Visualizzazione cinetica delle interazioni batteriche interspecie a uni cell

Riepilogo

Questo protocollo di imaging cellulare vivo-batterico consente di vedere le interazioni tra più specie batteriche a livello di singola cellula nel tempo. L'imaging time-lapse consente l'osservazione di ogni specie batterica in monocultura o cocoltura per interrogare le interazioni interspecie in comunità batteriche multispecie, tra cui la motilità e la vitalità delle singole cellule.

Abstract

Le comunità polimicrobiche sono onnipresenti in natura, ma studiare le loro interazioni a livello di una singola cellula è difficile. Pertanto, è stato sviluppato un metodo basato sulla microscopia per osservare le interazioni tra le specie tra due patogeni batterici. L'uso di questo metodo per interrogare le interazioni tra un patogeno motile Gram-negativo, Pseudomonas aeruginosa e un patogeno Gram-positivo non motile, Staphylococcus aureus è dimostrato qui. Questo protocollo consiste nel co-inoculare ogni specie tra un coverslip e un pad di agarose, che mantiene le cellule in un unico piano e consente la visualizzazione dei comportamenti batterici sia nello spazio che nel tempo.

Inoltre, la microscopia time-lapse qui dimostrata è ideale per visualizzare le prime interazioni che si svolgono tra due o più specie batteriche, compresi i cambiamenti nella motilità delle specie batteriche nella monocultura e nella coculazione con altre specie. A causa della natura dello spazio campione limitato nella configurazione della microscopia, questo protocollo è meno applicabile per studiare le interazioni successive tra le specie batteriche una volta che le popolazioni cellulari sono troppo alte. Tuttavia, ci sono diverse applicazioni del protocollo che includono l'uso della colorazione per l'imaging di cellule batteriche vive e morte, la quantificazione dell'espressione genica o proteica attraverso giornalisti fluorescenti e il monitoraggio del movimento delle cellule batteriche sia nelle singole specie che negli esperimenti multispecie.

Introduzione

Le comunità polimicrobiche sono comuni in natura, che abbracciano una varietà di^{nicchie ambientali 1,2,3} e umane^4,5. Alcune delle infezioni polimicrobiche più note nella malattia umana includono biofilm dentali⁶, ferite croniche^7,8e infezioni respiratorie in individui con malattia polmonare ostruttiva^{cronica 9}, polmonite associata al ventilatore¹⁰e la fibrosi cistica della malattia genetica (CF)^11,12. Queste infezioni sono spesso composte da diverse specie microbiche; tuttavia, è emerso un recente focus sulle interazioni tra il batterio Gram-positivo Staphylococcus aureus e il batterio Gram-negativo Pseudomonas aeruginosa. Studi che includono pazienti coinfettati con questi organismi e analisi in vitro rivelano interazioni competitive e cooperative che possono avere influenze profonde e inaspettate sulla progressione della malattia, la sopravvivenza microbica, la virulenza, il metabolismo e la suscettibilità agli antibiotici (esaminate in dettaglio da Hotterbeekx et al. 2017¹³ e Limoli Hoffman 2019³).

Il crescente interesse per le interazioni interspecie durante l'infezione ha prodotto una varietà di metodi per studiare i comportamenti della comunità polimicrobica. Tipicamente, questi studi hanno utilizzato saggi a base di piatti o brodo per studiare le differenze fenotipici tra monocultura e cocoltura. Ad esempio, la cocultura di P. aeruginosa e S. aureus su superfici solide ha permesso la visualizzazione dell'inibizione della crescita o dei cambiamenti nella produzione di fenotipo, pigmento o polisaccharide^{della colonia 14,15,16}. I biofilm di specie miste, su superfici biotiche o abiotiche, nonché le specie batteriche coculturing nella coltura liquida hanno anche permesso di misurazione dei cambiamenti nella crescita, nel metabolismo, nella tolleranza agli antibiotici, nella concorrenza e nella vitalità, oltre all'espressione genica e proteica^17,18. Mentre questi esperimenti di coltura di massa hanno rivelato una visione di come P. aeruginosa e S. aureus potrebbero influenzarsi a vicenda su scala comunitaria, non sono in grado di rispondere a domande importanti sulle interazioni che si svolgono a livello di singola cellula. Il metodo qui presentato si aggiunge agli approcci per studiare le interazioni traspecie concentrandosi sui cambiamenti nel movimento, la vitalità cellulare e l'espressione genica di singole cellule all'interno di una comunità coculuta nel tempo.

Le interazioni a cella singola possono differire ampiamente dalle interazioni che si svolgono in una comunità di celle di massa. Attraverso l'analisi a una singola cellula, l'eterogeneità all'interno di una comunità può essere quantificata per studiare come il posizionamento spaziale delle cellule influenza le dinamiche della comunità o come i livelli di espressione genica e proteica cambiano all'interno dei singoli membri di un gruppo. Le celle di monitoraggio possono anche fornire informazioni su come le singole celle si muovono e si comportano nel tempo, attraverso più generazioni. Monitorando contemporaneamente il movimento cellulare e i cambiamenti nell'espressione genica, è possibile fare correlazioni tra le fluttuazioni geniche e i fenotipi corrispondenti. Sono stati descritti protocolli precedenti per lo studio di singole specie batteriche a livello di singola cellula. Questi studi sfruttano le cellule di imaging dal vivo nel tempo in un unico piano, e sono stati utili per osservare fenotipi come la divisione cellulare e la suscettibilità agli antibiotici^19,20. Ulteriore microscopia a imaging vivo è stata utilizzata per monitorare la crescita, la motilità, la colonizzazione superficiale e la formazione di biofilm di singole specie^{batteriche 21,22,23}. Tuttavia, mentre questi studi sono stati perspicenti per comprendere la fisiologia dei batteri nella monocultura, gli esperimenti per osservare il comportamento di più cellule di più specie batteriche nel tempo nella coculazione sono limitati.

Qui, i protocolli precedenti utilizzati per l'imaging di singole specie sono stati adattati per studiare le interazioni tra P. aeruginosa e S. aureus. Questi organismi possono essere differenziati in fase di contrasto in base alle loro morfologie cellulari (P. aeruginosa sono bacilli e S. aureus sono cocci). Lo sviluppo di questo metodo ha recentemente permesso la visualizzazione dei comportamenti di motilità precedentemente non descritto di P. aeruginosa in presenza di S. aureus²⁴. P. aeruginosa è stato trovato in grado di percepire S. aureus da lontano e rispondere con movimenti uni cellulali aumentati e direzionali verso cluster di cellule S. aureus. P. aeruginosa movimento verso S. aureus è stato trovato per richiedere il tipo IV pili (TFP), proiezioni capelli-come la cui estensione coordinata e retrazione generano un movimento chiamato motilità contrazione²⁵.

Questi studi dimostrano l'utilità di questo metodo per interrogare le interazioni precedenti tra le specie. Tuttavia, l'imaging ad alte densità cellulari nei punti di tempo di interazione successivi è difficile dato che non è più possibile identificare singoli strati di cellule, il che pone principalmente problemi durante l'analisi post-imaging. Data questa limitazione, il metodo è più adatto per le interazioni precedenti che potrebbero quindi essere seguite con saggi macroscopici tradizionali a densità cellulari più elevate rappresentative delle interazioni successive. Ulteriori limitazioni di questo metodo includono la natura a bassa velocità effettiva, poiché è possibile eseguire l'immagine di un solo campione alla volta e il costo del microscopio, della fotocamera e della camera ambientale. Inoltre, la microscopia a fluorescenza pone rischi per le cellule batteriche come la fototossicità e la fotobleaching, limitando così la frequenza con cui le immagini di fluorescenza possono essere acquisite. Infine, i cuscinetti di agarose utilizzati in questo metodo sono altamente suscettibili ai cambiamenti nell'ambiente, il che lo rende fondamentale per il controllo per condizioni come la temperatura e l'umidità, dato che i cuscinetti possono iniziare a ridursi o espandersi se le condizioni non sono corrette. Infine, mentre questo metodo non imita l'ambiente ospite, fornisce indizi su come le diverse specie batteriche rispondono sulle superfici, che possono essere seguite in saggi progettati per imitare le condizioni ambientali/host.

Questo metodo differisce dagli studi precedenti che tracciano il movimento di una singola cellula, in che le cellule sono inoculate tra un cosale e un cuscinetto di agarose, limitando le cellule alla superficie. Ciò consente il tracciamento delle cellule nel tempo in un singolo piano; tuttavia, limita i cicli di coinvolgimento della superficie transitoria osservati quando le cellule sono sommerse nel liquido²⁶. Un ulteriore vantaggio dell'imaging batteri sotto un cuscinetto di agarose è che imita macroscopici saggi di inoculazione sotto-superficie a base di piastra classicamente utilizzati per esaminare P. aeruginosa twitching motility²⁵. In questo saggio, le cellule batteriche sono inoculate tra il fondo di un piatto di Petri e l'agar, mantenendo le cellule in un unico piano mentre si muovono attraverso il fondo del piatto verso l'esterno dal punto di inoculazione, proprio come questo protocollo di microscopia.

Il protocollo di microscopia time-lapse per la visualizzazione delle interazioni interspecie qui presentato consiste di 1) preparare il campione batterico e il tampone di agarose, 2) selezionando le impostazioni del microscopio per l'acquisizione dell'imaging e 3) l'analisi post-imaging. La visualizzazione dettagliata del movimento e del tracciamento delle cellule può essere eseguita mediante l'acquisizione di immagini a brevi intervalli di tempo in base al contrasto di fase. La microscopia a fluorescenza può essere utilizzata anche per determinare la vitalità cellulare o l'espressione genica nel tempo. Qui, mostriamo un esempio di adattamento per la microscopia a fluorescenza attraverso l'aggiunta di coloranti di vitalità ai cuscinetti di agarose.

Protocollo

NOTA: una descrizione completa e i numeri di catalogo per tutti i materiali in questo protocollo sono disponibili nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione del supporto minimo M8T

1. Preparare 1 L di M8 minima sali base (5x) sciogliendo 64 g di Na₂HPO₄7H₂O, 15 g di KH₂PO₄e 2,5 g NaCl in 800 mL di acqua ultrapura (UPW, resistenza 18 MΩ/cm) in una bottiglia da 2 L. pH a 7,6. Volume completo a 1 L con UPW. Autoclave per 45 min.
2. Preparare 500 mL di una soluzione di glucosio (20% w/v) sciogliendo 100 g di glucosio in 400 mL di UPW in una bottiglia da 1 L. Soluzione completa a 500 mL con UPW. Autoclave per 45 min.
3. Preparare 500 mL di una soluzione tryptone (20% w/v) sciogliendo 100 g di tryptone in 400 mL di UPW. Completo a 500 mL con UPW. Autoclave per 45 min.
4. Preparare 1 L di M8 - 10% tryptone (M8T) media minimi aggiungendo 200 mL di 5x M8 sali minimi (1x finale), 10 mL del 20% di glucosio (0 2%finale), 1 mL di 1 M MgSO₄ (1 mM finale) e 50 mL del 20% di tryptone (1% finale) a 600 mL di UPW. Completare a 1 L con UPW. Filtrare attraverso un filtro sterile da 0,2 m in una bottiglia sterile di memoria multimediale da 500 mL.

Giorno 1:

2. Preparazione di colture batteriche durante la notte

1. Inoculare 5 mL di media minimi M8T con una singola colonia di P. aeruginosa o S. aureus (compresi gli antibiotici quando appropriato) e incubare durante la notte a 37 gradi centigradi con aerazione per non più di 16 h.
   NOTA: I patogeni batterici P. aeruginosa e S. aureus sono stati utilizzati per questo metodo, perché sono comunemente coisolati da infezioni croniche, e studiare le loro interazioni è importante capire come contribuiscono agli esiti dei pazienti durante le infezioni polimicrobiche. Altre specie batteriche potrebbero essere utilizzate a seconda del focus dello studio.

Giorno 2:

3. Sottocultura dei ceppi batterici

1. Sottocultura P. aeruginosa 1:500 e S. aureus 1:1000 in 5 mL di M8T fresco (includere antibiotici quando appropriato). Incubare con aerazione a 37 gradi centigradi fino a quando le colture raggiungono la fase di log medio (OD₆₀₀ - 0,3 - 0,5).

4. Preparazione dei materiali per gli stampi pad

1. Preparare le spatole metalliche riscaldando l'estremità di una spatola di laboratorio piatta e arrotondata con un bruciatore Bunsen fino a quando metà dell'estremità piatta può essere piegata ad un angolo di 90 gradi. Riscaldare l'estremità di un'altra spatola di laboratorio piatta e arrotondata e piegare leggermente gli ultimi 10 mm ad un angolo di 45 gradi centigradi.
2. Tagliare i quattro angoli degli stampi in silicone in modo che gli stampi si inserisano all'interno di un piatto da 35 mm.
3. Sterilizzare le spatole e un paio di pinzette aggiungendo il 70% di etanolo e passandole attraverso la fiamma del bruciatore Bunsen.
4. Pulire il piatto e gli stampi in silicone con il 70% di etanolo e asciugarli con salviette senza lanugine.

5. Preparazione di cuscinetti di agarose

NOTA: I cuscinetti sono preparati con il supporto minimo M8T come fonte nutritiva per i batteri utilizzati in questo protocollo. Tuttavia, i nutrienti utilizzati nelle pastiglie possono essere modificati per diversi organismi.

1. Sciogliere il 2% di agarose a basso fusione in 10 mL di M8T in una fiaschetta pulita di 50 mL Erlenmeyer. Microonde a brevi intervalli (2-5 s) fino a quando l'agarose è in soluzione al fine di evitare che il contenuto del pallone di bollire sopra. Una volta sciolti, lasciate raffreddare in un bagno d'acqua di 50 gradi per almeno 15 minuti.
2. Preparare gli stampi allineando il ritaglio in silicone con l'apertura nel piatto da 35 mm e toccare leggermente con la spatola per fissare il silicone al piatto e rimuovere tutte le bolle d'aria tra lo stampo e il piatto.
3. Una volta raffreddato, pipetta 915 L di agarose fuso nello stampo. Lasciare il coperchio socchiuso e lasciare asciugare il pad a temperatura ambiente per 30 min.
4. Coprire il piatto con il coperchio e lasciare a temperatura ambiente per un ulteriore 2 h.
5. Preparare le salviette di umidità arrotolando saldamente una salvietta senza lanugine. Posizionare la salvietta arrotolata all'interno di un piatto Petri sterile e aggiungere uniformemente 500 L di acqua sterile attraverso la salvietta. Caldo a 37 gradi centigradi per 1 h.
6. Scaldare il pad e un piatto sterile da 35 mm a 37 gradi centigradi per 1 h.

6. Preparazione di cellule batteriche e pastiglie inoculanti

1. Misurare l'OD₆₀₀ di ogni sottocultura e diluire P. aeruginosa in un OD₆₀₀ x 0,03 e S. aureus a un OD₆₀₀ x 0,10 in M8T preriwarmed a 37 gradi centigradi. Mescolare P. aeruginosa e S. aureus in un rapporto 1:1 e vortice.
   NOTA: Se i ceppi richiedono antibiotici, gli antibiotici possono essere aggiunti alla notte e alla sottocultura, ma non devono essere aggiunti quando si mescolano specie per l'imaging se colpiscono le altre specie nella cocoltura. La stabilità plasmida e gli effetti degli antibiotici su tutte le specie nella cocultura dovranno essere determinati per ogni organismo/plasmide utilizzato.
2. Pipette 1 L di cocoltura uniformemente sul fondo di un piatto di coperture in vetro pre-riscaldato e sterile da 35 mm.
3. Rimuovere il ritaglio di silicone dallo stampo utilizzando una pinzetta sterile.
4. Togliere il pad dal piatto con spatole sterili.
   1. Scivolare la spatola leggermente piegata sotto il bordo del pad, tenendo lo stampo a testa in giù, per rilasciarlo su un coperchio sterile della piastra Petri.
      NOTA: Fare attenzione a non forzare il pad fuori o si strappa. Tenere traccia di quale lato del pad è il fondo.
5. Trasferire il pad sul piatto con le cellule batteriche, in basso a lato, facendo scorrere la spatola angolata di 90 gradi sotto il pad e posizionandolo sopra il inoculato. Utilizzare la spatola angolata a 90 gradi per rendere il pad a filo contro il coverslip e premere delicatamente eventuali bolle d'aria.
6. Rimuovere l'umidità in eccesso dalle salviette umiditàe, quindi posizionate intorno al bordo del piatto, assicurandosi che non tocchi il pad. Il campione è ora pronto per l'imaging.

7. Impostazione del microscopio per l'imaging dal vivo

1. Camera ambientale calda a 37 gradi centigradi almeno 2 h prima dell'allevarsi in fase sperimentale.
2. Accendere tutti i componenti, tra cui microscopio, computer e sorgenti luminose per l'imaging a campo luminoso e a fluorescenza.
3. Aprire il software di imaging e assicurarsi che le sorgenti di luce siano connesse e in esecuzione.
4. Eseguire l'illuminazione di K'hder^{27 per} allineare tutti i piani dell'immagine.
   1. In primo luogo, portare a fuoco le coverslip contrassegnate con un obiettivo 20x utilizzando un piatto "fittizio". Assicurarsi che la torretta del condensatore sia impostata sulla posizione "aperta".
      NOTA: per ogni obiettivo/campione unico deve essere eseguita l'illuminazione di K'hder per allineare correttamente i piani dell'immagine. Tuttavia, la messa a fuoco e l'allineamento con la piatto "fittizio" sull'ingrandimento inferiore accelera la configurazione su campioni vivi a un ingrandimento più elevato per limitare il tempo tra l'impostazione e l'ora di inizio dell'esperimento.
   2. Mettere a fuoco il condensatore.
      1. Chiudere il diaframma del campo.
         NOTA: dovrebbe apparire un'apertura a forma di ottagono. Se il condensatore è completamente fuori fuoco, l'intero campo di vista (FOV) apparirà scuro.
      2. Ruotare le manopole di messa a fuoco del condensatore fino a quando i bordi dell'ottagono non saranno nitidi.
         NOTA: l'intensità della luce aumenterà man mano che i piani dell'immagine si avvicinano all'allineamento corretto.
   3. Allineare il condensatore.
      1. Centrare il condensatore di campo regolando le manopole di allineamento.
         NOTA: l'ottagono deve essere centrato al centro del FOV. Le manopole di allineamento variano a seconda del microscopio. Ad esempio, alcuni condensatori al microscopio hanno manopole, mentre altri hanno viti che richiedono un driver a vite.
   4. Mettere a fuoco il filamento della lampada e regolare l'apertura del condensatore.
      1. Posizionare un telescopio di fase o una lente Bertrand nel percorso di luce per osservare il piano focale posteriore dell'obiettivo.
         NOTA: Ci dovrebbero essere due cerchi concentrici.
      2. Ruotare la manopola di messa a fuoco dell'obiettivo Bertrand fino a quando gli anelli sembrano nitidi.
      3. Rimuovere l'obiettivo Bertrand dal percorso della luce.
   5. Aprire il diaframma del campo fino a quando l'ottagono è appena fuori dal FOV.
   6. Passare all'obiettivo 100x e far scorrere l'anello di fase di corrispondenza in posizione prima di aggiungere una goccia di olio di immersione, e posizionare il piatto campione preparato sulla parte superiore.
   7. Eseguire l'illuminazione di Kohler sull'obiettivo 100x con il piatto campione batterico.
5. Concentrarsi sui batteri utilizzando solo la regolazione fine. Una volta che i batteri nel FOV sono concentrati attraverso l'oculare, cambiare il percorso di luce alla fotocamera premendo il pulsante della fotocamera al microscopio.
6. Fare clic sull'opzione Fase nel software di imaging.
7. Regolare la percentuale di luce LED DIA emessa selezionando la sorgente luminosa nel software e inserendo manualmente la percentuale di luce desiderata da utilizzare o facendo scorrere la barra sulla scala percentuale della luce.
8. Regolare il tempo di esposizione della luce LED DIA facendo clic sulla sorgente luminosa e inserendo manualmente il tempo di esposizione desiderato o selezionando un tempo di esposizione dal menu a discesa fornito.
   NOTA: il tempo di esposizione varia a seconda della fotocamera utilizzata.
9. Se si utilizza la fluorescenza, regolare le impostazioni della fotocamera in ogni canale corrispondente (ad esempio, TxRed, GFP), facendo clic sul canale fluorescente di interesse.
   1. Impostare la percentuale di luce fluorescenza emessa, quindi regolare il tempo di esposizione (come eseguito nei punti 7.7 e 7.8 per la luce LED DIA).
   2. In alternativa, modificare la profondità di bit per regolare l'intervallo dinamico selezionando una delle altre opzioni di profondità di bit nel menu a discesa dei controlli di visualizzazione.
10. Scegliere le posizioni XY di interesse facendo clic sull'opzione XY nel menu dei controlli di acquisizione.
    1. Spostare la posizione dello stage con il joy stick o facendo clic e trascinando il FOV sullo schermo e fare clic sulla casella vuota per salvare le coordinate X e Y di una posizione specifica.
       NOTA: per l'acquisizione in time-lapse è consigliata la selezione di non più di tre diverse posizioni XY, il più vicino possibile.
11. Accendere il sistema di messa a fuoco perfetto (PFS) facendo clic sulla casella PFS nella scheda XY del menu di controllo di acquisizione o premendo il pulsante PFS sul pannello di controllo joy stick.
12. Ruotare le manopole di regolazione fine per mettere a fuoco le cellule batteriche.
13. Fare clic sul pulsante PFS per ogni posizione XY, una volta che le celle si trovano nel piano di messa a fuoco desiderato.
    NOTA: PFS compensa la deriva nell'asse z durante gli esperimenti time-lapse. Questo è necessario per mantenere la messa a fuoco delle cellule batteriche nel tempo. Diversi produttori hanno diversi sistemi di compensazione.
14. Scegli le condizioni di acquisizione dell'immagine, tra cui l'intervallo di acquisizione e la frequenza per ogni canale (ad esempio, contrasto di fase e ogni fluoroforo) selezionandole dalle opzioni nel menu dei controlli di acquisizione.
    NOTA: Per gli esperimenti qui presentati, le immagini a contrasto di fase vengono acquisite a intervalli ogni 5-10 s, mentre le immagini di fluorescenza nei canali GFP e TxRed vengono acquisite ogni 20 minuti.
15. Iniziare l'imaging una volta che le impostazioni del microscopio e dell'acquisizione sono impostate.

8. Facoltativo: modifiche per l'imaging in tempo reale/morto

1. Sciogliere il 2% di agarose in 10 mL di M8T e lasciare raffreddare in bagno d'acqua di 50 gradi centigradi per almeno 15 min.
2. Aggiungere 1 mM di iodide di propidio all'agarose fuso.
3. Una volta raffreddata, pipetta 915 L di agarose nello stampo preparato.
4. Lasciare il coperchio socchiuso e lasciare asciugare il tampone a temperatura ambiente per 30 min. Proteggere dalla luce.
5. Coprire il piatto con il coperchio e lasciare a temperatura ambiente per un ulteriore 2 h.
6. Preparare salviette di umidità.
   1. Rotolare una carta senza lanugine pulire saldamente.
   2. Mettere la salvietta in un piatto Petri sterile e aggiungere 500 L di acqua sterile alla salvietta.
   3. Incubate a 37 gradi centigradi per 1 h.
7. Incubare il pad e un piatto sterile da 35 mm a 37 gradi centigradi per 1 h.
8. Procedere per inoculare il piatto come indicato nella sezione 6: Preparazione delle cellule batteriche e tamponi inoculanti.

9. Analisi dei dati

1. Identificazione delle cellule
   1. Aprire il file di immagine nel software di imaging e ritagliare il file per includere solo i fotogrammi da utilizzare per il tracciamento, ingrandito le celle di interesse e solo nel canale di contrasto di fase.
      NOTA: il file ritagliato può essere salvato come nuovo file in cui i dati di rilevamento possono essere memorizzati senza interferire con il file originale.
   2. Selezionare l'opzione per scegliere le regioni di interesse (ROI) nel menu dei controlli di analisi e definire i RO tracciando singole cellule batteriche o cluster di celle nel primo fotogramma da utilizzare per l'analisi.
      NOTA: i ROI possono essere definiti manualmente o come file binari.
      1. Definire manualmente il ROI
         1. Traccia il perimetro di ogni singola cellula batterica o cluster di cellule per definire manualmente i ROI.
            NOTA: Nel software di analisi, P. aeruginosa, o altre cellule a forma di asta, possono essere tracciate manualmente selezionando il ROI dell'ellisse e disegnando un'ellisse adattata alle dimensioni della cellula batterica. Ellipse In alternativa, è possibile selezionare l'opzione ROI poligono per tracciare ROI non tradizionali, ad esempio gruppi di celle.
      2. Identificare i ROI binari
         1. Fare clic sull'opzione Binario al ROI per definire i ROI binari.
            NOTA: gli oggetti vengono definiti in un livello binario in base alla separazione delle cellule batteriche pixelate più scure dallo sfondo pixelato più chiaro nel canale di contrasto di fase.
         2. Per sogliare le celle, selezionare l'opzione Soglia nel menu dei controlli di analisi. Selezionare il canale di interesse e far scorrere le barre nell'istogramma di fluorescenza per regolare i valori dell'intervallo di soglia.
            NOTA: l'identificazione di oggetti binari per i ROI può anche essere definita nelle immagini fluorescenti sogliando le cellule batteriche. La soglia stabilisce quali intensità di fluorescenza sono considerate oggetti e quali intensità di fluorescenza costituiscono lo sfondo.
2. Tracciamento delle celle
   1. Per tracciare manualmente i ROI, selezionare il fotogramma successivo nella sequenza di imaging e regolare la posizione dei ROI facendo clic e trascinando ogni ROI per allinearlo alla nuova posizione della cella batterica originale.
      NOTA: Se le cellule batteriche non hanno cambiato posizione, i ROI non devono essere spostati.
   2. Ripetere in tutti i fotogrammi sequenziali per i quali devono essere rilevate le celle.
   3. Quando le celle si dividono, definire le celle figlia come nuovi ROI, come descritto nel passaggio 9.1, e iniziare a tenere traccia delle celle appena divise.
      NOTA: se le celle vengono identificate come binari, utilizzare la funzione Binari traccia per tenere traccia automaticamente dei ROI nei fotogrammi selezionati.
   4. Una volta che le celle sono state tracciate attraverso tutti i fotogrammi selezionati, esportare i dati da analizzare.
   5. Aprire il foglio di calcolo dei dati e identificare le misure necessarie per l'analisi (ad esempio, velocità dell'oggetto, accelerazione o lunghezza del percorso).
      NOTA: nel caso della misura diretta, sono necessarie le misure Lunghezza percorso e Lunghezza linea. La lunghezza della linea è una misura della distanza euclidica, o la distanza retta dall'origine della pista al bordo della colonia di S. aureus. La lunghezza del tracciato è una misura della distanza accumulata o della somma dei segmenti di traccia di tutti i fotogrammi. La direzione può essere calcolata come rapporto tra la distanza euclidiana, D_(E), (Lunghezza linea), sulla distanza accumulata, D_(A), (Lunghezza percorso).
3. Quantificazione della fluorescenza
   1. Definire i ROI per le cellule batteriche fluorescenti come descritto al punto 9.1.
   2. Ripetere il tracciamento o il movimento dei ROI per cellule batteriche o cluster nei fotogrammi fluorescenti rimanenti.
   3. Esportare la tabella generata in un file di foglio di calcolo per l'analisi dell'intensità fluorescente.
   4. Nel foglio di calcolo dei dati, cercare la colonna con "Intensità media" che rappresenta l'intensità media della fluorescenza per il ROI delle cellule batteriche tracciate.
   5. Grafico dei valori intensità media per esaminare i cambiamenti nella fluorescenza nel tempo.
      NOTA: I cambiamenti nella fluorescenza nel tempo rappresentano la fluttuazione dell'espressione genica per il gene di interesse fluorescente.

Risultati

Un uso corretto del metodo descritto comporterà una serie di fotogrammi che generano un video in cui le interazioni traspecie possono essere osservate nel tempo. Lo schema in Figura 1 fornisce un oggetto visivo per evidenziare i passaggi chiave coinvolti nella preparazione dei materiali per l'imaging. L'uso di questo metodo ha permesso la dimostrazione di cellule P. aeruginosa che presentano comportamenti diversi in monocultura rispetto alla cocultura con S. aureus. Rispet...

Discussione

I metodi qui presentati descrivono un protocollo per l'imaging a cellule vive delle interazioni delle specie batteriche a livello di singola cellula con modifiche per altre applicazioni, tra cui il monitoraggio delle cellule e il monitoraggio della vitalità cellulare. Questo metodo apre nuove strade per studiare i comportamenti unicelle dei microrganismi in cocoltura con altre specie nel tempo. In particolare, il protocollo dimostra l'utilità di questo metodo di cocultura nell'osservare i comportamenti della superficie...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose pads
35 mm Glass Bottom Dish with 20 mm Micro-well #1.5 Cover Glass	Cellvis	D35-20-1.5-N	One for agarose pad molds, one for experiment
KimWipes	Kimberly-Clark Professional	06-666A
Low-Melt Agarose	Nu-Sieve GTG/Lonza	50081	For making agarose pads
Round-Bottom Spatulas	VWR	82027-492
Round-Tapered Spatulas	VWR	82027-530
Silicon Isolators, Press-to-Seal, 1 well, D diameter 2.0 mm 20 mm, silicone/adhesive	Sigma-Aldrich	S6685-25EA	For agarose pad molds
Sterile Petri Plates, 85 mm	Kord-Valmark /sold by RPI	2900
Tweezers	VWR	89259-944
M8T Minimal Media
D (+) Glucose	RPI	G32045
KH2PO4	RPI	P250500
MgSO4	Sigma-Aldrich	208094
NaCl	RPI	S23025
Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	230391
Tryptone	BD Biosciences	DF0123173
Microscope
Andor Sona 4.2B-11	Andor	77026135	Camera. 4.2 Megapixel Back-illuminated sCMOS, 11 μm pixel, 95% QE, 48 fps, USB 3.0, F-mount.
Filter Cube GFP	Nikon	96372	Filter cube
Filter Cube TxRed	Nikon	96375	Filter cube
H201-NIKON-TI-S-ER	Okolab	77057447	Stagetop incubator
Nikon NIS-Elements AR with GA3 and 2D and 3D tracking	Nikon	77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950	Software for data analysis
Nikon Ti2 Eclipse	Nikon	Model Ti2-E	Microscope
CFI Plan Apo ƛ20x objective (0.75NA)	Nikon	MRD00205	Objective
CFI Plan Apo ƛ100x oil Ph3 DM objective (1.45NA)	Nikon	MRD31905	Objective
ThermoBox with built-in fan heaters	Tokai Hit	TI2TB-E-BK	Enclosure
Bacterial Strains
Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT)		PMID: 7604262	Non-mucoid prototroph
Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP)		PMID: 9361441
Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2		PMID: 26041805
Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT)		PMID: 23404398	USA300 CA-Methicillin resistant strain LAC without plasmids
Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP)		PMID: 20829608
Staphylococcus aureus USA300 LAC △agrBDCA		PMID: 31713513
Viability Stain
Propidium Iodide	Invitrogen	L7012	LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit