דוגמנות דלקת כבד B וירוס ב-t-הפטיטיס 293T-NE-3NRs תאים

Summary

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט עבור הפטיטיס B וירוס (HBV) זיהום בתאי 293T מהונדסים הרומן (293T-NE-3NRs, הבעת NTCP אנושי, HNF4α, RXRα ו PPARα) ותאי הכבד המסורתית (HepG2-NE, ביטוי האדם NTCP).

Abstract

HBV מדביק בעיקר את הפטוציטים האנושית, אבל זה גם נמצא להדביק רקמות חוץ הכבד כגון כליות ובנות. עם זאת, מודלים מבוססי תא hbv מוגבלים לקווי התאים של hepatoma (כגון HepG2 ו Huh7) על-ידי הבעת קולטן hbv תפקודית, סודיום טאורוכולאט הובלת פוליפטידים (ntcp). כאן, השתמשנו 293T-NE-3NRs (293T ביטוי יתר של האדם NTCP, HNF4α, RXRα ו PPARα) ו HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) כמו קווי תא דגם.   הידבקות HBV בקווי תאים אלה בוצעה גם באמצעות חלקיקי וירוס HBV מרוכזים מ-HepG 2.2.15 או co-culturing HepG 2.2.15 עם קווי תא היעד. בוצעה כדי לאשר. זיהום של HBV שתי השיטות המוצגות כאן תסייע לנו ללמוד זיהום HBV בקווים שאינם תאי הכבד.

Introduction

צהבת B משפיע על חייהם של יותר מ-2,000,000,000 אנשים והוא אחד האיומים העיקריים לבריאות הציבור. כ 257,000,000 אנשים נגועים באופן כרוני עם צהבת B וירוס (HBV) ברחבי העולם, גרימת נטל גדול לחברה¹. Hepatocytes הם לא התאים היחידים הנגועים על ידי hbv ותאים אחרים ברקמה שאינה הכבד, כגון כליות ובנות, הם נגועים גם על ידי וירוס זה^2,3. כיום, מודלים תא הזיהום HBV מוגבלים האדם hepatocytes עם רק כמה מודלים שאינם הכבד קו התא. זה הסלים המחקר של זיהום HBV ו-HBV הקשורות הפתולוגיה של רקמות לא הכבד. כאן אנו מציגים פרוטוקולים כדי ללמוד זיהום HBV בתאי 293T שאינם הכבד, כמו גם בתאים hepatoma מבוססי.

סודיום טאורוכולאט שיתוף פוליפטידים (ntcp) הוא קולטן תפקודית עבור צהבת האדם B ו הפטיטיס D וירוס⁴. Hepatocyte גורם גרעיני 4α (HNF4α), קולטן X retinoid α (rxrα) ו פראוקסיזום המופעל מפיצים מופעל α (pparα) הם הכבד מועשר שעתוק גורמים הגבלת tropism ויראלי של hbv. הם אומתו לקדם את הסינתזה של HBV RNA ותמיכה ב-HBV בשכפול התאים^בתוךקו שאינו תא 5. בנינו שלושה קווי תא שונים, HepG2 התאים קווי המבטא NTCP (HepG2-NE), 293T התא t המבטא NTCP (293T-NE) ו 293T התא t להביע ארבעה גנים מארחים; NTCP, HNF4α, RXRα ו PPARα (293T-NE-3NRs). שתי שיטות לזיהום HBV פותחו על בסיס 293T-NE-3NRs (איור 1). השיטה הראשונה משתמשת בחיסונים ב-293T-NE-3NRs עם שקילות הגנום ויראלי גבוהה (GEq גבוה (150), DMSO ו PEG8000) עבור 24 h. השיטה השנייה מעסיקה co-culturing 293T-NE-3NRs עם HepG 2.2.15, אשר יכול לייצר חלקיקי HBV (GEq נמוך (על 1.83) ללא DMSO ו PEG8000), ובכך היטב מחקות את התנאים הטבעיים.

התאים hepg 2.2.15 נגזרים מהקו HepG2 ובאופן כרוני מפרישות hbv זיהומיות, כמו גם חלקיקים תת ויראלי לתוך מדיום התרבות^6,7. ציקלוספורין A (CsA) הוא מדכא חיסוני קליני המשמש לדיכוי דחייה של השתל. מחקרים הראו כי CsA מעכב את כניסת HBV לתוך החלציטים תרבותית על ידי עיכוב פעילות הטרנספורטר של NTCP וחסימת האיגוד של NTCP כדי חלבונים מעטפה גדולה⁸.

HepG2-NE תאים שימשו שליטה חיובית ואילו תאים שטופלו CsA שימשו שליטה שלילית. על ידי השוואת עם קבוצות שליטה חיוביות ושליליות, אנחנו יכולים לגלות אילו גנים מארחים לשחק תפקיד קריטי בזיהום HBV. בנוסף, באמצעות מצב זה של זיהום HBV, אנחנו יכולים גם למצוא מנגנונים חדשניים אחרים או גנים מארחים המעורבים בזיהום HBV.

Protocol

תרבות, אוסף של סופרנטנים מן התאים hepg 2.2.15 ו הזיהום hbv יש לבצע ברמת בטיחות II (P2) או ביולוגי רמת בטיחות III (P3) המעבדה על פי ההדרכה אבטחה טיחות בארץ. שיטות בטיחות מעבדה צריך להיות בעקבות כדי להבטיח את הבטיחות של אנשי המעבדה, וכל צריך להיות חוסנו וזיהה HBsAb חיובי לפני ביצוע ניסויים HBV. התבונן במצב התאים בכל שלב לפני שתמשיך לשלב הבא. דגימות הנסיוב האנושי שימשו בהתאם לאישור שהושג על ידי מועצת הסקירה המוסדית של המכללה הרפואית של אוניברסיטת Shantou.

1. תרבות התאים ה2.2.15 של HepG

הערה: HepG 2.2.15 cell סופרנטאנט, העמוד השני מתרכז על כל הטיפים, הצלוחיות, הצלחות והצינורות שבאו במגע עם ה2.2.15 של HepG לאחר שהוא ספוג ב -2% ולבן לילה.

1. הסר את המבחנה המכילה תאים HepG 2.2.15 מחנקן נוזלי והפשרה על ידי מתערבל בעדינות את הבקבוקון באמבט מים ב37 ° c.
   הערה: כדי להפחית את האפשרות של זיהום, לשמור את הכובע מחוץ למים. הפשרה צריכה להיות מהירה (כ 2 דקות).
2. להסיר את המבחנה מאמבט מים ברגע התאים הם המופשלים ולחטא אותו עם 70% אתנול.
   הערה: מנקודה זו בצע את כל השלבים תחת תנאים אספטי קפדנית.
3. להעביר את התאים לתוך 25 ס מ² תרבית רקמה בקבוקון ולהוסיף 4 מ ל של בינונית תרבות שלמה (dmem המכיל 10% fbs, פניצילין 100 U/ml, סטרפטומיצין 0.1 Mg/ml). דגירה את התאים ב 37 ° c בתוך מחולל לחות עם 5% CO₂.

2. אוסף של תרבות התאים ה2.2.15.

1. 2.2.15 התרבות HepG התאים ב T25 מבחנות ב 37 ° c, 5% CO₂ בתוך החממה מחולל לחות_. . להחליף את המדיום כל 3 ימים
2. לאסוף את התאים הסופר בשפופרת צנטריפוגה 50 mL. סגרו את המכסה בחוזקה ועטפו אותו בסרט פרפין.
3. אחסן את HepG 2.2.15 supernatant ב-20 ° צ' כדי לשמור על וירוס HBV פעיל.

3. ריכוז HepG 2.2.15 סופרנט

1. הסירו את HepG 2.2.15 על-ידי-20 ° c והפשרת ב -4 ° c.
2. כדי להסיר את שברי התא, לסנן את hepg 2.2.15 supernatant עם קרום מ0.45 יקרומטר לשפופרת צנטריפוגה חדשה 50 mL. תחילה, חסום את המסנן על-ידי סינון 10 מ ל של DMEM עם 10% FBS לפני סינון הווירוס, לאחר מכן לסנן את התרבות התא supernatant.
3. הוסף 14 מ ל של סופרנטאנט מסונן לעמודת מרכז וירוס וסגור את המכסה. צנטריפוגה את העמודה ב 3,200 x g עבור 35 דקות בצנטריפוגה מסתובב אופקי. אסוף את הריכוז HepG 2.2.15 סופר (כ 200 μL) לתוך צינור 1.5 mL.
4. שטוף את העמודה עם DMEM פעם אחת על-ידי הוספת 200 μL של DMEM ולאסוף אותו לתוך שפופרת 1.5 mL.

4. זיהוי של ה-DNA HBV בתרכיז הסופרנטאנט

1. הפעל את מחמם הבלוק היבש והגדר את הטמפרטורה עד 100 ° c.
2. כדי להבטיח את הריכוז של ה-DNA HBV בריכוז HepG 2.2.15 supernatant הוא בתוך טווח עקום סטנדרטי, לדלל את הריכוז 20-קיפול על-ידי הוספת 10 μL של HepG 2.2.15 supernatant להתרכז 190 μL של DMEM בתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. הוסף 200 μL של HepG 2.2.15 סופרנט, שליטה שלילית (סרום HBV-שלילי מתורם בריא), HBV בקרה חיובית (סרום HBV-חיובית מחולה HBV) וארבע מדלל ההפניות הכמותיות המסופקות בערכה (2.0 x 10⁶, 2.0 x 10⁵, 2.0 x 10⁴, 2.0 x 10³ geq/ml), בהתאמה כדי להפריד בין הצינורות 1.5
3. הוסף 450 μL של מאגר חילוץ ה-DNA HBV מתוך הקיט אל כל שמונה 1.5 מ"ל צינורות, מערבולת עבור 15 s ו ספין למטה עבור 10 ס מ. מארג ב 100 ° c עבור 10 דקות בתנור בלוק יבש. צנטריפוגה על 12, 000 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
4. הוסף 27 μL של מיקס מאסטר של PCR ו 3 μL של האנזים של Taq פולימראז לצינורות ה-PCR הממוקמים על הקרח.
   הערה: המיקס הראשי של ה-PCR המסופק בערכה כולל את התחל נגד האזור הניתן לשילוב של DNA HBV.
5. הוסף 20 μL של נוזל centrifuged סופראנט לצינורות ה-PCR הממוקמים על הקרח. מכסים היטב ומסתובבים. במשך 10 ס מ
6. השתמש בתנאים הבאים על מכונת PCR בזמן אמת: 93 ° צ' עבור 2 דקות, 10 מחזורים של 93 ° צ' עבור 45 s ואחריו 55 ° צ' עבור 60 s; אז 30 מחזורים של 93 ° c עבור 30 s ואחריו 55 ° צ' עבור 45 s לבצע PCR בזמן אמת.
   הערה: התמהיל הראשי המסופק בערכה המסחרית כולל התחל נגד האזור הכולל של ה-DNA HBV.
7. יצא את ערכי ה-Ct שהתקבלו וצור עקומה סטנדרטית כפי שמוצג בטבלה 1 ובאיור 2.
8. בהתבסס על עקומת סטנדרטי, לחשב את הריכוז ה-DNA HBV של HepG 2.2.15 supernatant להתרכז מדולל 20x כפי שמוצג בטבלה 2. לחשב את הריכוז ה-DNA HBV של ה2.2.15.Table 2
9. מחלקים את מרכז HepG 2.2.15-סופרנט באליבטים ולאחסן ב-80 ° c עד השימוש.

5. בזיהום חוץ גופית של HepG2-NE ו 293T-NE-3NRs תאים

1. הכן את אמצעי ההדבקה הבאים ב-DMEM/F-12:10% FBS, 4 מילימטר גלוטמין תוסף, 0.1 mM NEAA, 1 מ"מ נתרן פירובט, 100 U/mL פניצילין, 100 μg/mL סטרפטומיצין, 1 μg/ml puromycin, 40 ng/mL דקאמת1, 20 μg/mL הידרוקורטיזון ו 5 μg/ml אינסולין. חנות ב -4 ° c.
   הערה: תאים חיוביים אלה של NTCP הם puromycin עמידים⁹.
2. הוסף 0.1% ג'לטין ל 5 בארות של 48 היטב הצלחת, 200 μL לכל טוב. מודלת את הצלחת ב 37 ° c עבור 2 h, למחוק את הסופרנטאנט. מודקת את הצלחת ב 37 ° c עבור עוד 2 h.
3. Seed HepG2-NE בצפיפות של 1 x 10⁴ תאים ב 2 בארות כל אחד. הזרע 293T-NE-3NRs תאים בצפיפות של 1 x 10⁴ תאים ב 2 בארות כל (חומצה retinoic כל טרנס ב 1 μml/ליטר חומצה בתוך 1 ממול/l ריכוזי הסופי נוספו בינונית כדי להפעיל את rxrmpα וקולטנים גרעיניים הורמון גרעיני, בהתאמה). 293T זרע t-NE ב 1 גם בצפיפות של 1 x 10⁴ תאים.
   הערה: מעבר התאים במפגש המשנה באמצעות 0.25% טריפסין. ספור את מספר התאים ולאחר מכן הזרע את התאים לצפיפות מתאימה.
4. ממשיך את התא ב 37 ° c, 5% CO₂ בתוך מחולל לחות עבור 24 שעות. שימו לב לתאים לאחר 24 שעות ולהמשיך עם זיהום אם התאים הם בריאים.
5. הכינו את מתחם הזיהום כפי שהוזכר בטבלה 3, להוסיף Hbv (hepg 2.2.15 סופר להתרכז), DMSO, PEG8000 וזיהום בינונית כדי 1.5 mL שפופרת מיקרוצנטריפוגה. הכינו מלאי CsA על ידי המסת אותו ב DMSO לריכוז של 5 מ"מ ולשמור את המניה ב-20 º C. פתרון העבודה של CsA הוא 5 μM. זרעים 1 × 10⁴ תאים לכל טוב של 48-ובכן צלחת. הוסף 100 μL של התמקד HepG 2.2.15 סופר (המכיל HBV 1.5063 × 10⁷ Geq/mL) כדי להדביק תאים ב 150 geq/cell.
6. הוסף 500 μL של מורכבות הזיהום לכל טוב ומארג את התאים ב 37 ° c, 5% CO₂ בחממה לחות עבור 24 h.
7. שטוף את התאים פעמיים עם 500 μL של PBS לפני שינוי המדיום. הוסף 1 מ ל של המדיום בכל באר. אם מצב התא עני ותאים מסוימים צפים, שנה את המדיום ישירות. . זה היום הראשון של זיהום לשנות את המדיום בעדינות כל יומיים.
8. ביום 11, לשטוף את התאים פעמיים עם 500 μL של PBS ולתקן את התאים עם קרח קר מתנול עבור immunofluorescence.

6. HepG 2.2.15 שיתוף תרבות עם HepG2-NE/293T-NE-3NRs/293T-NE

1. הוסף 1 מ ל/טוב של 0.1% ג'לטין ל 5 בארות של 6 היטב צלחת. מודלת את הצלחת ב 37 ° c עבור 2 h ולמחוק את הסופרנטאנט. מודקת את הצלחת שוב 2 h ב 37 ° צ' כדי לייבש לחלוטין את הבאר.
2. זרע 1 x 10⁵ תאים/טוב של HEPG-ne לתוך 2 בארות, 293T-Ne-3NRs לתוך 2 בארות, ו 293t-ne לתוך 1 טוב של צלחת. זרע 1 x 10⁵ תאים/גם של hepg 2.2.15 על חמש מוסיף ממברנה (24 מ"מ, 0.4 יקרומטר בקוטר הנקבוביות, uncoated צופה) בצלחת נפרדת 6 היטב. מודטה את התאים ב 37 ° c, 5% CO₂ בחממה לחות לאחר 24 שעות.
3. לאחר 24 שעות, אם התאים הם חסיד ובמצב טוב, להתכונן לשיתוף התרבות. להיפטר המדיום בתוך 6-היטב-צלחת ומוסיף קרום התא. מניחים את הקרום מוסיף עם HepG 2.2.15 לתוך 6 צלחת היטב הנזרע עם HepG-NE, 293T-NE-3NRs ו 293T-NE על ידי מלקחיים. מודטה את התא ב 37 ° צ', 5% CO₂ בתוך החממה לחות, לשנות את המדיום כל 3-4 ימים.
   הערה: הגדר קבוצות כדלקמן: ובכן 1:293T-NE שיתוף תרבות עם HepG 2.2.15; ובכן 2: HepG2-NE שיתוף תרבות עם HepG 2.2.15; טוב 3:293T-NE-3NRs שיתוף תרבות עם HepG 2.2.15; ובכן 4: HepG2-NE שיתוף תרבות עם HepG 2.2.15 (להוסיף CsA); טוב 5:293T-NE-3NRs שיתוף תרבות עם HepG 2.2.15 (להוסיף CsA); להוסיף את המדיום השלם למספר טוב מספר 1, 2 ו-3, להוסיף את המדיום עם 5 μM CsA גם מספר 4 ו 5 טוב, על 9 מ ל עבור כל טוב, לוודא את התקשורת הם בקשר כדי חלקיקי וירוס להגר מ transwells להדביק תאים.
4. לאחר 10 ימים, להסיר את מוסיף קרום, להוסיף PBS ל 6-היטב-צלחת ולשטוף בעדינות פעמיים, לתקן את התאים עם קרח קר מתנול עבור immunofluorescence.

7. לבצע מאימונולואוורבורנציה עבור HBcAg קאג

1. תקן את התאים עם קרח קר מתנול ב-20 ° c עבור יותר מ 3 h. למחוק את המתנול. לשטוף את התאים עם PBS עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר, חוזר על 3 פעמים.
2. להוסיף 5% BSA (100 μL/48-טוב-צלחת, 500 μL/6-היטב-צלחת), ללחוץ על שייקר אופקי עבור 1 h ב 40 rpm וטמפרטורת החדר.
3. להוסיף את הפתרון העיקרי של הנוגדן HBcAg קאג (נוגדן ראשוני: 5% BSA פתרון = 1:200, 100 μL/48-ובכן-צלחת, 500 μL/6-היטב-צלחת), לנער לילה ב 4 ° c.
4. לשטוף את הבארות עם PBST (PBS עם 0.1% רצף 20), עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר, חוזר על 3 פעמים.
5. להוסיף את פתרון הנוגדן השני (594 התווית נוגדן מוגבה עז נגד הארנב IgG: PBS = 1:1000, 100 μL/48-טוב-צלחת, 500 μL/6-היטב-צלחת), לכסות את הצלחת עם רדיד כסף ולנער עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
6. לשטוף שוב עם PBST עבור שלוש פעמים, לנער עבור 10 דקות כל אחד.
7. הוסף 1 μg/mL DAPI, לנער עבור 2 דקות. לשטוף פעמיים עם PBST על שייקר עבור 5 דקות כל אחד. התעלם מPBST. הוסף את הערוץ הPBS והתבונן. תחת מיקרוסקופ אימונולוורנציה

תוצאות

בנינו pSIN-NTCP-EGFP ביטוי במבטא NTCP ו EGFP היתוך עם puromycin התנגדות. הפלבאמצע היה מנוכר לתוך HepG2 ו 293T תאים לבניית קווי תאים יציבים HepG2-NE 293T-NE ביטוי NTCP ו EGFP. פלמידים (pSIN-HNF4α, pSIN-Rxra, pLV-PPARα-puro-דגל) עם puromycin התנגדות וביטוי היו מזוהמים לתוך 293T-NE תאים לבניית קו תא יציב המבטא 4 גנים מארחים⁹. הביטוי של NTCP...

Discussion

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים עבור זיהום HBV בתוך 293T-NE-3NRs-מבוססי hepatoma תאים HepG2-NE. 293T-NE-3NRs היו מתאימים לזיהום HBV בשני גבוה ונמוך GEq. יש לקחת בחשבון את הצעדים הקריטיים הבאים תוך שימוש בפרוטוקול שלנו. מצב התא הוא גורם חשוב להידבקות מוצלחת. בינוני זיהום חייב להשתנות בזמן לאחר התקופה הראשונית של זיהום HB...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45μm membrane filter	Millex-HV	SLHU033RB	Filter for HepG 2.2.15 supernatant
293T-NE	Laboratory construction	——	Cell model for HBV infection
293T-NE-3NRs	Laboratory construction	——	Cell model for HBV infection
594 labeled goat against rabbit IgG	ZSGB-BIO	ZF-0516	For immunofluorescence assay,second antibody
6-well plate	BIOFIL	TCP010006	For co-culture
Amicon Ultra 15 ml	Millipore	UFC910008	For concentration of HepG 2.2.15 supernatant
BSA	Beyotime	ST023	For immunofluorescence assay
Cyclosporin A	Sangon biotech	59865-13-3	inhibitor of HBV infection
DAPI	Beyotime	C1006	For nuclear staining
Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing)	DAAN GENE	7265-2013	For HBV DNA detection
DMEM	HyClong	SH30243.01	For culture medium
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879	For improvement of infection efficiency
Fetal bovine serum (FBS)	CLARK Bioscience	FB25015	For culture medium
Fluorescence microscope	ZEISS	Axio observer Z1	For immunofluorescence assay
HepG2-NE	Laboratory construction	——	Cell model for HBV infection
HBcAg antibody	ZSGB-BIO	ZA-0121	For immunofluorescence assay, primary antibody
PBS	ZSGB-BIO	ZLI-9062	For cell wash
PEG8000	Merck	P8260	For infection medium
Penicillin-Streptomycin-Glutamine	Thermo Fisher	10378016	For culture medium
Transwell	CORNING	3412	For co-culture
Tween 20	sigma-Aldrich	WXBB7485V	For PBST
Virkon	Douban	6971728840012	Viruside