הדמיה קינטית של אינטראקציות חיידקים בין-מינים חד-תאיים

Summary

פרוטוקול הדמיה זה של תאים חיידקיים חיים מאפשר הדמיה של אינטראקציות בין מינים חיידקיים מרובים ברמת תא יחיד לאורך זמן. הדמיה של זמן-לשגות מאפשרת להתבוננות של כל מין חיידקי במונוקולטורה או coculture לחקור אינטראקציות בין מינים בקהילות חיידקים מרובי מינים, כולל תנוענות תאים בודדים וכדאיות.

Abstract

קהילות פולימיקרוביאליות נמצאות בכל מקום בטבע, אך לימוד האינטראקציות שלהן ברמת התא הבודד קשה. לכן, שיטה מבוססת מיקרוסקופ פותחה להתבוננות אינטראקציות בין מינים בין שני פתוגנים חיידקיים. השימוש בשיטה זו כדי לחקור אינטראקציות בין פתוגן גראם שלילי תו לא, פסאודומונס aeruginosa ופתוגן גראם-חיובי שאינו מוטיב, Staphylococcus aureus מדגים כאן. פרוטוקול זה מורכב מאחסון משותף של כל מין בין כיסוי לבין משטח agarose, אשר שומר על התאים במטוס אחד ומאפשר הדמיה של התנהגויות חיידקים הן במרחב והן בזמן.

יתר על כן, המיקרוסקופ הזמן לשגות הפגינו כאן הוא אידיאלי עבור הדמיית אינטראקציות מוקדמות המתקיימות בין שני מינים חיידקיים או יותר, כולל שינויים בתנועבת מינים חיידקיים במונוקולטורה ובcoculture עם מינים אחרים. בשל אופיו של שטח המדגם המוגבל בהגדרת המיקרוסקופ, פרוטוקול זה פחות ישים ללימוד אינטראקציות מאוחרות יותר בין מינים חיידקיים ברגע שאוכלוסיות התאים גבוהות מדי. עם זאת, ישנם מספר יישומים שונים של הפרוטוקול הכוללים את השימוש בכתמים עבור הדמיה תאים חיידקיים חיים ומתים, כימות של ביטוי גנים או חלבון באמצעות כתבים פלורסנט, ומעקב אחר תנועת תאים חיידקיים בשני מינים בודדים וניסויים מרובי מינים.

Introduction

קהילות פולימיקרוביאליות נפוצות בטבע, המשתרעות על פני מגוון רחב של^{איכות הסביבה 1,,2,,3 ונישות אנושיות 4,,5}. חלק מהזיהומים הפולימיקרוביאליים הידועים לשמצה ביותר במחלה האנושית כוללים ביופילם^{דנטלי 6},^{פצעים כרוניים 7,}8 ,^{וזיהומים}בדרכי הנשימה באנשים עם מחלת^{ריאות חסימתית כרונית 9}, דלקת ריאות הקשורה למכונת הנשמה¹⁰, ואת המחלה הגנטית סיסטיק פיברוזיס (CF)^11,12. זיהומים אלה מורכבים לעתים קרובות של מינים מיקרוביאליים מגוונים; עם זאת, לאחרונה להתמקד באינטראקציות בין החיידק גראם חיובי Staphylococcus aureus ואת החיידק גראם שלילי פסאודומונס aeruginosa הגיח. מחקרים הכוללים חולים הנגועים באורגניזמים אלה וניתוחים במבחנה חושפים הן אינטראקציות תחרותיות והן אינטראקציות שיתופיות שיכולות להיות השפעות עמוקות ובלתי צפויות על התקדמות המחלה, הישרדות מיקרוביאלית, ויריות, חילוף חומרים, ורגישות^{לאנטיביוטיקה (נבדק}בפירוט על ידי Hotterbeekx ואח '. 2017¹³ ו לימולי והופמן 2019 3 ).

העניין הגובר באינטראקציות בין מינים במהלך הזיהום הניב מגוון שיטות לחקר התנהגויות קהילתיות פולמיקרוביאליות. בדרך כלל, מחקרים אלה השתמשו צלחת או מבוסס מרק ים כדי לחקור את ההבדלים פנוטיפיים בין monoculture וcoculture. לדוגמה, coculturing P. aeruginosa ו S. aureus על משטחים מוצקים אפשרה הדמיה של עיכוב צמיחה או שינויים בפנוטיפ המושבה, פיגמנט, או פוליסכריד^{ייצור 14,15,16}. מינים מעורבים biofilms, על משטחים ביוטיים או abiotic, כמו גם coculturing מינים חיידקיים בתרבות נוזלית גם אפשר מדידה של שינויים בצמיחה, חילוף החומרים, סובלנות לאנטיביוטיקה, תחרות וכדאיות, בנוסף^{לביטוי גנים וחלבון 17,18}. בעוד ניסויי תרבות בתפזורת אלה חשפו תובנה כיצד P. aeruginosa ו S. aureus עשויים להשפיע אחד על השני בקנה מידה קהילתי, הם אינם מסוגלים לענות על שאלות חשובות על האינטראקציות המתקיימות ברמה של תא יחיד. השיטה המוצגת כאן מוסיפה לגישות לחקר אינטראקציות בין-מינים על ידי התמקדות בשינויים בתנועה, בכדאיות התא ובביטוי הגנים של תאים בודדים בתוך קהילה מקוטפת לאורך זמן.

אינטראקציות של תאים בודדים עשויות להיות שונות באופן נרחב מהאינטראקציות המתקיימות בקהילה בתפזורת של תאים. באמצעות ניתוח של תאים בודדים, ניתן לכמת הטרוגניות בתוך קהילה כדי ללמוד כיצד מיקום מרחבי של תאים משפיע על הדינמיקה הקהילתית או כיצד רמות ביטוי גנים וחלבונים משתנות בתוך חברים בודדים בקבוצה. תאי מעקב יכולים גם לספק תובנות לגבי האופן שבו תאים בודדים נעים ומתנהגים לאורך זמן, דרך דורות מרובים. על ידי מעקב אחר תנועת תאים ושינויים בביטוי גנים בו זמנית, ניתן לבצע מתאם בין תנודות גנים ופנוטיפים מתאימים. פרוטוקולים קודמים לחקר מינים חיידקיים בודדים ברמת תא אחד תוארו. מחקרים אלה לנצל את תאי הדמיה חיים לאורך זמן במטוס אחד, היו שימושיים להתבוננות פנוטיפים כמו חלוקת תאים^{ורגישות אנטיביוטית 19,20}. מיקרוסקופ הדמיה חיה נוספת נוצלה כדי לפקח על צמיחה, תנועה, קולוניזציה פני השטח היווצרות biofilm של מינים חיידקיים יחיד^21,22,23. עם זאת, בעוד מחקרים אלה היו תובנה להבנת הפיזיולוגיה של חיידקים במונוקולטורה, ניסויים להתבוננות בהתנהגות חד-תאית של מינים חיידקיים מרובים לאורך זמן coculture מוגבלים.

כאן, פרוטוקולים קודמים המשמשים להדמיה חד-מינית הותאמו לאינטראקציות מחקר בין P. aeruginosa ו S. aureus. אורגניזמים אלה ניתן להבדיל תחת ניגודיות שלב בהתבסס על מורפולוגיות התא שלהם(P. aeruginosa הם bacilli ו S. aureus הם cocci). פיתוח שיטה זו אפשר לאחרונה את ההדמיה של התנהגויות תנועתיות שלא ייחסנו בעבר של P. aeruginosa בנוכחות S. aureus²⁴. P. aeruginosa נמצא מסוגל לחוש S. aureus ממרחק ולהגיב עם תנועות מוגברות וכיוון תא יחיד כלפי אשכולות של S. aureus תאים. P. aeruginosa תנועה לכיוון S. aureus נמצא לדרוש את הסוג IV pili (TFP), תחזיות כמו שיער אשר הארכה מתואמת ונסיגה ליצור תנועה הנקראת תנועתיות עוויתות²⁵.

מחקרים אלה מדגימים את התועלת של שיטה זו לחקר אינטראקציות קודמות בין מינים. עם זאת, הדמיה בצפיפות תאים גבוהה בנקודות זמן אינטראקציה מאוחרת יותר קשה בהתחשב בכך ששכבות בודדות של תאים כבר לא ניתן לזהות, אשר בעיקר מציב בעיות במהלך ניתוח שלאחר הדמיה. בהינתן מגבלה זו, השיטה מתאימה ביותר לאינטראקציות קודמות שניתן היה לעקוב אחריהן עם בדיקות מאקרו-סקופיות מסורתיות בצפיפות תאים גבוהה יותר המייצגות אינטראקציות מאוחרות יותר. מגבלות נוספות של שיטה זו כוללות את אופי התפוקה הנמוכה, שכן רק מדגם אחד ניתן למצוא בכל פעם ואת העלות של מיקרוסקופ, מצלמה, ותא סביבתי. יתר על כן, מיקרוסקופ פלואורסצנטי מהווה סיכונים לתאים חיידקיים כמו פוטוטוקסיסיטי ופוטו-בליבקינג, ולכן מגביל את התדירות שניתן לרכוש תמונות פלואורסצנטיות. לבסוף, רפידות agarose בשימוש בשיטה זו רגישים מאוד לשינויים בסביבה, מה שהופך אותו קריטי כדי לשלוט בתנאים כמו טמפרטורה ולחות, בהתחשב בכך רפידות יכול להתחיל להתכווץ או להרחיב אם התנאים אינם נכונים. לבסוף, בעוד שיטה זו אינה מחקה את הסביבה המארחת, היא מספקת רמזים כיצד מינים חיידקיים שונים מגיבים על משטחים, אשר ניתן לעקוב אחר בהם בתרופות שנועדו לחקות תנאים סביבתיים/מארחים.

שיטה זו שונה ממחקרים קודמים מעקב אחר תנועת תא יחיד, כי תאים מחוסנים בין כיסוי כרית agarose, הגבלת תאים אל פני השטח. הדבר מאפשר מעקב אחר תאים לאורך זמן במטוס יחיד; עם זאת, מגביל מחזורים של מעורבות משטח ארעי שנצפו כאשר תאים שקועים בנוזל²⁶. יתרון נוסף של חיידקים הדמיה תחת כרית agarose הוא כי הוא מחקה את החיסון מבוסס צלחת מאקרוסקופית תת משטח אומר קלאסי משמש כדי לבחון P. aeruginosa עוויתות^{תנוענות 25}. בהסכם זה, תאים חיידקיים מחוסנים בין החלק התחתון של צלחת פטרי ואת agar, שמירה על התאים במטוס אחד כפי שהם נעים על פני החלק התחתון של הצלחת כלפי חוץ מנקודת של חיסונים, ממש כמו פרוטוקול מיקרוסקופי זה.

פרוטוקול מיקרוסקופ זמן לשגות להדמיה אינטראקציות בין מינים המוצגים כאן מורכב 1) הכנת מדגם חיידקים וpad agarose, 2) בחירת הגדרות מיקרוסקופ עבור רכישת הדמיה 3) ניתוח שלאחר הדמיה. הדמיה מפורטת של תנועת תאים ומעקב יכולה להתבצע על ידי רכישת תמונות במרווחי זמן קצרים לפי ניגודיות שלב. מיקרוסקופ פלואורסץ יכול גם להיות מנוצל כדי לקבוע את הכדאיות של תאים או ביטוי גנים לאורך זמן. כאן, אנו מציגים דוגמה אחת של הסתגלות למיקרוסקופ פלואורסנצטי באמצעות תוספת של צבעי כדאיות רפידות agarose.

Protocol

הערה: ניתן למצוא תיאור מלא ומספרי קטלוג עבור כל החומרים ההספקיים בפרוטוקול זה בטבלת החומרים.

1. הכנת מדיה מינימלית M8T

1. הכן 1 L של בסיס מלחים מינימלי M8 (5x) על ידי המסת 64 גרם של Na₂HPO₄·7H₂O, 15 גרם של KH₂PO₄, ו 2.5 גרם NaCl ב 800 מ"ל של מים אולטרה פוריים (UPW, התנגדות 18 MΩ / ס"מ) בבקבוק 2 L. pH to 7.6. השלם את אמצעי האחסון ל- 1 L עם UPW. Autoclave עבור 45 דקות.
2. הכן 500 מ"ל של תמיסת גלוקוז (20% עם רוחב) על ידי המסת 100 גרם גלוקוז ב-400 מ"ל של UPW בבקבוק 1 L. פתרון מלא ל-500 מ"ל עם UPW. Autoclave עבור 45 דקות.
3. הכן 500 מ"ל של פתרון טריפטון (20% עם רוחב) על-ידי המסת 100 גרם של טריפטון ב-400 מ"ל של UPW. השלם עד 500 מ"ל עם UPW. Autoclave עבור 45 דקות.
4. הכן 1 L של M8 + 10% טריפטון (M8T) מדיה מינימלית על ידי הוספת 200 מ"ל של 5x M8 מלחים מינימליים (1x סופי), 10 מ"ל של 20% גלוקוז (0.2% סופי), 1 מ"ל של 1 M MgSO₄ (1 mM הסופי), ו 50 מ"ל של 20% טריפטון (1% סופי) כדי 600 מ"ל של UPW. השלם ל- 1 L עם UPW. סנן דרך מסנן סטרילי 0.2 μm לתוך בקבוק אחסון מדיה סטרילי 500 מ"ל.

היום הראשון:

2. הכנת תרביות לילה בקטריאליות

1. לחסן 5 מ"ל של M8T מדיה מינימלית עם מושבה אחת של P. aeruginosa או S. aureus (כולל אנטיביוטיקה בעת הצורך) דגירה לילה ב 37 ° C עם aeration במשך לא יותר מ 16 שעות.
   הערה: הפתוגנים החיידקיים P. aeruginosa ו S. aureus שימשו לשיטה זו, כי הם בדרך כלל coisolated מזיהומים כרוניים, וללמוד את האינטראקציות שלהם חשוב להבין איך הם תורמים לתוצאות המטופל במהלך זיהומים polymicrobial. מינים חיידקיים אחרים יכולים לשמש בהתאם למיקוד המחקר.

היום השני:

3. תת תרבות של זנים חיידקיים

1. תת תרבות P. aeruginosa 1:500 ו S. aureus 1:1000 ב 5 מ"ל של M8T טרי (כולל אנטיביוטיקה בעת הצורך). דגירה עם aeration ב 37 °C עד תרבויות להגיע לשלב אמצע יומן (OD₆₀₀ = ~ 0.3 - 0.5).

4. הכנת חומרים לתבניות פד

1. הכן את מרית המתכת על ידי חימום קצה של מרית מעבדה שטוחה ומעוגלת עם מבער בונזן עד שניתן יהיה לכופף חצי מהסוף השטוח לזווית של 90 מעלות. מחממים את הקצה של מרית מעבדה שטוחה ומעוגלת ומעט מכופפת את 10 מ"מ האחרונים לזווית של 45 מעלות צלזיוס.
2. חותכים את ארבע הפינות של תבניות הסיליקון כך שהתבניות יתאימו לצלחת של 35 מ"מ.
3. לחטא את המריבות וזוג פינצטה על ידי הוספת 70% אתנול והעברתם דרך הלהבה של מבער Bunsen.
4. נקה את התבניות והסיליקון עם 70% אתנול וייבש אותן במגבונים ללא מוך.

5. הכנת רפידות אגרוז

הערה: הרפידות מוכנות עם M8T מדיה מינימלית כמקור מתזונה עבור החיידקים המשמשים בפרוטוקול זה. עם זאת, החומרים המזינים המשמשים רפידות ניתן לשנות עבור אורגניזמים שונים.

1. להמיס 2% agarose נמוך להמיס ב 10 מ"ל של M8T בקבוקון נקי 50 מ"ל ארלנומאייר. מיקרוגל במרווחים קצרים (2-5 s) עד agarose הוא בתמיסה על מנת למנוע את התוכן של הבקבוקון רותח מעל. לאחר ההתמוססות, יש להתקרר באמבט מים של 50 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפחות.
2. מכינים את התבניות על ידי יישור גזרת הסיליקון עם הפתח בצלחת 35 מ"מ והקש קלות עם מרית כדי לאבטח את הסיליקון לצלחת, ולהסיר את כל בועות האוויר בין התבנית לצלחת.
3. ברגע קירור, פיפטה 915 μL של agarose מותך לתוך התבנית. השאירו את המכסה פתוח ותנו למשטח להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
4. מכסים את המנה במכסה ומשאירים בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות נוספות.
5. מכינים מגבונים לחות על ידי גלגול הדוק של מגבון ללא מוך. מניחים את המגבונים המגולגלים בתוך צלחת פטרי סטרילית ומוסיפים באופן שווה 500 μL של מים סטריליים על פני המגבונים. חם עד 37°C לשעה אחת.
6. מחממים את המשטח וצלחת סטרילית של 35 מ"מ ל-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.

6. הכנת תאים חיידקיים ותחבושות לחסן

1. מדוד את מנת ה- OD₆₀₀ של כל תת-תרבות ודילל P. aeruginosa ל- OD₆₀₀ = 0.03 ו- S. aureus ל- OD₆₀₀ = 0.10 ב- M8T שחמם מראש ל- 37°C. מערבבים את פ. ארוגינוזה וס. אאוראוס ביחס של 1:1 ומערבולת.
   הערה: אם זנים דורשים אנטיביוטיקה, ניתן להוסיף את האנטיביוטיקה לבין הלילה ותת-תרבות, אך אין להוסיף בעת ערבוב מינים להדמיה אם זה משפיע על מינים אחרים בcoculture. יציבות Plasmid ואת ההשפעות של אנטיביוטיקה על כל המינים coculture יצטרך להיקבע עבור כל אורגניזם / plasmid בשימוש.
2. פיפט 1 μL של coculture באופן שווה על פני החלק התחתון של צלחת מחומם מראש, סטרילי 35 ממ כיסוי זכוכית.
3. מוציאים את גזור הסיליקון מהתבנית בעזרת פינצטה סטרילית.
4. מוציאים את המשטח מהצלחת באמצעות מירה סטרילית.
   1. מחליקים את המרית המעופפת מעט מתחת לקצה המשטח, תוך החזקת התבנית הפוכה, כדי להפיל אותה על מכסה צלחת פטרי סטרילי.
      הערה: תקפיד לא לכפות את המשטח החוצה או שהוא יקרע. עקוב אחר איזה צד של המשטח הוא התחתון.
5. מעבירים את המשטח לצלחת עם התאים החיידקיים, בצד התחתון כלפי מטה, על ידי החלקת המרית בזווית של 90° מתחת למשטח והנחתה מעל כיסוי המחוסס. השתמשו במיתית הזוויתית של 90° כדי לגרום למשטח לשטוף את המכסה וללחוץ בעדינות על בועות אוויר.
6. מסירים לחות עודפת מגבונים לחים ואז מניחים סביב קצה הצלחת, ומוודאים שהיא לא נוגעת במשטח. הדגימה מוכנה כעת להדמיה.

7. הגדרת המיקרוסקופ להדמיה חיה

1. תא סביבתי חם ל 37 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות לפני ההגדרה ניסיונית.
2. הפעל את כל הרכיבים כולל מיקרוסקופ, מחשב ומקורות אור עבור הדמיית שדה בהיר ופלואורסצינטי.
3. פתח את תוכנת ההדמיה וודא שמקורות האור מחוברים ופעלים.
4. בצע תאורה Köhler^{27 כדי ליישר} את כל מישורים תמונה.
   1. ראשית, להביא כיסוי מסומן לפוקוס עם מטרה 20x באמצעות צלחת "דמה". ודא צריח העיך מוגדר למיקום "פתוח".
      הערה: יש לבצע תאורת Köhler עבור כל מטרה/דוגמה ייחודית כדי ליישר כראוי את מיות התמונה. עם זאת, מיקוד ויישור עם צלחת "דמה" על הגדלה נמוכה מזרז את ההגדרה על דגימות חיות בהגדלה גבוהה יותר כדי להגביל את הזמן בין הגדרה וזמן התחלה ניסוי.
   2. תמקד את העיך.
      1. סגור את הסרעפת של השדה.
         הערה: צמצם בצורת מתומן אמור להופיע. אם העיב אינו בפוקוס לחלוטין, שדה התצוגה כולו (FOV) יופיע כהה.
      2. סובבו את ידיות המיקוד של העיב עד שהקצוות המתומן פריכים.
         הערה: עוצמת האור תגדל ככל שמישורים התמונה יתקרבו ליישור הנכון.
   3. יישר את העיך.
      1. מרכז את עיך השדה על-ידי כוונון ידיות היישור.
         הערה: המתומן צריך להיות מרוכז באמצע FOV. ידיות היישור משתנות בהתאם למיקרוסקופ. לדוגמה, לעיבים מסוימים של מיקרוסקופים יש ידיות, בעוד שלאחרים יש ברגים הדורשים מנהל ברגים.
   4. מקד את נימה המנורה והתאם את הצמצם של העיב.
      1. הזמן טלסקופ פאזה או עדשת ברטרנד בנתיב האור כדי לצפות ב מישור המוקד האחורי של המטרה.
         הערה: צריכים להיות שני מעגלים קונצנטריים.
      2. הפעל את ידית המיקוד של עדשת ברטרנד עד שהטבעות ייראו חדות.
      3. הסר את עדשת ברטרנד משביל האור.
   5. פתח את הסרעפת של השדה עד שהתומן נמצא ממש מחוץ ל-FOV.
   6. שנה ליעד 100x והחלק את טבעת השלבים התואמת למקומה לפני הוספת טיפה של שמן טבילה, והכנס את צלחת המדגם המוכנה מעל.
   7. בצע תאורה Köhler על המטרה 100x עם צלחת מדגם חיידקים.
5. התמקדו בחיידקים באמצעות ההתאמה העדינה בלבד. ברגע שהחיידקים ב-FOV מתמקדים דרך העינית, החלף את נתיב האור למצלמה על ידי לחיצה על לחצן המצלמה במיקרוסקופ.
6. לחץ על האפשרות שלב בתוכנה להדמיה.
7. התאם את אחוז אור ה-LED הנפלט על-ידי בחירת מקור האור בתוכנה והזנה ידנית של אחוז האור הרצוי לשימוש או החלקה של הסרבל בסולם אחוזי האור.
8. התאם את זמן החשיפה לאור LED DIA על-ידי לחיצה על מקור האור והזן ידני של זמן החשיפה הרצוי או בחירת זמן חשיפה מהתפריט הנפתח שסופק.
   הערה: זמן החשיפה ישתנה בהתאם למצלמה בה נעשה שימוש.
9. אם אתה משתמש בפלואורסצנטי, התאם את הגדרות המצלמה בכל ערוץ מתאים (כלומר, TxRed, GFP), על-ידי לחיצה על ערוץ הפלורסנט של עניין.
   1. הגדר את אחוז אור הפלואורסץ הנפלט ולאחר מכן התאם את זמן החשיפה (כפי שבוצע בשלבים 7.7 ו- 7.8 עבור תאורת LED DIA).
   2. לחלופין, שנה את עומק הסיביות כדי להתאים את הטווח הדינאמי על-ידי בחירת אחת מאפשרויות עומק הסיביות האחרות בתפריט הנפתח פקדי פריטים חזותיים.
10. בחר את עמדות העניין של XY על-ידי לחיצה על האפשרות XY בתפריט פקדי הרכישה.
    1. הזז את מיקום הבמה עם מקל השמחה, או על-ידי לחיצה וגרירה של ה-FOV על המסך, ולחץ על התיבה הריקה כדי לשמור את קואורדינטות X ו- Y של מיקום ספציפי.
       הערה: בחירה של לא יותר משלוש עמדות XY שונות, קרוב ככל האפשר זה לזה, מומלצת לרכישת זמן-לשגות.
11. הפעל את מערכת המיקוד המושלמת (PFS) על-ידי לחיצה על התיבה PFS בכרטיסיה XY בתפריט בקרת הרכישה או לחיצה על לחצן PFS בלוח הבקרה של מקל השמחה.
12. סובב את ידיות ההתאמה העדינות כדי להתמקד בתאים החיידקיים.
13. לחץ על לחצן PFS עבור כל מיקום XY, לאחר שהתאים נמצאים בכיוון המוקד הרצוי.
    הערה: PFS מפצה על הסחף בציר Z במהלך ניסויי זמן-לשגות. זה הכרחי כדי לשמור על המיקוד של תאים חיידקיים לאורך זמן. לייצורים שונים יש מערכות פיצוי שונות.
14. בחר את תנאי רכישת התמונה, כולל מרווח רכישה ותדירות עבור כל ערוץ (לדוגמה, ניגודיות פאזה וכל פלואורופור) על-ידי בחירה מתוך האפשרויות בתפריט פקדי הרכישה.
    הערה: עבור הניסויים המוצגים כאן, תמונות ניגודיות שלב נרכשות במרווחי זמן כל 5-10 s בעוד תמונות פלואורסץ בערוצים GFP ו TxRed נרכשים כל 20 דקות.
15. התחל בהדמיה לאחר הגדרת הגדרות המיקרוסקופ ורכש.

8. אופציונלי: שינויים עבור הדמיה חיה/מתה

1. להמיס 2% agarose ב 10 מ"ל של M8T ולתת להתקרר 50 מעלות C אמבט מים לפחות 15 דקות.
2. הוסף 1 מ' של פרודיד פרופידיום לאגרוז המותך.
3. לאחר התקרר, פיפטה 915 μL של agarose בתבנית מוכנה.
4. משאירים את המכסה פתוח ותנו למשטח להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הגן מפני אור.
5. מכסים את המנה במכסה ומשאירים בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות נוספות.
6. הכן מגבונים לחות.
   1. מגלגלים נייר ללא מוך לנגב בחוזקה.
   2. מניחים את המגבונים בצלחת פטרי סטרילית ומוסיפים 500 μL של מים סטריליים לנגב.
   3. דגירה ב 37 ° C עבור 1 שעה.
7. דגירה את המשטח וצלחת סטרילית 35 מ"מ ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 שעות.
8. המשיכו לחסן את המנה כפי שצוין בסעיף 6: הכנת תאים חיידקיים ותחבושות מחסן.

9. ניתוח נתונים

1. זיהוי תאים
   1. פתח קובץ תמונה בתוכנת ההדמיה וחתוך את הקובץ כך שיכלול רק את המסגרות שישמשו למעקב, מוגדל לתאי העניין ורק בערוץ ניגודיות השלבים.
      הערה: ניתן לשמור את הקובץ החתוך כקובץ חדש שבו ניתן לאחסן נתוני מעקב מבלי להפריע לקובץ המקורי.
   2. בחר באפשרות לבחור אזורי עניין (ROI) בתפריט פקדי ניתוח ולהגדיר ROIs על-ידי מעקב אחר תאים חיידקיים בודדים או אשכולות של תאים במסגרת הראשונה שישמש לניתוח.
      הערה: ניתן להגדיר את ROIs באופן ידני או כאריכים בינאריים.
      1. הגדרה ידנית של ROI
         1. עקוב אחר ההיקף של כל תא חיידקי בודד או אשכולות של תאים כדי להגדיר באופן ידני את ROIs.
            הערה: בתוכנה לניתוח, P. aeruginosa, או תאים אחרים בצורת מוט, ניתן לעקוב באופן ידני על ידי בחירת ROI אליפסה וציור אליפסה מותאמת לגודל התא החיידקי. לחלופין, ניתן לבחור באפשרות Polygon ROI כדי לעקוב אחר ROIs שאינם בצורת מסורתית, כגון אשכולות של תאים.
      2. זיהוי ROIs בינארי
         1. לחץ על האפשרות בינארי ל- ROI כדי להגדיר ROIs בינארי.
            הערה: אובייקטים מוגדרים בשכבה בינארית המבוססת על הפרדת תאים חיידקיים כהים יותר מרקע מפוקסל בהיר יותר בערוץ ניגודיות הפאזה.
         2. כדי לסף את התאים, בחר באפשרות סף בתפריט פקדי ניתוח. בחר את ערוץ העניין והחלק את הסורגים בהיסטוגרמה הפלואורסצית כדי להתאים את ערכי מרווח הסף.
            הערה: זיהוי אובייקט בינארי עבור ROIs יכול להיות מוגדר גם בתמונות פלורסנט על-ידי סף התאים החיידקיים. סף קובע אילו עוצמות פלואורסץ נחשבות לאובייקטים ואיזה עוצמות פלואורסץ מהוות את הרקע.
2. מעקב אחר תאים
   1. כדי לעקוב באופן ידני אחר ROIs, בחר את המסגרת הבאה ברצף ההדמיה והתאם את מיקום ה-ROIs על-ידי לחיצה וגרירה של כל החזר השקעה כדי ליישר קו עם המיקום החדש של התא החיידקי המקורי.
      הערה: אם התאים החיידקיים לא שינו את המיקום, אין צורך להעביר את ה-ROIs.
   2. חזור על הפעולה בכל המסגרות הריצה שעבורן יש לעקוב אחר תאים.
   3. כאשר התאים מתחלקים, הגדר את תאי הבת כ-ROIs חדשים, כמתואר בשלב 9.1, והתחל לעקוב אחר התאים המחולקים החדשים.
      הערה: אם תאים מזוהים כאריך בינארי, השתמש בפונקציה מעקב אחר תאריכים בינאריים כדי לעקוב באופן אוטומטי אחר ROIs במסגרות נבחרות.
   4. לאחר מעקב אחר תאים דרך כל המסגרות שנבחרו, יצא את הנתונים לניתוח.
   5. פתח את הגיליון האלקטרוני של הנתונים וזהה את המידות הדרושות לניתוח (כלומר, מהירות אובייקט, האצה או אורך נתיב).
      הערה: במקרה של מדידת הבימוי, נדרשות המדידות אורך נתיב ואורך קו. אורך הקו הוא מדידה של המרחק האוקלידי, או המרחק הישר ממקור המסלול לקצה מושבת S. aureus. אורך הנתיב הוא מדידה של המרחק המצטבר, או סכום מקטעי הרצועה מכל המסגרות. ניתן לחשב את ההכוונון כייחס של המרחק היוקלידי, D_(E)(אורך קו), מעל המרחק המצטבר, D_(A)(Path Length).
3. כימות פלואורסצנטיות
   1. הגדר ROIs עבור תאים חיידקיים פלורסנט כמתואר בשלב 9.1.
   2. חזרה על מעקב או תנועה של ROIs עבור תאים חיידקיים או אשכולות במסגרות פלורסנט הנותרים.
   3. יצא את הטבלה שנוצרה לקובץ גיליון אלקטרוני לניתוח של עוצמת פלורסנט.
   4. בגיליון האלקטרוני של הנתונים, חפש את העמודה עם "עוצמה ממוצעת" המייצגת את עוצמת הפלואורסץ הממוצעת עבור ההחזר על התאים החיידקיים העקבו.
   5. גרף את ערכי העוצמה ממוצעת כדי להסתכל על השינויים בפלואורסט לאורך זמן.
      הערה: השינויים בפלואורסצנטיות לאורך זמן מייצגים את התנודות של ביטוי גנים עבור הגן המסומן בפלורסנט של עניין.

תוצאות

שימוש מוצלח בשיטה המתוארת יגרום לסדרה של מסגרות המייצרות וידאו שבו ניתן לצפות באינטראקציות בין המינים לאורך זמן. השרטוט באות 1 מספק חזותי כדי להדגיש את השלבים המרכזיים הכרוכים בהכנת חומרים להדמיה. השימוש בשיטה זו אפשר הדגמה של P. aeruginosa תאים המציגים התנהגויות שונות במו...

Discussion

השיטות המוצגות כאן מתארות פרוטוקול להדמיה של תאים חיים של אינטראקציות מינים חיידקיים ברמת תא יחיד עם שינויים עבור יישומים אחרים כולל מעקב אחר תאים וניטור הכדאיות של תאים. שיטה זו פותחת דרכים חדשות לחקר התנהגויות של תאים בודדים של מיקרואורגניזמים בcoculture עם מינים אחרים לאורך זמן. באופן ספצ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose pads
35 mm Glass Bottom Dish with 20 mm Micro-well #1.5 Cover Glass	Cellvis	D35-20-1.5-N	One for agarose pad molds, one for experiment
KimWipes	Kimberly-Clark Professional	06-666A
Low-Melt Agarose	Nu-Sieve GTG/Lonza	50081	For making agarose pads
Round-Bottom Spatulas	VWR	82027-492
Round-Tapered Spatulas	VWR	82027-530
Silicon Isolators, Press-to-Seal, 1 well, D diameter 2.0 mm 20 mm, silicone/adhesive	Sigma-Aldrich	S6685-25EA	For agarose pad molds
Sterile Petri Plates, 85 mm	Kord-Valmark /sold by RPI	2900
Tweezers	VWR	89259-944
M8T Minimal Media
D (+) Glucose	RPI	G32045
KH2PO4	RPI	P250500
MgSO4	Sigma-Aldrich	208094
NaCl	RPI	S23025
Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	230391
Tryptone	BD Biosciences	DF0123173
Microscope
Andor Sona 4.2B-11	Andor	77026135	Camera. 4.2 Megapixel Back-illuminated sCMOS, 11 μm pixel, 95% QE, 48 fps, USB 3.0, F-mount.
Filter Cube GFP	Nikon	96372	Filter cube
Filter Cube TxRed	Nikon	96375	Filter cube
H201-NIKON-TI-S-ER	Okolab	77057447	Stagetop incubator
Nikon NIS-Elements AR with GA3 and 2D and 3D tracking	Nikon	77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950	Software for data analysis
Nikon Ti2 Eclipse	Nikon	Model Ti2-E	Microscope
CFI Plan Apo ƛ20x objective (0.75NA)	Nikon	MRD00205	Objective
CFI Plan Apo ƛ100x oil Ph3 DM objective (1.45NA)	Nikon	MRD31905	Objective
ThermoBox with built-in fan heaters	Tokai Hit	TI2TB-E-BK	Enclosure
Bacterial Strains
Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT)		PMID: 7604262	Non-mucoid prototroph
Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP)		PMID: 9361441
Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2		PMID: 26041805
Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT)		PMID: 23404398	USA300 CA-Methicillin resistant strain LAC without plasmids
Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP)		PMID: 20829608
Staphylococcus aureus USA300 LAC ΔagrBDCA		PMID: 31713513
Viability Stain
Propidium Iodide	Invitrogen	L7012	LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit