких-либо ячеек (показана синей областью на рисунке 2E,F)и выполните отступ, описанный в шаге 5.2.
Индикация целевого сайта
1. Выполните подход с последующим опровержением, так что кантилевер расположен на 100 мкм выше ткани, которая будет исходным положением для последующих измерений.
2. Сосредоточьтесь на PCM или ECM шаблона, который будет измерен и исправить компьютерную мышь в этой точке.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь будет служить в качестве визуального маркера для целевого сайта отступов. Как только фокус смещается на кончик кантилевера, структуры тканей станут неразличимыми или размытыми.
3. Теперь сосредоточьтесь на зонде и переместите кончик зонда в точку, ранее зафиксированную стрелкой компьютера. Затем начните измерения с RUN,используя параметр завесной точки, полученный путем калибровки кантилевера.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Образцовая кривая силы, полученная в результате измерения PCM одной строки, показана на дополнительной рисунке 1.

6. Обработка данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ данных или определение эластичного модуля выполняется с использованием модели Hertz, как описано ранее¹¹^,¹². Форма indenter была сферической из-за использования микросфер на кончике и соотношение Пуассона держалось на уровне 0,5 на основе^{предыдущей}литературы 13^,¹⁴^,¹⁵.

Откройте программное обеспечение для обработки данных(Таблица материалов),совместимое с данными, полученными с устройства AFM.
Выберите модель Hertz в программном обеспечении для обработки кривых силового расстояния. Установите коэффициент Пуассона на уровне 0,5 и выберите форму кончика как сферическую и радиус кончика 12,5 мкм.
После того, как все параметры скорректированы, результаты устанавливаются, и модуля Young рассчитывается и отображается программным обеспечением.

Результаты

Вдоль физиопатологической модели от строк до двойных строк, до малых и, наконец, больших кластеров, как ECM(Рисунок 3A)и PCM(рисунок 3B) эластичные модули значительно снизились между каждым изменением шаблона. Единственным исключением была разница в ECM между с...

Обсуждение

Используя AFM в качестве новой и мощной техники для измерения биомеханических свойств биологических материалов на наноуровневом уровне, мы измерили эластичные свойства ECM и PCM в остеоартритном суставном хряще. Образцы хряща были отобраны в соответствии с их преобладающей пространствен...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим наших соавторов из оригинальной публикации за их помощь и поддержку.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Merck	A2942
Atomic Force Microscope (AFM)	CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany	JPK00518
AFM head	(CellHesion 200) JPK	JPK00518
Biocompatible sample glue	JPK Instruments AG, Berlin, Germany	H000033
Cantilever	tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria	AIO-TL-10
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany	41966052
Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine	(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)	F1315
Microspheres	Polysciences	07313-5
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Petri dish heater associated with AFM	JPK Instruments AG, Berlin, Germany	T-05-0117
Scalpel	Feather	2023-01
Tissue culture dishes	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	SA6255012