Tek Hücreli Türler Arası Bakteri Etkileşimlerinin Kinetik Görselleştirilmesi

Özet

Bu canlı-bakteriyel hücre görüntüleme protokolü zaman içinde tek hücre düzeyinde birden fazla bakteri türü arasındaki etkileşimlerin görselleştirilmesiiçin izin verir. Hızlandırılmış görüntüleme, tek tek kültür veya ortak kültürdeki her bakteri türünün gözlemlenmesine olanak sağlar ve bireysel hücre hareketliliği ve canlılığı da dahil olmak üzere çok türler arası bakteri topluluklarındaki türler arası etkileşimleri sorgular.

Özet

Polimikrobiyal topluluklar doğada her yerde bulunurlar, ancak etkileşimlerini tek hücre düzeyinde incelemek zordur. Böylece iki bakteriyel patojen arasındaki türler arası etkileşimi gözlemlemek için mikroskopi tabanlı bir yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntemin motile Gram-negatif patojen, Pseudomonas aeruginosa ve non-motile Gram-pozitif patojen, Staphylococcus aureus arasındaki etkileşimleri sorgulamak için kullanımı burada gösterilmiştir. Bu protokol, her türün bir kapak kayması ve bir agarose pedi arasında, hücreleri tek bir düzlemde koruyan ve hem uzay hem de zaman daki bakteri davranışlarının görselleştirilmesine olanak sağlayan bir eş-aşıdan oluşur.

Ayrıca, burada gösterilen zaman atlamalı mikroskopi, monokültürde bakteri türlerinin hareketliliğindeki değişiklikler ve diğer türlerle birlikte kültür de dahil olmak üzere iki veya daha fazla bakteri türü arasında gerçekleşen erken etkileşimleri görselleştirmek için idealdir. Mikroskopi kurulumundaki sınırlı numune alanının doğası nedeniyle, hücre popülasyonları çok yüksek olduğunda bakteri türleri arasındaki etkileşimlerin incelenmesi için bu protokol daha az uygulanabilir. Bununla birlikte, protokolün canlı ve ölü bakteri hücrelerinin görüntülenmesinde boyama, floresan muhabirler aracılığıyla gen veya protein ekspresyonunun sayısallaştırılması ve hem tek tür hem de çok tür deneylerinde bakteri hücresi hareketinin izlenmesi gibi birçok farklı uygulama bulunmaktadır.

Giriş

Polimikrobiyal topluluklar doğada yaygındır, çevre çeşitli kapsayan^1,2,3 ve insan nişler^4,5. İnsan hastalığında en kötü üne sahip polimikrobiyal enfeksiyonların bazıları diş biyofilmleri^{içerir 6}, kronik yaralar^7,8, ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı olan bireylerde solunum yolu enfeksiyonları⁹, ventilatör ilişkili pnömoni¹⁰, ve genetik hastalık kistik fibrozis (CF)^11,12. Bu enfeksiyonlar genellikle çeşitli mikrobiyal türlerden oluşur; Ancak, Gram-pozitif bakteri Staphylococcus aureus ve Gram-negatif bakteri Pseudomonas aeruginosa arasındaki etkileşimleri yeni bir odak ortaya çıkmıştır. Bu organizmalarla birlikte enfekte olmuş ve in vitro analizleri içeren çalışmalar, hastalığın ilerlemesi, mikrobiyal sağkalım, virülans, metabolizma ve antibiyotik duyarlılığı üzerinde derin ve beklenmeyen etkilere sahip olabilecek rekabetçi ve işbirliğine dayalı etkileşimleri ortaya koymaktadır (Hotterbeekx ve ark. 2017¹³ ve Limoli ve Hoffman 2019³tarafından ayrıntılı olarak incelenmiştir).

Enfeksiyon sırasında türler arası etkileşimlere olan ilginin artması, polimikrobiyal topluluk davranışlarını incelemek için çeşitli yöntemler ortaya koymuştur. Tipik olarak, bu çalışmalar monokültür ve coculture arasındaki henotik farklılıkları araştırmak için plaka veya et suyu bazlı tahliller yararlanmış. Örneğin, katı yüzeylerde P. aeruginosa ve S. aureus koculturing büyüme inhibisyonu veya koloni fenotip, pigment veya polisakkarit üretimi^14,,15,16değişiklikler görselleştirme için izin verdi. Karışık türler biyofilmler, biyotik veya abiyotik yüzeylerde, yanı sıra sıvı kültüründe bakteri türlerinin koculturing de büyüme değişiklikleri ölçümü sağlamıştır, metabolizma, antibiyotik tolerans, rekabet ve canlılık, gen ve protein ekspresyonuna ek olarak^17,18. Bu toplu kültür deneyleri P. aeruginosa ve S. aureus'un toplum ölçeğinde birbirlerini nasıl etkileyebileceklerine dair içgörüler ortaya çıkarmış olsa da, tek hücre düzeyinde gerçekleşen etkileşimler hakkında önemli soruları cevaplayamamaktadırlar. Burada sunulan yöntem, zaman içinde bir topluluk içinde tek hücrelerin hareket, hücre canlılığı ve gen ekspresyonundaki değişikliklere odaklanarak türler arası etkileşimleri inceleme yaklaşımlarına katkıda bulunur.

Tek hücreli etkileşimler, hücrelerin toplu topluluğunda gerçekleşen etkileşimlerden büyük ölçüde farklı olabilir. Tek hücreli analiz yoluyla, bir topluluk içindeki heterojenlik, hücrelerin mekansal yerleşiminin toplum dinamiklerini nasıl etkilediğini veya bir grubun bireysel üyeleri içinde gen ve protein ekspresyon düzeylerinin nasıl değiştiğini incelemek için ölçülebilir. İzleme hücreleri, tek hücrelerin birden fazla nesil boyunca zaman içinde nasıl hareket edip nasıl hareket ettigini de içgörü sağlayabilir. Hücre hareketini ve gen ekspresyonundaki değişiklikleri eş zamanlı olarak izleyerek gen dalgalanmaları ile buna karşılık gelen fenotipler arasında korelasyonlar yapılabilir. Tek hücredüzeyinde tek tek bakteri türlerinin incelenmesi için önceki protokoller tanımlanmıştır. Bu çalışmalar tek bir düzlemde zaman içinde canlı görüntüleme hücrelerinin yararlanmak, ve hücre bölünmesi ve antibiyotik duyarlılık gibi fenotipler gözlemlemek için yararlı olmuştur^19,20. Ek canlı görüntüleme mikroskopisi büyüme, hareketlilik, yüzey kolonizasyonu ve tek bakteri türlerinin biyofilm^oluşumunuizlemek için kullanılmıştır 21^,22,23. Ancak, bu çalışmalar monokültürde bakterilerin fizyolojisini anlamak için anlayışlı olmakla birlikte, coculture zaman içinde birden fazla bakteri türünün tek hücreli davranışgözlem için deneyler sınırlıdır.

Burada, tek türgörüntüleme için kullanılan önceki protokoller P. aeruginosa ve S. aureusarasındaki etkileşimleri incelemek için uyarlanmıştır. Bu organizmalar hücre morfolojilerine göre faz kontrastı altında ayırt edilebilirler(P. aeruginosa basilli, S. aureus ise kokidir). Bu yöntemin geliştirilmesi son zamanlarda S. aureus²⁴varlığında P. aeruginosa daha önce tanımlanmamış hareketlilik davranışlarının görselleştirilmesi sağladı. P. aeruginosa'nın S. aureus'u uzaktan algılama ve S. aureus hücre kümelerine doğru artan ve yönlü tek hücreli hareketlerle yanıt verme yeteneğine sahip olduğu bulunmuştur. S. aureus doğru P. aeruginosa hareketi tip IV pili gerektiren bulundu (TFP), koordine uzantısı ve geri çekme seğirme hareketliliği denilen bir hareket oluşturmak saç benzeri projeksiyonlar²⁵.

Bu çalışmalar türler arasındaki daha önceki etkileşimleri sorgulamak için bu yöntemin yararını göstermektedir. Ancak, daha sonraki etkileşim zaman noktalarında yüksek hücre yoğunluklarında görüntüleme, daha sonra tek hücre tabakalarının tanımlanamayacağı göz önüne alındığında zordur ve bu da çoğunlukla görüntüleme sonrası analiz sırasında sorunlara yol açabilir. Bu sınırlama göz önüne alındığında, yöntem daha sonra daha sonraki etkileşimleri temsil eden yüksek hücre yoğunlukları temsilcisi geleneksel makroskopik tahliller ile takip edilebilir önceki etkileşimler için en uygundur. Bu yöntemin ek sınırlamaları düşük iş bölümü doğasını içerir, çünkü bir seferde yalnızca bir örnek görüntülenebilir ve mikroskop, kamera ve çevre odasının maliyeti. Ayrıca floresan mikroskopisi fototoksisite ve fotobeyaztma gibi bakteri hücreleri için risk oluşturur, bu nedenle floresan görüntülerin elde edilebilir sıklığını sınırlayan. Son olarak, bu yöntemde kullanılan agarose pedleri, koşullar doğru değilse pedleri küçültmeye veya genişletmeye başlayabilir göz önüne alındığında, sıcaklık ve nem gibi koşulları kontrol etmek için kritik hale, ortamdaki değişikliklere son derece duyarlıdır. Son olarak, bu yöntem ana ortam taklit etmez iken, farklı bakteri türlerinin yüzeylerde nasıl tepki ipuçları sağlar, hangi çevresel / konak koşulları taklit etmek için tasarlanmış tahlillerde takip edilebilir.

Bu yöntem, tek hücreli hareketi takip eden önceki çalışmalardan farklıdır, bu hücreler bir coverslip ve agarose ped arasında aşılanmış, yüzeyhücreleri kısıtlayan. Bu, hücre izlemenin tek bir düzlemde zaman içinde izlenmesini sağlar; ancak, hücreler sıvı^26'yabatırıldığında gözlenen geçici yüzey etkileşimdöngülerini sınırlar. Bir agarose ped altında görüntüleme bakterilerin bir diğer yararı klasik P. aeruginosa seğirme motilite²⁵incelemek için kullanılan makroskopik plaka tabanlı yüzey altı inogülasyon tahlilleri taklit olmasıdır. Bu testte, bakteri hücreleri petri kabının alt kısmı ile agar arasında aşılanır, bu mikroskop protokolü gibi, kabın alt kısmından dışa doğru hareket ederken hücreleri tek bir düzlemde tutarlar.

Burada sunulan türler arası etkileşimleri görselleştirmek için hızlandırılmış mikroskopi protokolü 1) bakteri örneği ve agarose pedinhazırlanması, 2) görüntüleme edinimi için mikroskop ayarlarının seçilmesi ve 3) görüntüleme sonrası analizden oluşur. Hücre hareketinin ve takibinin ayrıntılı görselleştirilmesi, faz kontrastı ile kısa zaman aralıklarında görüntülerin elde edilmesiyle gerçekleştirilebilir. Floresan mikroskopisi de zaman içinde hücre canlılığını veya gen ekspresyonunu belirlemek için kullanılabilir. Burada, floresan mikroskobu için adaptasyon bir örnek agarose pedleri için canlılık boyaları eklenmesi ile göstermektedir.

Protokol

NOT: Bu protokoldeki tüm sarf malzemelerinin tam açıklama ve katalog numaralarını Malzemeler Tablosu'nda bulabilirsiniz.

1. M8T minimal ortamın hazırlanması

1. 2 L şişede 64 g Na₂HPO₄·7H₂O, 15 g KH₂PO₄ve 800 mL ultra saf suda (UPW, direnç 18 MΩ/cm) 2,5 g NaCl eriterek 1 L M8 minimal tuz tabanı (5x) hazırlayın. pH 7.6'ya kadar. UPW ile 1 L'ye kadar tam ses düzeyi. 45 dk için otoklav.
2. 1 L şişede 400 mL UPW'de 100 g glikoz uğrarak 500 mL glikoz çözeltisi (%20 w/v) hazırlayın. UPW ile 500 mL'ye komple çözüm. 45 dk için otoklav.
3. 400 mL UPW'de 100 g tripton eriterek 500 mL tripton çözeltisi (%20 w/v) hazırlayın. UPW ile 500 mL'ye kadar tamamlayın. 45 dk için otoklav.
4. 200 mL 5x M8 minimal tuz (1x final), 10 mL %20 glikoz (%0,2 final), 1 mL 1 MMG 1 MgSO₄ (1 mM final) ve 50 mL %20 tryptone (%1 final) ilave ederek 1 L M8 + %10 tripon (M8T) minimal ortam hazırlayın. UPW ile 1 L'ye kadar tamamlayın. Steril 500 mL ortam depolama şişesine 0,2 m steril filtreden süzün.

1. Gün:

2. Bakteri bir gecede kültürlerinin hazırlanması

1. 5 mL M8T minimal ortama tek bir P. aeruginosa veya S. aureus kolonisi ile aşılanın (uygun olduğunda antibiyotikler dahil) ve bir gecede 37 °C'de 16 saatten fazla havalandırma ile kuluçkaya yatırın.
   NOT: Bakteriyel patojenler P. aeruginosa ve S. aureus bu yöntem için kullanılmıştır, çünkü bunlar genellikle kronik enfeksiyonlardan koizole edilmiştir ve bunların etkileşimlerinin incelenmesi polimikrobiyal enfeksiyonlar sırasında hasta sonuçlarına nasıl katkıda bulunmalarını anlamak için önemlidir. Diğer bakteri türleri çalışmanın odağına bağlı olarak kullanılabilir.

2. Gün:

3. Bakteriyel suşların alt kültürü

1. Alt kültür P. aeruginosa 1:500 ve S. aureus 1:1000 taze M8T 5 mL (uygun olduğunda antibiyotik içerir). Kültürler orta günlük fazına ulaşınceye kadar 37 °C'de kuluçkaya yatırın (OD₆₀₀ = ~0,3 - 0,5).

4. Ped kalıpları için malzemelerin hazırlanması

1. Düz ucun yarısı 90° açıya bükülene kadar düz, yuvarlak bir laboratuvar spatulasının ucunu Bunsen brülörüyle ısıtarak metal spatulahazırlayın. Başka bir düz, yuvarlak laboratuvar spatulasının ucunu ısıtın ve son 10 mm'yi 45 °C'lik bir açıya hafifçe bükün.
2. Silikon kalıpların dört köşesini, kalıpların 35 mm'lik bir tabağa sığacak şekilde kesin.
3. % 70 etanol ekleyerek ve Bunsen brülör alev onları geçirerek spatulalar ve cımbız bir çift sterilize.
4. Çanak ve silikon kalıpları %70 etanol ile temizleyin ve tüy bırakmayan mendillerle kurulayın.

5. Agarose pedlerin hazırlanması

NOT: Pedler, bu protokolde kullanılan bakterilerin besin kaynağı olarak M8T minimal ortam ile hazırlanır. Ancak, pedleri kullanılan besin farklı organizmalar için değiştirilebilir.

1. Temiz bir 50 mL Erlenmeyer şişesinde 10 mL M8T'de %2 düşük erime agarose eritin. Mikrodalga kısa aralıklarla (2-5 s) kadar agarose üzerinde kaynama gelen şişe içeriğini önlemek için çözelti içinde. Eritildikten sonra, en az 15 dakika 50 °C su banyosunda soğumaya bırakın.
2. 35 mm çanak açıklık ile silikon kesim hizalayarak kalıpları hazırlayın ve çanak silikon güvenli ve kalıp ve çanak arasındaki tüm hava kabarcıkları kaldırmak için spatula ile hafifçe dokunun.
3. Bir kez serin, pipet 915 μL erimiş agarose kalıp içine. Kapağı açık bırakın ve 30 dakika oda sıcaklığında ped kuru maya bırakın.
4. Kapağı kapağı ile çanak ve ek bir 2 saat oda sıcaklığında bırakın.
5. Tüy bırakmayan bir mendil sıkıca yuvarlayarak nem mendilleri hazırlayın. Haddelenmiş mendilin üzerine steril petri kabının içine yerleştirin ve sile doğru 500°L steril su ekleyin. 1 saat boyunca 37 °C'ye kadar ılık.
6. 1 saat boyunca 37 °C'ye kadar pedi ve steril 35 mm çanak ısıtın.

6. Bakteri hücrelerinin hazırlanması ve aşı pedleri

1. Her alt kültürün OD_600'ü ölçün ve P. aeruginosa'yı OD₆₀₀ = 0,03 ve S. aureus'u 37 °C'ye önceden ısıtılmış M8T'de₆₀₀ = 0,10'a kadar seyreltin. P. aeruginosa ve S. aureus'u 1:1 oran ve girdap olarak karıştırın.
   NOT: Suşlar antibiyotik gerektiriyorsa, antibiyotikler bir gecede ve alt kültüre eklenebilir, ancak eşkültürdeki diğer türleri etkiliyorsa görüntüleme için türlerin karıştırılması nda eklenmemelidir. Plazmid stabilitesi ve antibiyotiklerin kokültürdeki tüm türler üzerindeki etkileri, kullanılan her organizma/plazmid için belirlenmelidir.
2. Pipet 1 μL coculture eşit bir önceden ısıtılmış, steril 35 mm cam coverslip çanak altında.
3. Steril cımbız kullanarak kalıptan silikon kesiti çıkarın.
4. Steril spatulalar kullanarak pedi yemekten çıkarın.
   1. Yastık kenarının altında hafifçe bükülmüş spatula slip, baş aşağı kalıp tutarken, steril bir Petri plaka kapağı üzerine bırakın.
      NOT: Pedi dışarı zorlamamaya dikkat edin yoksa yırtın. Pedin hangi tarafının alt tabaka olduğunu takip edin.
5. Pedi, 90° açılı spatulayı pedin altına kaydırarak ve aşılanmış kapak kaymasının üzerine yerleştirerek alt-yan aşağı bakteri hücreleriyle tabağa aktarın. 90° açılı spatulayı kullanarak pedi kapak kaymasına karşı temize çıkarın ve hava kabarcıklarını hafifçe bastırın.
6. Nemli mendillerdeki fazla nemi çıkarın ve ardından yemeğin kenarına yerleştirin ve yüzeye dokunmadığından emin olun. Örnek görüntüleme için hazır.

7. Canlı görüntüleme için mikroskobun kurulması

1. Deneysel kurulumdan en az 2 saat önce 37 °C'ye kadar sıcak çevre odası.
2. Brightfield ve floresan görüntüleme için mikroskop, bilgisayar ve ışık kaynakları dahil olmak üzere tüm bileşenleri açın.
3. Görüntüleme yazılımını açın ve ışık kaynaklarının bağlı ve çalışır durumda olduğundan emin olun.
4. Tüm görüntü düzlemlerini hizalamak için Köhler aydınlatma²⁷ gerçekleştirin.
   1. İlk olarak, bir "kukla" çanak kullanarak 20x hedefi ile odak işaretli coverslip getirmek. Kondansatör taretinin "açık" konuma ayarlandıklarına emin olun.
      NOT: Görüntü düzlemlerini düzgün bir şekilde hizalamak için her benzersiz amaç/örnek için Köhler aydınlatması yapılmalıdır. Ancak, odak ve düşük büyütme üzerinde "kukla" çanak ile uyum kurulum ve deneme başlangıç zamanı arasındaki zamanı sınırlamak için daha yüksek büyütme canlı numuneler üzerinde kurulum hızlandırır.
   2. Kondansiyi odakla.
      1. Alan diyaframını kapatın.
         NOT: Sekizgen şekilli bir diyafram açıklığı görünmelidir. Kondansatör tamamen odak dışında ise, tüm görüş alanı (FOV) koyu görünür.
      2. Sekizgen kenarlar net olana kadar kondansatör odaklama düğmelerini döndürün.
         NOT: Görüntü düzlemleri doğru hizaya yaklaştıkça ışık yoğunluğu artacaktır.
   3. Kondansiyi hizala.
      1. Hizalama düğümlerini ayarlayarak alan kondansini ortala.
         NOT: Sekizgen FOV'un ortasına ortalanmalıdır. Hizalama düğümleri mikroskoba bağlı olarak değişir. Örneğin, bazı mikroskop kondansatörleri tonoblara sahipken, bazılarında tornavida gerektiren vidalar vardır.
   4. Lamba filamentine odaklanın ve kondansatör diyaframAçıklığını ayarlayın.
      1. Hedefin arka odak düzlemini gözlemlemek için ışık yoluna bir faz teleskopu veya Bertrand lens yerleştirin.
         NOT: İki eşmerkezli daire olmalıdır.
      2. Halkalar net görünene kadar Bertrand lens odak düğmesini çevirin.
      3. Bertrand lensini ışık yolundan çıkarın.
   5. Sekizgen FOV'un hemen dışında olana kadar alan diyaframını açın.
   6. 100x hedefine değiştirin ve bir damla daldırma yağı eklemeden önce eşleşen faz halkasını yerine kaydırın ve hazırlanan numune kabını en üste yerleştirin.
   7. Bakteriyel örnek çanak ile 100x objektif Köhler aydınlatma gerçekleştirin.
5. Sadece ince ayar kullanarak bakterilere odaklanın. FOV'daki bakteriler mercek boyunca odaklandıktan sonra, mikroskoptaki kamera düğmesine basarak ışık yolunu kameraya çevirin.
6. Görüntüleme yazılımında Aşama seçeneğini tıklatın.
7. Yazılımdaki ışık kaynağını seçerek ve kullanılmak üzere istenilen ışık yüzdesini el ile girerek veya Çubuğu ışık yüzdesi ölçeğinde kaydırarak yayılan DIA LED ışığının yüzdesini ayarlayın.
8. Dia LED ışık pozlama süresini, ışık kaynağına tıklayarak ve istenilen pozlama süresini manuel olarak girerek veya sağlanan açılır menüden bir pozlama süresi seçerek ayarlayın.
   NOT: Pozlama süresi kullanılan kameraya bağlı olarak değişir.
9. Floresan kullanıyorsanız, ilgili her kanaldaki kamera ayarlarını (örneğin, TxRed, GFP) floresan kanalına tıklayarak ayarlayın.
   1. Yayılan floresan ışığının yüzdesini ayarlayın, ardından pozlama süresini ayarlayın (DIA LED ışığı için 7,7 ve 7,8 adımlarında yapıldığı gibi).
   2. Alternatif olarak, görselleştirme denetimleri açılır menüsündeki diğer bit derinliği seçeneklerinden birini seçerek dinamik aralığı ayarlamak için bit derinliğini değiştirin.
10. Edinme denetimleri menüsündeki XY seçeneğini tıklayarak ilgi çekici XY konumlarını seçin.
    1. Sahne konumunu sevinç çubuğuyla veya ekrandaki FOV'u tıklatıp sürükleyerek taşıyın ve belirli bir konumun X ve Y koordinatlarını kaydetmek için boş kutuya tıklayın.
       NOT: En fazla üç farklı XY pozisyonunun seçilmesi, mümkün olduğunca birbirine yakın, hızlandırılmış edinim için önerilir.
11. Satın alma kontrol menüsünün XY sekmesindeki PFS kutusunu tıklatarak veya joy stick kontrol panelindeki PFS düğmesine basarak mükemmel odak sistemini (PFS) açın.
12. Bakteri hücrelerine odaklanmak için ince ayar düğümlerini döndürün.
13. Hücreler istenilen odak düzleminde olduktan sonra her XY konumu için PFS düğmesini tıklatın.
    NOT: PFS, zaman atlamalı deneyler sırasında Z eksenindeki sürüklenmeyi telafi eder. Bu zaman içinde bakteri hücrelerinin odak korumak için gereklidir. Farklı üretimler farklı kompanzasyon sistemlerine sahiptir.
14. Edinme denetimleri menüsündeki seçeneklerden seçim yaparak her kanal için satın alma aralığı ve sıklığı (örneğin, faz kontrastı ve her florofor) dahil olmak üzere görüntü edinme koşullarını seçin.
    NOT: Burada sunulan deneylerde faz kontrastı görüntüleri her 5-10 sn aralıklarla elde edilirken, GFP ve TxRed kanallarındaki floresan görüntüler her 20 dakikada bir elde edilir.
15. Mikroskop ve edinme ayarları ayarlandıktan sonra görüntülemeye başlayın.

8. İsteğe bağlı: Canlı/ölü görüntüleme için modifikasyonlar

1. M8T'nin 10 mL'sinde %2 agarose eritin ve 50 °C su banyosunda en az 15 dakika soğumaya bırakın.
2. Erimiş agarose propidium iyodür 1 mM ekleyin.
3. Soğuduktan sonra, hazırlanan kalıpta 915 μL agarose.
4. Kapağı açık bırakın ve 30 dakika oda sıcaklığında ped kuru maya bırakın. Işıktan koruyun.
5. Kapağı kapağı ile çanak ve ek bir 2 saat oda sıcaklığında bırakın.
6. Nem mendilleri hazırlayın.
   1. Tüy bırakmayan bir kağıdı sıkıca yuvarlayın.
   2. Mendili steril bir Petri kabına yerleştirin ve menisine 500°L steril su ekleyin.
   3. 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
7. 37 °C'de 1 saat boyunca pedi ve steril 35 mm çanak kuluçkaya yatırın.
8. Bölüm 6'da belirtildiği gibi çanak aşılamaya devam edin: Bakteri hücrelerinin hazırlanması ve aşıpedleri.

9. Veri analizi

1. Hücrelerin tanımlanması
   1. Görüntüleme yazılımındaki görüntü dosyasını açın ve dosyayı yalnızca izleme için kullanılacak çerçeveleri içerecek şekilde kırpın, ilgi hücrelerine yakınlaştırın ve yalnızca faz kontrast ı sevesi kanalında.
      NOT: Kırpılan dosya, izleme verilerinin özgün dosyaya müdahale etmeden depolanabileceği yeni bir dosya olarak kaydedilebilir.
   2. Çözümleme denetimleri menüsünde ilgi çekici bölgeleri (YG) seçme seçeneğini seçin ve analiz için kullanılacak ilk karedeki tek tek bakteri hücrelerini veya hücre kümelerini izleyerek ROI'ları tanımlayın.
      NOT: ROI'lar el ile veya ikili olarak tanımlanabilir.
      1. Yatırım Getirisini el ile tanımlayın
         1. RoI'ları el ile tanımlamak için her bir bakteri hücresinin veya hücre kümelerinin çevresini izlendirin.
            NOT: Analiz yazılımında, P. aeruginosa, veya diğer çubuk şekilli hücreler, Ellips Yatırım Getirisi seçilerek ve bakteri hücresinin boyutuna göre ayarlanmış bir elips çizilerek elle izlenebilir. Alternatif olarak, çokgen yatırım getirisi seçeneği, hücre kümeleri gibi geleneksel olmayan şekilli ROI'ları izlemek için seçilebilir.
      2. İkili ROI'ları tanımlayın
         1. İkili ROI'ları tanımlamak için İkili YG seçeneğini tıklatın.
            NOT: Nesneler, faz kontrast ı kanalındaki daha açık pikselli arka plandan koyu pikselli bakteri hücrelerinin ayrılmasına dayanan ikili bir katmanda tanımlanır.
         2. Hücreleri eşlemek için çözümleme denetimleri menüsünde Eşik seçeneğini belirleyin. İlgi kanalını seçin ve eşik aralığı değerlerini ayarlamak için floresan histogramındaki çubukları kaydırın.
            NOT: ROI'lar için ikili nesne tanımlaması, bakteri hücrelerinin eşiğine gelindiğinde floresan görüntülerde de tanımlanabilir. Eşik, hangi floresan yoğunluklarının nesne olarak kabul edilir ve hangi floresan yoğunlukları arka planı oluşturur.
2. Hücre izleme
   1. ROI'ları el ile izlemek için, görüntüleme dizisindeki bir sonraki kareyi seçin ve her YG'yi orijinal bakteri hücresinin yeni konumuyla hizalamak üzere tıklatıp sürükleyerek ROI'ların konumunu ayarlayın.
      NOT: Bakteri hücrelerinin konumları değişmemişse, ROI'ların taşınması gerekmez.
   2. Hücrelerin izlendiği tüm sıralı karelerde tekrarlayın.
   3. Hücreler bölündükçe, adım 9.1'de açıklandığı gibi, kız hücreleri yeni ROI'lar olarak tanımlayın ve yeni bölünmüş hücreleri izlemeye başlayın.
      NOT: Hücreler ikili olarak tanımlanırsa, seçili karelerde ROI'ları otomatik olarak izlemek için Parça İkilileri işlevini kullanın.
   4. Hücreler seçili tüm kareler boyunca izlendikten sonra, analiz edilecek verileri dışa aktarın.
   5. Veri tablosunu açın ve analiz için gereken ölçümleri (örneğin, nesne hızı, ivme veya yol uzunluğu) tanımlayın.
      NOT: Yönlendirselliğin ölçülmesi durumunda Yol Uzunluğu ve Çizgi Uzunluğu ölçümleri gereklidir. Çizgi Uzunluğu, Öklidizya mesafesinin veya pist inden S. aureus kolonisinin kenarına doğru düz bir mesafenin ölçümüdür. Yol Uzunluğu, biriken mesafenin veya tüm çerçevelerden parça segmentlerinin toplamının bir ölçüsüdür. Yönlendirilme, Ökaryodi uzaklığı, D_(E), (Çizgi Uzunluğu), birikmiş mesafe, D_(A), (Yol Uzunluğu) oranı olarak hesaplanabilir.
3. Floresan nicelleştirme
   1. Adım 9.1'de açıklandığı gibi floresan bakteri hücreleri için ROI'ları tanımlayın.
   2. Kalan floresan çerçevelerde bakteri hücreleri veya kümeler için ROI'ların izini veya hareketini tekrarlayın.
   3. Floresan yoğunluğunun analizi için oluşturulan tabloyu elektronik tablo dosyasına dışa aktarın.
   4. Veri tablosunda, izlenen bakteri hücresi(ler) Yatırım Getirisi için ortalama floresan yoğunluğunu temsil eden "Ortalama Yoğunluk" sütununa bakın.
   5. Zaman içinde floresan daki değişimlere bakmak için Ortalama Yoğunluk değerlerini grafiklendirin.
      NOT: Floresan'ın zaman içinde değişimi, floresan olarak etiketlenmiş gen için gen ekspresyonundaki dalgalanmayı temsil eder.

Sonuçlar

Açıklanan yöntemin başarılı bir şekilde kullanılması, türler arası etkileşimlerin zaman içinde gözlemlenebildiği bir video oluşturan bir dizi kareyle sonuçlanır. Şekil 1'deki şema, görüntüleme için malzemelerin hazırlanmasında yer alan önemli adımları vurgulamak için görsel bir görüntü sağlar. Bu yöntemin kullanımı S. aureusile coculture karşı monokültür farklı davranışlar sergileyen P. aeruginosa hücrelerinin gösteri izin verd...

Tartışmalar

Burada sunulan yöntemler, hücre izleme ve hücre canlılığının izlenmesi de dahil olmak üzere diğer uygulamalar için değişiklikler ile tek hücre düzeyinde bakteri türleri etkileşimlerinin canlı hücre görüntüleme için bir protokol açıklar. Bu yöntem, mikroorganizmaların zaman içinde diğer türlerle birlikte tek hücreli davranışlarını incelemek için yeni yollar açılmaktadır. Özellikle protokol, özellikle hem yüzey hem de sıvı ile ilişkili uzantıları olan organizmaların hareketli...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose pads
35 mm Glass Bottom Dish with 20 mm Micro-well #1.5 Cover Glass	Cellvis	D35-20-1.5-N	One for agarose pad molds, one for experiment
KimWipes	Kimberly-Clark Professional	06-666A
Low-Melt Agarose	Nu-Sieve GTG/Lonza	50081	For making agarose pads
Round-Bottom Spatulas	VWR	82027-492
Round-Tapered Spatulas	VWR	82027-530
Silicon Isolators, Press-to-Seal, 1 well, D diameter 2.0 mm 20 mm, silicone/adhesive	Sigma-Aldrich	S6685-25EA	For agarose pad molds
Sterile Petri Plates, 85 mm	Kord-Valmark /sold by RPI	2900
Tweezers	VWR	89259-944
M8T Minimal Media
D (+) Glucose	RPI	G32045
KH2PO4	RPI	P250500
MgSO4	Sigma-Aldrich	208094
NaCl	RPI	S23025
Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	230391
Tryptone	BD Biosciences	DF0123173
Microscope
Andor Sona 4.2B-11	Andor	77026135	Camera. 4.2 Megapixel Back-illuminated sCMOS, 11 μm pixel, 95% QE, 48 fps, USB 3.0, F-mount.
Filter Cube GFP	Nikon	96372	Filter cube
Filter Cube TxRed	Nikon	96375	Filter cube
H201-NIKON-TI-S-ER	Okolab	77057447	Stagetop incubator
Nikon NIS-Elements AR with GA3 and 2D and 3D tracking	Nikon	77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950	Software for data analysis
Nikon Ti2 Eclipse	Nikon	Model Ti2-E	Microscope
CFI Plan Apo ƛ20x objective (0.75NA)	Nikon	MRD00205	Objective
CFI Plan Apo ƛ100x oil Ph3 DM objective (1.45NA)	Nikon	MRD31905	Objective
ThermoBox with built-in fan heaters	Tokai Hit	TI2TB-E-BK	Enclosure
Bacterial Strains
Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT)		PMID: 7604262	Non-mucoid prototroph
Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP)		PMID: 9361441
Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2		PMID: 26041805
Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT)		PMID: 23404398	USA300 CA-Methicillin resistant strain LAC without plasmids
Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP)		PMID: 20829608
Staphylococcus aureus USA300 LAC △agrBDCA		PMID: 31713513
Viability Stain
Propidium Iodide	Invitrogen	L7012	LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit