Method Article
כאן אנו מתארים חילופי אניון חזקים כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים של [3H]-מיו-אינוזיטול תווית שתילים אשר היא שיטה רגישה מאוד כדי לזהות ולכומת פוליפוספטים אינוזיטול בצמחים.
אסטרים פוספט של מיו-אינוזיטול, גם כנף פוספטים אינוזיטול (InsPs), הם סוג של רגולטורים סלולריים לשחק תפקידים חשובים בפיזיולוגיה של הצמח. בשל החיוב השלילי שלהם, שפע נמוך ורגישות לפעילות הידרולית, הגילוי והכימות של מולקולות אלה הוא מאתגר. זה במיוחד המקרה עבור צורות זרחן מאוד המכיל 'אנרגיה גבוהה' אג"ח diphospho, גם גם כנוזיטול pyrophosphates (PP-InsPs). בשל הרגישות הגבוהה שלה, חילופי אניון חזקים כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (SAX-HPLC) של צמחיםהמסוממיםעם [ 3 H]-מיו-אינוזיטול היא כיום השיטה של בחירה לנתח מולקולות אלה. באמצעות [ 3 H]-מיו-אינוזיטול שתילי צמח radiolabel, מיניםשוניםInsP כולל מספר isomers שאינם enantiomeric ניתן לזהות ומופלה ברגישות גבוהה. כאן מתוארת ההתקנה של מערכת SAX-HPLC מתאימה, כמו גם זרימת עבודה מלאה מטיפוח צמחים, תייול רדיו וחילוץ InsP ועד להפעלה של SAX-HPLC וניתוח נתונים עוקב. הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר אפליה וכמות של מינים שונים של InsP, כולל מספר isomers שאינם enantiomeric של PP-InsPs, InsP7 ו InsP 8 ,ולהיותמותאם בקלות מינים אחרים של צמחים. כדוגמאות, SAX-HPLC מנתח של Arabidopsis thaliana ו לוטוס ג'פניקו שתילים מבוצעים ופרופילי InsP מלאים מוצגים ונדונים. השיטה המתוארת כאן מייצגת כלי מבטיח כדי להבין טוב יותר את התפקידים הביולוגיים של InsPs בצמחים.
לפני כמעט ארבעה עשורים, פוספטים אינוזיטול (InsPs) הגיח כמו מולקולות איתות, לאחר Ins(1,4,5)P3 (InsP3) זוההכשליח שני המפעיל את שחרור מתווכי הקולטן של Ca2+ בתאים בעליחיים 1,,2. עד כה, אין קולטן InsP3 (IP3-R) זוהה בצמחים, אשר מטיל ספק תפקיד איתות ישיר עבור InsP3 בתאי צמח3. ללא קשר, InsP3 משמש כסימן מקדים עבור InsPs אחרים המעורבים במספר תהליכים התפתחותיים של הצמח, כולל רגולציה של מסלולי איתותספציפיים 3,4,,5,,6,7,,8. לדוגמה, InsP3 יכול להיות זרחן נוסף InsP 6 ,המכונהגם "חומצה פיטית", אשר מייצג מקור מרכזי של פוספט, מיו-אינוזיטול ו cations, והוצג לשחק תפקידי מפתח בהגנה על הצמח מפני פתוגנים, MRNA ייצוא פוספט הומסטאזיס 5 ,9,,10,11,12.9
אינוזיטול pyrophosphates (PP-InsPs) הם מחלקה של InsPs המכילים לפחות אחד אנרגיה גבוהה די-פוספו בונד, מזוהה בתחילה בתאים בעלי חיים, אמבה ושמרים, שם הם משחקים תפקידיםקריטיים בתהליכים תאיים שונים 13,14,15. למרות עבודה על PP-InsPsבצמחים 16,17,18,19,1720,,21,22,23,24,25,26, הפונקציות הביולוגיות וזהות isomer של מולקולות אלה עדיין להישאר אניגמטי במידה רבה., במפעל מודל Arabidopsis thaliana, תאי InsP8 הוצע לווסת את ההגנות נגד אוכלי עשב חרקים ופטריות necrotrophic באמצעות גילויצירוף מקרים של InsP 8 ו jasmonate פעיל על ידי קומפלקס קולטן ASK1-COI1-JAZ17. יתר על כן, תפקידים של InsP8 ו- PP-InsPs אחרים בהונואוסטזיס אנרגיה חישה תזונתית, כמו גם הומוסטאזיס פוספטהוצעו 17,23,24,25,26.
ללא קשר למערכת הביולוגית המועסקת, אחד האתגרים המתודולוגיים העיקריים בעת לימוד InsPs היה זיהוי אמין וכמת מדויק של מולקולות אלה. שיטות מבוססות ספקטרומטריה מסה שימשו לזיהוי InsPs, כולל PP-InsPs, מתמציות תאים. עם זאת, מחקרים אלה לא הצליחו להבדיל בין26 ל-26,27. גישה נוספת לניתוח InsPs משתמשת במשיכה כלפי מטה של InsPs מתאי ליסטים באמצעות TiO2 חרוזים, ואחריו אלקטרופורזה ג'ל polyacrylamide (PAGE) של InsPs האלגנטיות. לאחר מכן ניתן להכתים את ה- InsPs על-ידי טולואידין כחול או DAPI24,28,29. עם זאת, עד כה לא ניתן לזהות InsPs באופן מהימנות נמוך יותר InsP5 מתמציות צמחים באמצעות שיטה זו. לאחרונה, שיטה באמצעות [13C]-מיו-inositol עבור תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ניתוח של InsPs פורסם כחלופה חילופי אניון חזק כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (SAX-HPLC)30. טכניקה זו דווחה כדי להשיג רגישות דומה בהשוואה SAX-HPLC ולאפשר זיהוי של 5-InsP7, כמו גםאת האפליה של InsP 5 אינונטיומריםשונים מתמציות תאים. עם זאת, יישום השיטה מבוססת NMR דורש מסונתז כימית ולאזמין מבחינהמסחרית [ 13 C]-מיו-אינוזיטול. לכן, השיטה המועסקת ברוב המקרים היא תייול רדיו דגימות עם [3H]-מיו-אינוזיטול, ואחריו SAX-HPLC31,32,33. טכניקה זו מבוססת על ספיגה של מיו -אינוזיטולרדיואקטיבי לתוך הצמח והמרה שלה InsPs שונים על ידי הפעילות המשולבת של קינאזים ופוספטים תאיים ייעודיים.
ה- InsPs המסויגים בתווית[3H]מופקים בחומצה ומחולצים באמצעות SAX-HPLC. בשל החיוב השלילי שלהם, InsPs לקיים אינטראקציה חזקה עם השלב הנייח טעון חיובית של העמודה SAX-HPLC וניתן לפתוח עם מעבר צבע מאגר המכיל הגדלת ריכוזי פוספט כדי לתוחב InsPs מהעמודה. זמני ההתמהמה תלויים אפוא בהסתערות ובגיאומטריה של מיני ה-InsP שיש להפרידם. בהיעדר עמודות כיראליות, רק אנשים לא אננטיומרים יכולים לפי הם מופרדים על ידי פרוטוקול זה. עם זאת, ניתן להשתמש בתקני תיומת רדיו כדי להקצות את האופי האיתורי של פסגת InsP ספציפית. מאמצים מרובים בעבר על ידי מעבדות שונות כדי ליצור סטנדרטים מתויגים ללא תווית עם (ביו)שיטות כימיות או לטהר אותם מתאים שונים אורגניזמים עזרו הקצאת פסגות מינים מסוימים InsP, וגם לצמצם את הזהות האיתונטרית שלמינים בודדים שלInsP 5,7,21,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. כמו כן, ההברה האחרונה של מסלולים אנזימטיים המובילים להיווצרות PP-InsPs בצמחים, כמו גם הגילוי של אפקט חיידקי סוג III עם פעילות ספציפית 1-phytase, לספק מידע על איך ליצור סטנדרטיםשימושיים עבור ניתוחים אלה 10,17,18,22,23.
ניתן למדוד את השברים המתקבלים במונה מבריק נוזלי בשל β של tritium (3H). עם הגדלת זמן תיוג, שיווי משקל איזוטופי מצב יציב הוא הגיע, לאחר מכן פרופילי InsP שהושגו צריך לייצג את מצב InsP של הצמח31. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה בהשוואה לטכניקות זמינות אחרות הוא הרגישות הגבוהה שהושגה על ידי השימוש בסימן המוקדם הישיר עבור InsPs ומדידה של אות רדיואקטיבי.
SAX-HPLC שלדגימות שחולצומ [ 3 H]-מיו-אינוזיטול-תווית צמחים או אורגניזמים אחרים משמש בדרך כלל לזיהוי וכימות של InsPs החל מינים InsP נמוך כדי PP-InsPs, המייצג כלי בעל ערך כדי להבין טוב יותר את חילוף החומרים, פונקציה ו מצבי פעולה של InsPs. עד כה, שיטה זו היא גם הבחירה המתאימה ביותר עבור חוקרים עם עניין מיוחד מינים InsP נמוך יותר. בעוד היסודות של הליך זה, שבו הפרוטוקול המתואר כאן בונה על, תוארובעבר 7,21,31,,34, פרוטוקול מפורט המותאם לניתוח של InsPs נגזר צמח ובמיוחד של PP-InsPs עדיין חסר. פרסומים קודמים דיווחו על קשיים לזהות באופן אמין את PP-InsPs בשפע נמוך,במיוחדInsP 8 , בשל אחד או יותר מהגורמים הבאים: כמויות נמוכות יחסית של חומר צמחי, [3H]-מיו-אינוזיטול עם פעילות ספציפית נמוכה (> 20 Ci/mmol), שימוש במאגרי חילוץ שלא מבוססים על חומצה perchloric או מרוכזים פחות מ 1 M, מאגרים נטרול שונים, כמו גם מעברי צבע תת אופטימליים או זיהוי של [3H] עם גלאי על הקו. בהשוואה ללימודים אלה, הפרוטוקול המוצג כאן מיועד לזיהוי אמין של PP-InsPs7,21,34.
כאן אנו מציגים זרימת עבודה מפורטת, החל מהגדרת הציוד לטיפוח ותיוג צמחים, חילוץ InsP וה-SAX-HPLC מפעילים את עצמם. למרות השיטה היה אופטימיזציה צמח מודל A. thaliana, זה יכול להיות שונה בקלות כדי ללמוד מינים אחרים של צמחים, כפי שהראה כאן עם פרופיל InsP הדיווח הראשון של המודל קטנית לוטוס japonicus. למרות שהשימוש במין צמחי אחר עשוי לדרוש אופטימיזציה מסוימת, אנו מבינים כי אלה יהיו מינוריים, מה שהופך את הפרוטוקול הזה לנקודת התחלה טובה למחקר נוסף ב-InsPs של הצמח. על מנת להקל על מיטוב אפשרי, אנו מציינים כל שלב בפרוטוקול שבו ניתן לבצע שינויים, כמו גם את כל הצעדים הקריטיים שעשויים להיות מאתגרים בעת ביסוס השיטה בפעם הראשונה. בנוסף, אנו מדווחים כיצד ניתן להשתמש בנתונים שהושגו על-ידי שיטה זו לכמת של InsPs ספציפיים וכיצד ניתן לנתח ולהשוות דגימות שונות.
1. הגדרת מערכת HPLC
2. הכנת מאגרים, עמודות ומערכת HPLC
3. טיפוח צמחים ותיוג עם[3H]-מיו-inositol
הערה: יש לבצע את השלבים הבאים עם רכיבים סטריליים ובתנאים סטריליים, תוך לבישת כפפות להגנה על הידיים מפני זיהום באמצעות התבלין הרדיואקטיבי. אמצעי התקשורת של הצמח, במיוחד כאשר מכילים סוכרוז, נוטים לזיהום מיקרוביאלי.
4. חילוץ של InsPs מסיס
הערה: שמור דגימות ריגנטים על קרח במהלך כל תהליך החילוץ. תמיד ללבוש כפפות ומשקפיים מגן בשל הסיכון הגבוה של מגע עם חומר רדיואקטיבי, במיוחד במהלך שחיקה. כל מה שמיצור קשר עם דגימות נחשב לפסולת רדיואקטיבית ויש להיפטר ממנו בהתאם לכללים המקומיים לסילוק בטוח של חומר רדיואקטיבי.
5. ביצוע הריצה של HPLC
6. מדידת השברים
7. ניתוח נתונים
התוצאות המוצגות כאן שואפות להמחיש תוצאות אפשריות שהושגו על פי וריאציות ברמות טכניות וביולוגיות. הראשון מובחן על ידי ניתוחים באמצעות עמודות חדשות לעומת גיל ( איור 1 )ודוגמאות טריותלעומתמאוחסנות (איור 3), והשנייה עלידי הערכת תמציות משתי מערכות צמחיםשונות, א. תליאנה (איור 1, איור 3) ול.
הפעלת SAX-HPLC אופטימלית מתוארת על איור 1A\u2012C, אשר מראה ספקטרום פוליפוספט אינוזיטול מלא שהושג מתמציות A. thaliana לאחר ספירת מבריק. שימו לב כי הפסגות מופרדות יפה ותו לא ניתן להקצותן ל-isomers שונים (או לזוגות enantiomer) המבוססים על ניידות כרומטוגרפית המתוארתקודם לכן 5,7.
איור 2 מציג את התוצאה המייצגת של ניתוח SAX-HPLC של שתילי L. japonicus שגדלו וסויגו באותם תנאים כמו שתילי Arabidopsis. בעוד ככל הנראה כל מיני InsP ופסגות הידועים Arabidopsis ניתן לראות, ישנם הבדלים משמעותיים לגבי יחסית (למשל, יחסים בין isomers) של isomers InsP ספציפי, בעת השוואת הפרופילים של שני המינים. לדוגמה, תמציות לוטוס הראו InsPמוגברת 3c, InsP4b, InsP5b ו מופחת InsP3a, InsP4a, InsP5a ו InsP5c לעומת Arabidopsis אשר משאיר מקום לחקירות נוספות. איור 2D ממחיש את היחסים השונים בין Isomers InsP בין Arabidopsis לבין לוטוס.
איור 3 מציג שני פרופילי InsP של מדגם שפוצלו לאחר החילוץ. המחצית הראשונה נותחה מיד והמחצית השנייה יום לאחר מכן, לאחר אחסון ב-80 מעלות צלזיוס. שים לב כי רק הבדלים קלים נצפו בין הדגימות השונות (כלומר, קווים שחורים ואדומים באיור 3A\u2012C, ואיור תלת-מידי). הדבר ממחיש שמחזור הקפאה אחד אינו פוגע בדגימה וששיטה עצמה מייצרת תוצאות לשחזור.
איור 1: פרופיל InsP טיפוסי של ניתוח SAX-HPLC מוצלח שבוצע באמצעות פרוטוקול זה. (a\u2012C) פרופיל SAX-HPLC של בני 17 יום מסוג פראי (קול-0) שתילי Arabidopsis radiolalabeled עם [3H]-מיו-אינוזיטול. חילוץ InsP כללי והפעלה SAX-HPLC בוצעו באותו יום. (א)ספקטרום מלא; (B, C) מה אתה עושהכאן? הגדלת התצוגה של הפרופיל המוצג ב- A. כל הפסגות הגלויות מסומנות ומוקצות למין InsP המתאים. בהתבסס על ניידות כרומטוגרפיתשפורסמה 5,7, InsP4a מייצג ככל הנראה Ins(1,4,5,6)P4 או Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a מייצג InsP5 [2-OH], InsP5b מייצג את InsP5 [4-OH] או את צורתו האנונטיומרית InsP5 [6-OH], ו- InsP5c מייצג את InsP5 [1-OH] או את צורתו האנונטיומרית InsP5 [3-OH]. האופי האיתורי של InsP3a-c, InsP4b, InsP7ו- InsP8 עדיין אינם ידועים. לוח (D) מציג פרופיל SAX-HPLC של צמחים שגודלו באופן זהה אך באמצעות עמודה מזדקנת (>40 פועל). הפחתה ברורה של InsP6 בהשוואה למינים אחרים InsP והיעדר PP-InsPs גלוי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: פרופיל InsP מייצג של צמחים ל. יפניקוס. פרופיל SAX-HPLC (A\u2012C) של 17 יום בן בר מסוג (גיפו) L. שתילי יפניקוס radiolabeled עם [3H]-מיו-אינוזיטול. (א)ספקטרום מלא; (B, C) מה אתה עושהכאן? הגדלת התצוגה של הפרופיל המוצג ב- A. כל הפסגות הגלויות מסומנות ומוקצות למין InsP המתאים. בהתבסס על ניידות כרומטוגרפיתשפורסמה 5,7, InsP4a מייצג ככל הנראה InsP (1,4,5,6)P4 או Ins(3,4,5,6)P4, InsP5b מייצג ככל הנראה InsP5 [4-OH] או את צורתו אננטיומרית InsP5 [6-OH], ו- InsP5c מייצג ככל הנראה את InsP5 [1-OH] או את צורתו האנונטיומרית InsP5 [3-OH]. האופי האיתורי של InsP3a-c, InsP4b, InsP7ו- InsP8 אינם ידועים. (ד)השוואה בין מיני InsP בודדים (ב% מכלל הפעילות מ- elution 25\u201296) של A. thaliana (נתונים מאיור 1A\u2012C) ו- L. japonicus (נתונים מאיור 2A-C). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: פרופילי InsP של מדגם מפוצל הממחישים את האפשרות לשחזור של ניתוחי SAX-HPLC. (a\u2012C) פרופילי SAX-HPLC של בני 17 יום (קול-0) שתילי ערבידופסיס עם[3H]-מיו-אינוזיטול. לפני הריצה, הדגימה פוצלה וחצי לרוץ מיד והשני חצי יום לאחר מכן לאחר אחסון ב -80 ° C. (A)ספקטרום מלא; (B, C) מה אתה עושהכאן? הגדלת התצוגה של הפרופיל המוצג ב- A. כל הפסגות הגלויות מסומנות ומוקצות למין InsP המתאים. בהתבסס על ניידות כרומטוגרפיתשפורסמה 5,7, InsP4a מייצג ככל הנראה Ins(1,4,5,6)P4 או Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a מייצג InsP5 [2-OH], InsP5a מייצג את InsP5 [2-OH], InsP5b מייצג את InsP5 [4-OH] או את הטופס האנטנטיומרי שלו InsP5 [6-OH], ו- InsP5c מייצג את InsP5 [1-OH] או את צורתו האנזנטיומרית InsP5 [3-OH]. האופי האיתורי של InsP3a-c, InsP4b, InsP7ו- InsP8 עדיין אינם ידועים. לוח ד' מציג את הכימות של InsP6 ו- PP-InsPs InsP7 ו- InsP8 של שתי הריצות. הערכים מייצגים את הסכום (ב- %) של מיני InsP בהתאמה ביחס לכל InsP (פעילות כוללת מ-25-96). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור משלים 1: הגדרות תוכנה לספירת נוזלים באמצעות מונה מבריק קל. צילומי מסך המציגים את גירסת התוכנה, כמו גם הגדרות המשמשות לספירת דוגמאות של [3H] המבוצעות עם פרוטוקול זה מתוארות. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.
איור משלים 2: דוגמה מייצגת לנורמליזציה של נתונים. צילום מסך של גליון עבודה מציג את כל השלבים והנוסחאות המשמשים לנרמל את ריצות SAX-HPLC זו לזו. לצורך פישוט, מוצגים רק שברים 25-35 של דגימות. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.
איור משלים 3: קביעת שיא, חיסור רקע ואינטגרציה באמצעות תוכנת ניתוח. (א)נתונים מניתוח SAX-HPLC נטענים לתוך התוכנה (דקות 28-96) וכלי מנתח השיא נבחר. (B\u2012E) התוכנית הבסיסית מוגדרת באופן ידני על-ידי הגדרת נקודות בין שיאים בודדים והרקע חסר. (F)פסגות נקבעות באופן ידני על בסיס מראה ופורסם ניידות כרומטוגרפית5,,7. (G) טווחי שיא מוגדרים באופן ידני על-ידי ערכי cpm. (H)פסגות משולבות ומחושבות כ% מכל הפסגות. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.
כאן אנו מציגים שיטה רב-תכליתית ורגישה לכמת InsPs כולל PP-InsPs בתמציות צמח ולספק עצות מעשיות על איך לקבל שיטה זו הוקמה. למרות שהפרוטוקול הוא בדרך כלל חזק, ריצות וניתוחים תת-אופטימליים יכולים להתרחש. ברוב המקרים, ריצות אלה ניתן לזהות על ידי הפחתה חזקה או אפילו אובדן מוחלט של InsPs זרחן מאוד, במיוחד המינים PP-InsP InsP7 ו InsP8. סיבות אפשריות יכולות להיות זיהום מיקרוביאלי של חומר הצמח ונעה לא מספיק של הידרולאזים PP-InsP צמח אנדוגני במהלך החילוץ בשל שחיקה מספיקה והפשרה של חומר הצמח שלא יהיה במגע מיידי עם מאגר החילוץ. סיבות נוספות כוללות התאמת pH לא מדויקת על-ידי תוספת לא מספקת או עודפת של מאגר נטרול, או פשוט חומר לדוגמה לא מספיק. האחרון יכול לעשות את זה קשה לזהות PP-InsPs, מאז אלה נמצאים לעתים קרובות בכמויות נמוכות מאוד בתאים. עודף של חומר מדגם או ייבוש לא יעיל במהלך שלב 3.5 עלול לגרום דילול של חומצה perchloric, ולכן גם מוביל השבתת אנזים מספיק ואובדן ספציפי של InsP6 ו PP-InsPs. כמות החומר הצמחי, כמו גם radiolabel בשימוש בפרוטוקול זה היו אופטימיזציה בהתבסס על עלויות וביצועים, ולכן הוא קרוב לכמות הנמוכה ביותר שעדיין מספיקה למתן תוצאות אופטימליות. בנוסף, שרפטור העמודה יאבד בהדרגה את קיבולת הרזולוציה שלו. הסימן הראשון של תהליך זה הוא (מסיבות לא לגמרי ברורות למחברים) אובדן ספציפי של מינים InsP זרחן גבוה יותר כמו PP-InsPs בספקטרום HPLC. עם הזדקנות נוספת, אפילו InsP6 לא ייפתר כראוי על ידי העמודה(איור 1D). לכן, השימוש בעמודה נאותה, כמו גם טיפול קפדני של המדגם ותחזוקה נכונה של רכיבי HPLC הוא חיוני להבטחת תוצאות מדויקות.
בעת השוואת דוגמאות וריצות, במיוחד כאשר נוצרים באמצעות ציוד שונה (לדוגמה, מערכות ועמודות של HPLC) או בימים שונים, חיוני לנרמל את הדגימות זו לזו (כמתואר בשלב 7.3) ולנתח אותן באותו אופן. רק באמצעות נורמליזציה ניתן ומדויק להציג דגימות מרובות באותו גרף (איור 3). לכמת InsPs בודדים ביחס לסך של InsPs, או למין InsP ספציפי אחר, אין צורך לנרמל, כל עוד מוצגים רק ערכים יחסיים ולא ערכים מוחלטים. באופן אידיאלי, הן פרופילי InsP והן הכימות מוצגים. עם זאת, במקרים מסוימים לא ניתן להציג כראוי שתי ריצות או יותר באותו גרף. זמני שמירה שונים או רמות שונות של פעילות רקע יכולים לקשה על השוואת פרופילי SAX-HPLC לא כירים בלבד. אותו הדבר נכון כאשר דגימות רבות צריך להיות מושווה. במקרים כאלה, יש צורך בהערכה נוספת באמצעות תוכנה נוספת (לדוגמה, Origin) לכמת שיא אישי.
המחברים מודעים לכך שניתן לייעל את הפרוטוקול המתואר כאן ויש להתאים אותו לכל שאלת מחקר פרטני. למרות להיות אופטימיזציה עבור תמציות Arabidopsis 7,17 בפרוטוקול זה, שיטה זו היא תכליתית והוא יכול לעזור בקביעת פרופילי InsP של מינים אחרים של צמחים גם כן. כאן אנו מדגים אפשרות זו על ידי הצגת בפעם הראשונה פרופיל InsP עבור L. japonicus, אשר לא דרש שינויים של תנאי התיוג, חילוץ InsP או SAX-HPLC לרוץ(איור 2). במיוחד, בעוד באופן כללי דומה, ההבדלים נצפו בין L. japonicus ו פרופילים InsP Arabidopsis. למשל, בל. japonicus InsP5 [4-OH] או הצורה enantiomeric שלה InsP5 [6-OH] הם בשפע יותר מאשר InsP5 [1-OH] או הצורה אננטיומרית שלה Insפ'-5 [3-OH] בהשוואה לערבידופסיס,שם InsP5 [1-OH] או צורתו enantiomeric InsP5 [3-OH] הם המינים הדומיננטיים InsP5. כמו כן, אנו צופים כי שינויים בהרכבהתקשורת, [3H]-מיו-ריכוז, גיל הצמח, תנאים סביבתיים (למשל, אור וטמפרטורה), תוספת של תרכובות כימיות או ניתוחים של אינטראקציות צמח מיקרוביאלי בין גורמים אחרים, ייתכן שיהיה צורך להיבדק ולהתאים.
אחד החסרונות החשובים של שיטה זו שיש לקחת בחשבון הוא כי התיוג נעשה בתרבות נוזלית (סטרילית), אשר אינה מייצגת סביבה פיזיולוגית עבור רוב צמחי הקרקע. בנוסף, בשל העלויות הגבוהות של [³H]-מיו-אינוזיטול, נפח פתרון התיוג וגודל כלי התרבות מוגבל בדרך כלל, מה שמגביל גם את גודל הצמחים שניתן להשתמש בהם. ניתן להימנע מטיפוח בתרבות הנוזלית על ידי הסתננות ישירה למשל של צמחים מגודלים בקרקע עם [³H]-מיו-אינוזיטול ולאחר מכן בעקבות הפרוטוקול המתואר כאן, כפישדווח קודם לכן 10.
ישנם מספר חסרונות של פרוטוקול זה בהשוואה לשיטות חלופיות, כגון TiO2 למשוך למטה ואחריו טכניקות מבוססות PAGE או ספקטרומטריה המונית. בשל[3H]-מיו-תיוג inositol, רק מינים InsP שמקורם ישירות מיו -inositol רדיויתגלה בסופו של דבר. השיטה המתוארת כאן היא עיוורת isomers Ins אחרים כגון scyllo-אינוזיטול ו isomers אחרים שחלקם זוהו בצמחים מסוימים44. יתר על כן, myo-InsPs נגזר ממסלולים אחרים לא ייכללו, כולל אלה מסונתז על ידי סינתזה דה נובו של מיו-אינוזיטול ומיו-אינוזיטול-3-פוספט באמצעות isomerization של גלוקוז-6-פוספט, קטאלי על ידי מיו-אינוזיטול-3-פוספט סינתאז (MIPS)חלבונים 45. למרות[32P] או [33P]- אורתופדיה -פוספט יכול לשמש תוויות חלופיות, השימוש בהם מהווה חיסרון גדול, שכן כל מולקולה המכילה פוספט, כולל נוקלאוטידים בשפע ונגזרותיה, יסויג.ortho מולקולות אלה ניתן גם לחלץ עם פרוטוקול זה ולאגד לעמודה SAX, אשר יגרום רמה גבוהה של פעילות רקע שתפריע לזיהוי של פסגות InsPבודדים 5. בנוסף, כימות של [32P]- או [33P] מתויג InsPs ו PP-InsPs יכול להיות מושפע מאוד על ידי מחזור פוספט ו pyrophosphate moiety ולא יכול לדווח על קריאה המונית עבור מינים אינוזיטול.
מצד שני,[3H]-מיו-אינוזיטול במיוחד תוויות מיו-אינוזיטול המכיל מולקולות. InsPs, שומנים המכילים אינוזיטול, כגון פוספינוסיטידים, ו galactinol הם במקרה זה מסומן. עם זאת, רק InsPs ינותחו עם פרוטוקול זה, מאז שומנים אינם מסיסים במאגר החילוץ galactinol אינו נקשר לעמודה SAX.
עד כה, ההבדלים מפרופיל InsP צמח שנוצר על ידי [3H]-מיו-אינוזיטול תיוג לעומת אחד שנקבע על ידי TiO2 נסיגה / PAGE נשאר לא ידוע, מאז השוואות כאלה לא בוצעו בצמחים. מחקר שנערך לאחרונה בתאי בעלי חיים התייחס לשאלה זו46. בעבודה זו, בריכה של InsP6 כי הוא בלתי נראה על ידי [3H]-מיו-אינוזיטול תיוג, אשר בכך צריך להיות נגזר ישירות גלוקוז-6-פוספט, זוהה על ידי השוואת פרופילי SAX-HPLC עם ג'לים דף של קווי תאים יונקים. 24 שעות של רעב פוספט הביא לעלייה של 150% של InsP6 בעת כימות ג'לים דף של InsPs מטוהרים באמצעות TiO2 נסיגה. SAX-HPLC ניתוחים של [3H]-מיו-אינוזיטול-תווית תאים שטופלו באופן זהה רק הראה עלייה של 15% של [3H]-InsP6. כפי שהוזכר קודם לכן, InsPs נמוך יותר מ- InsP5 אינם ניתנים לגילוי עם ניתוח PAGE ברוב המקרים. תייבל רדיו ואחריו SAX-HPLC נראה כשיטת הבחירה, כל עוד פרוטוקולים ספקטרומטריים מסה אינם ממוטבים כדי לזהות קבוצה זו של מולקולות טעונות שלילית מאוד.
אתגר נוסף שנותר הוא להבחין בין enantiomers בניתוחי SAX-HPLC (או בכל שיטה אחרת לניתוח InsP)10,17. אתגר זה ניתן להתמודד על ידי תוספת של בוררים כיראליים, כלומר, enantiopure תרכובות כמו L-ארגנין amide אינטראקציה עם מולקולות enantiomeric בהתאמה כדי ליצור תרכובות diastereomeric שניתןלהפריד 10. למיטב ידיעתנו, גישה זו יושמה רק כדי להפלות את Enantiomeric InsP5 isomers InsP5 [1-OH] ו- InsP5 [3-OH] על ידי NMRמנתח 10. אפליה של זוגות אננטיומריים אחרים או אפליה מוצלחת של enantiomers על ידי ניתוח SAX-HPLC כיראלי או שיטות מבוססות דף כיראלי עדיין לא דווחו ויש לפתח גם. בהתחשב בסינתזה המשומרת וברגולציה המשומרת של PP-InsPs על ידי זמינות זרחן, אנו מדמיינים כי שיטות לא רדיואקטיביות במיוחד כגון PAGE או שיטות מבוססות MS, יחד עם ניתוחים תזונתיים, יסייעו לקרקע את מאמצי האמת לכייל נתוני חישה מרחוק שנועדו לאבחן ליקויים תזונתיים בגידולים17,,18,,24,,25. עם זאת, השיטה המוצגת כאן עדיין יכול להיחשב תקן הזהב עבור ניתוחי InsP ויהיה אינסטרומנטלי לגלות פונקציות חדשות של שליחים מסקרנים אלה בצמחים.
לסופרים אין מה לחשוף.
עבודה זו מומנה על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית) תחת אסטרטגיית מצוינות של גרמניה - EXC-2070 – 390732324 (PhenoRob), קבוצת הכשרת מחקר GRK2064 ומעניקי מחקר בודדים SCHA1274/4-1 ו SCHA1274/5-1 כדי G.S. אנו מודים גם ללי שלוטר ובריג'יט אוברבאך על הסיוע הטכני.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Centrifuge | Eppendorf AG | model: 5430 R | |
Diammonium hydrogen phosphate, ≥97 % | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0268.1 | |
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, ≥99 %, p.a., ACS | Carl Roth GmbH + Co. KG | 8043.2 | |
Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile | Corning Inc. | 353043 | |
Fraction collector | LAMBDA Instruments GmbH | model: OMNICOLL single channel collector | |
Growth incubator | poly klima GmbH | model: PK 520-LED | |
HPLC pumps | Kontron Instruments | model: 420 | |
HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL | Hamilton Company | 81365 | |
Injector for HPLC | Supelco | model: Rheodyne 9725 | |
Inositol, myo-[1,2-3H(N)] | American Radiolabeled Chemicals Inc. | ART 0261 | |
Liquid nitrogen | University, Chemistry Department | ||
Liquid scintillation counter | PerkinElmer Inc | model: TRI-CARB 2900TR | |
Micro pestle | Carl Roth GmbH + Co. KG | CXH7.1 | |
Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 µm pore size, 47 mm circle | GE Healthcare Life Sciences | 10401770 | |
Mixer for HPLC | Kontron Instruments | model: M 800 | |
Murashige & Skoog medium, salt mixture | Duchefa Biochemie | M0221 | |
OriginPro software | OriginLab Corp. | ||
Orthophosphoric acid, ≥85 %, p.a., ISO | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6366.1 | |
Partisphere 5 µm SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm | Hichrom Limited | 4621-0505 | |
Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis | Sigma-Aldrich | 311421 | |
Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile | Greiner Bio One International GmbH | 688161 | |
pH-indicator paper pH 5.5 - 9.0, Neutralit | Merck KGaA | 109564 | |
Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
Potassium carbonate | Carl Roth GmbH + Co. KG | P743.2 | |
Safe-Lock tubes, 1.5 mL | Eppendorf AG | 30120086 | |
Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK | Supelco | 57648 | |
SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL | Simport Scientific Inc. | S207-5 | |
Sterile bench | LaboGene | model: ScanLaf MARS 900 | |
Sucrose, ≥99,5 %, p.a. | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail | PerkinElmer Inc | 6013599 | |
Ultra-pure deionized water | Milli-Q | ||
Wrenchless WVS End Fitting Kit | Hichrom Limited | 4631-1001 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved