מתח כרוני משנה התנהגות בחירה הקשורה למאמץ במשימת מחסום Y-מבוך בעכברים

Summary

משימת מחסום Y-maze היא מבחן התנהגות הבוחן את המוטיבציה לבזבז מאמץ עבור תגמול. כאן, אנו דנים בבדיקת לחצים כרוניים מרובים מאומתים היטב כולל קורטיקוסטרון כרוני ומתח תבוסה חברתית עם התנהגות זו, כמו גם את הרומן כרוני לא מפלה לחץ תבוסה חברתית (CNSDS), אשר יעיל בנקבות.

Abstract

הפרעות במצב הרוח, כולל הפרעת דיכאון גדולה, יכול להיות מואצת על ידי מתח כרוני. משימת מחסום Y-maze היא מבחן בחירה הקשור למאמץ המודד מוטיבציה לבזבז מאמץ ולקבל תגמול. בעכברים, חשיפה ללחץ כרוני משפיעה באופן משמעותי על המוטיבציה לעבוד עבור תגמול ערך גבוה יותר כאשר תגמול ערך נמוך יותר זמין באופן חופשי בהשוואה לעכברים ללא לחץ. כאן אנו מתארים את הפרדיגמה הכרונית של ממשל קורטיקוסטרון, המייצרת שינוי בתגובה מאמץ במשימת מחסום Y-maze. במשימת המבוך Y, זרוע אחת מכילה 4 כדורי מזון, בעוד הזרוע השנייה מכילה רק 2 כדוריות. לאחר עכברים ללמוד לבחור את זרוע תגמול גבוה, מחסומים עם גובה גדל בהדרגה לאחר מכן נכנסים לזרוע תגמול גבוה על הפעלות מבחן מרובות. למרבה הצער, רוב פרדיגמיות מתח כרוניות (כולל קורטיקוסטרון ותבוסה חברתית) פותחו בעכברים זכרים והם פחות יעילים בעכברים נשיים. לכן, אנו דנים גם בלחץ תבוסת חברתית כרונית (CNSDS), פרדיגמת מתח שפיתחנו היעילה בעכברים זכרים ונשים. תוצאות חוזרות עם לחצים כרוניים מרובים בעכברים זכר ונקבה בשילוב עם שימוש מוגבר במשימות התנהגות רלוונטיות לתרגום יסייעו לקדם את ההבנה כיצד מתח כרוני יכול לזרז הפרעות במצב הרוח.

Introduction

הפרעות במצב רוח כגון דיכאון וחרדה נפוצות מאוד בחברה של היום. עשרות שנים של עבודה חיפשו ללא הרף טיפולים משופרים ומודלים מכרסמים רלוונטיים כדי ללמוד הפרעות מורכבות אלה¹. מתח כרוני הוא גורם תורם להפרעות במצב הרוח כמו דיכאון². לכן, פרדיגמים מתח כרוני כגון מתח תבוסה חברתית כרונית (SDS) וממשל קורטיקוסטרון כרוני (CORT) פותחו בעכברים זכרים, כעת הם בשימוש נרחב כדי להעריך את ההשפעות הנוירוביולוגיות וההתנהגותיות של חשיפה ללחץ כרוני. הבדיקות ההתנהגותיות הנפוצות ביותר להערכת השפעות מתח כרוניות כוללות משימות הקשורות להתנהגות הימנעות, כגון מבוך מוגבה בתוספת, שדה פתוח, והאכלה מודחקת חדשנית, או עם יעילות נוגדת דיכאון, כגון מבחן שחייה כפוי. עם זאת, התנהגויות אלה אצל מכרסמים ללא ספק חסר פנים, וחשוב מכך, תוקף חזוי ירלוונטיות תרגום להפרעות אנושיות כגון דיכאון.

פרדיגמת מתח כרונית פופולרית, מתח מתון כרוני בלתי צפוי (CUMS), אומת בהרחבה באמצעות התנהגויות כגון העדפת סוכרוז³. CUMS מפחית העדפה לפתרון סוכרוז 1% בהשוואה למים ומפורש היסטורית כהתנהגות הקשורה לאהדוניה^4,5. עם זאת, הפחתה זו העדפת סוכרוז אינו נצפתה בבני אדם עם הפרעת דיכאון גדולה^6,7. בנוסף, העדפת סוכרוז אינה מאפשרת לחקור את המוטיבציה לתגמול מאמץ.

לאחרונה, כמה מחקרים הסיטו את המיקוד להתנהגויות אחרות הקשורות מוטיבציה^{ותגמול 8,9}. משימות אלה יש ערך תרגום מבטיח כי הערכות התנהגות דומות יחסית ניתן לבצע הן בבני אדם והן מכרסמים. כאן, אנו מתארים את הפרדיגמה CORT ו-SDS ואת השפעותיהם במשימה התנהגותית מחסום Y-מבוך המודד מוטיבציה להפעיל מאמץ לגמול. לאחר מכן אנו דנים בפרדיגמת מתח כרונית חדשה שפיתחנו, לחץ תבוסת חברתית כרונית לא מפלה (CNSDS), אשר יעיל בעכברים זכר ונקבה.

ניהול קורטיקוסטרון כרוני (CORT) היא פרדיגמה שנועדה לחקות מתח כרוני ללא חשיפות מתח בפועל. הפעלה של ציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-יותרת הכליה על ידי תוצאות מתח בשחרור אנדוגני של קורטיזול^{סטרואידים יותרת הכליה בבני אדם 10,,11,,12} ו קורטיקוסטרון^{בעכברים 13,14}. משלוח של קורטיקוסטרון דרך מי השתייה של עכברים זכרים בוגרים במשך 4 שבועות לפחות גורם לתגובות התנהגותיות לא ממחלה במשימות הימנעות כגון שדה פתוח, מבוך מוגבה בתוספת מבוך,^{וחידוש מודחק האכלה 10,11,12},^13,14,15,16.^, מעניין, CORT משפיע גם על עיבוד תגמול במשימות אינסטרומנטליות^16,17,18,19. הפרדיגמה CORT המתוארת כאן מייצרת ריכוז סרום עקבי של מתחת 100 ng/mL CORT, שהוא יותר מחמש פעמים פחות מזה המיוצר על ידי לחץ אקוטי כגון^{שחייה כפויה 15}. לכן, ניהול CORT כרוני לא סביר לגרום היפרקורטיזולמיה. בעוד CORT כרוני יעיל רק בעכברים^{זכר 20}, הוכחנו לאחרונה כי היא מייצרת שינוי חזק בתגובה מאמץ במשימת מחסום Y-מבוך²¹. למיטב ידיעתנו, זה היה אחד המחקרים הראשונים לבחון את ההשפעות של מתח כרוני על התנהגות בחירה הקשורה למאמץ בעכברים^{זכרים 21}. מחקר קודם אחד הוכיח לראשונה את ההשפעה של לחץ ריסון חריף על קבלת החלטות מבוססות מאמץ^{בחולדות 22}. בהתנהגויות בחירה הקשורות למאמץ, בעל חיים בוחר או להפעיל מאמץ עבור תגמול בעל ערך גבוה או לקבל תגמול בעל ערך נמוך יותר הזמין באופן חופשי יותר. בבני אדם, ההוצאה על מאמץ עבור משימת תגמולים (EEfRT), הוא משחק מחשב שפותח כדי להיות מקביל למשימות בחירה הקשורות למאמץ בעכברים²³. דיכאון תוצאה של תגובות לא מופרך ב EEfRT (הסבירות מופחתת של בחירת משימות קשות עבור תגמולים בעלי ערך גבוה). לכן, משימות בחירה הקשורות למאמץ מכרסמים מעניינות במיוחד בשל הרלוונטיות התרגום שלהם.

מתח תבוסת חברתית כרונית (SDS) הוא אחד המודלים הלחץ הקדם-לילי נחוץ יותר בעכברים זכרים. זהו פרוטוקול של 10 ימים שבו גדול, אגרסיבי מגדל בדימוס CD-1 זכרים לתקוף עכברים ניסיוניים, בדרך כלל C57BL/6J, ב 5 דקות מפגשים^{יומיים 24}. זה מייצר פנוטיפ התנהגותי לא מפנק חזק בתת קבוצה של עכברים ניסיוניים. בדיקת אינטראקציה חברתית משמשת כדי לשכבות עכברים לאוכלוסיות עמידות או רגישות ללחץ התבוסה, ומספר מחקרים השתמשו במאפיין ייחודי זה של SDS כדי לחקור את מנגנוני המעגל המולקולרי והנוירי הבסיסי הסתמכות מתח ורגישות. כאן אנו מתארים את פרטי פרדיגת CORT ואת יישומה למשימה ההתנהגותית של מחסום Y-maze. אנו דנים גם באפקטים SDS במשימת מחסום Y-maze. משימת מחסום Y-maze מבוססת על משימת מחסום T-מבוך, אשר משמש בעיקר חולדות כדי למדוד מוטיבציה לבזבז מאמץ עבור תגמולים גבוהים או נמוכים נוכח בשתי^זרועותהמבוך 8^,9,25. משימה זו יושמה גם כדי ללמוד תגובה מאמץ בעכברים מנוהל קפאין או דופמין אנטגוניסטים בעכברים²⁶. מכרסמים יכולים גם לבזבז מאמץ גדול יותר על ידי טיפוס על מחסומים של גובה הולך וגדל בהדרגה בזרוע אחת של המבוך עבור ערך תגמול גבוה יותר, בדרך כלל 4 כדורי פרס, או לבזבז באופן משמעותי פחות מאמץ בזרוע השנייה של המבוך כדי לקבל רק 2 כדורי^{פרס 9}. פרדיגמות תבוסה חברתית של 10 ימים לייצר פנוטיפ חזק ללא תקלות בעכברים רגישים משך כ 30 ימים, אז שינינו את המשימה מחסום Y-מבוך כדי לאמן מהר יותר ולבדוק בעלי חיים על מנת להשלים את כל הניסויים בתוך מסגרת זמן זו 30 יום²⁴. לכן, כאן אנו גם מפרטים פרוטוקול משימה התנהגותית מחסום Y-maze המכיל אימונים מרוכזים ומפגשי מבחן מחסום יחיד כדי למדוד מוטיבציה לבזבז מאמץ לתגמול בעכברים כרוניים חשופי מתח.

למרבה הצער, הן קורטיקוסטרון כרוני ולחץ תבוסת חברתית כרונית פותחו בעכברים זכרים והם פחות יעילים בעכברים נקבה. זה מאוד בעייתי כמו נשים נוטים יותר מאשר גברים להיות מאובחנים עם הפרעות במצב רוח כגון דיכאון¹. התאמות חכמות SDS אפשרו שימוש בעכברים נקבה אבל דורשים ניתוחים קשים או^{איסוף שתן מייגע 26,27}. לאחרונה תיארנו שינוי פשוט בפרדיגמת SDS, הנקראת מתח תבוסת חברתית כרונית (CNSDS). CNSDS מאפשר ריבוד רגיש וגמיש של עכברים זכר ונקבה ניסיוניים²⁸. הן עכברים רגישים נקבה וזכר חשופים CNSDS להראות הימנעות מוגברת של זרועות פתוחות במבוך מוגבה פלוס של המרכז בשדה פתוח ולהציג השהיה מוגברת לאכול בהאכלה מודחקת חידוש. CNSDS הוא גם יעיל יותר מאשר שינויים אחרים SDS, כמו שני המינים משולבים במפגשי תבוסה. התוצאה היא תשואה מוגברת של עכברים ניסיוניים ללא עלייה בזמן ומאמץ הקשורים הנדרשים כדי להשלים את הפרוטוקול. לכן, אנו מסכמים את כתב היד הזה עם מצגת מעמיקה של פרדיגמת מתח כרונית שפותחה לאחרונה.

Protocol

ניסויים אלה נערכו בהתאם להנחיות NIH לטיפול בבעלי חיים במעבדה ואושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש המוסדיים בבעלי חיים באוניברסיטת רטגרס.

1. קורטיקוסטרון כרוני (CORT)

1. הקצה עכברים באופן אקראי לקבוצות טיפול. לחלק באופן אקראי עכברים זכר בוגר C57BL/6J לתוך רכב וקבוצות קורטיקוסטרון (CORT).
   1. עכברי רכב בית בכלובים נפרדים, ועכברי CORT באחרים, כמו הטיפול שלהם מועבר דרך בקבוק המים של הכלוב.
   2. תייגו כרטיסי מים מיוחדים כדי למקם בכלוב המ מודיע לצוות הטיפול בבעלי חיים כי בקבוקי המים מכילים פתרונות הדרושים לניסוי.
2. להפוך את פתרון הרכב על ידי המסת 3.375 גרם של בטא-ציקלודקסטרין לתוך 750 מ"ל של מי ברז במיכל זכוכית בגודל 1 L בורג העליון.
   1. מלא בקבוקי מים כלוב רכב עם פתרון זה. ודא שהבקבוק אינו דולף כדי למדוד את הצריכה הנוזלית.
   2. תייגו את המכל וחסנו בטמפרטורת החדר על המדף במעבדה. השתמש בתמיסת הרכב כדי למלא בקבוקי כלוב במשך כשבוע.
   3. למלא בקבוקי רכב לאורך כל השבוע. למלא בקבוקי כלוב 1x-2x במהלך השבוע במידת הצורך. תחליף לבקבוק טרי פי 1 בשבוע בתחילת השבוע או בסוף השבוע.
      הערה: לאחר שבוע, בטא-ציקלודקסטרין יתחיל לכסות את החלק הפנימי של בקבוק המים והופך את הפתרון מעונן.
   4. לפקח על כמות הנוזלנצרך פעמיים בשבוע ולהקליט. לשקול כל בקבוק בהתאמה להקליט, להיזהר לא לשפוך כל נוזל. למלא ולהחזיר כל בקבוק.
      הערה: כלוב של 5 עכברים ישתה 80-120 מ"ל של נוזל ב 3-4 ימים.
3. להפוך את פתרון CORT על ידי המסת ראשון 3.375 גרם של בטא-ציקלודקסטרין לתוך 750 מ"ל של מי ברז במיכל זכוכית בגודל 1 L בורג העליון. לאחר מכן להוסיף 26.25 מ"ג של קורטיקוסטרון.
   1. תמיסת CORT Sonicate כדי להמיס CORT לתוך המים. מניחים את המיכל באמבט מים מנקה אולטראסוניות. Sonicate ב 40 kHz במשך כ 30 דקות או עד corticosterone מומס נוזל נראה ברור.
      הערה: homogenizers אולטראסוניות (טיפ בסגנון) יעילים גם להמסת CORT.
   2. מלא בקבוקי מים לכל כלובי CORT עם פתרון. מיכל תווית ולאחסן בטמפרטורת החדר על המדף במעבדה. פתרון CORT יכול לשמש למילוי בקבוקי כלוב במשך כשבוע.
      הערה: השתמשו בבקבוקי מים מזכוכית חומה או בבקבוקי פלסטיק אטומים, מכיוון ש-CORT רגיש לאור.
   3. לפקח על כמות הנוזלנצרך פעמיים בשבוע ולהקליט. שקול את כל כלי הרכב ועכברי CORT מדי שבוע כדי להשוות את הנוזל הנצרך למשקל של עכברים בתוך כל כלוב.
   4. כדי לקבוע את נפח הנוזל הנצרך (mL/g/day), השתמש במשוואה הבאה:
      (כלוב נפח שתה ב 3-4 ימים האחרונים) / (משקל גוף ממוצע של עכברים בכלוב) X מספר ימים מאז רכב או בקבוק CORT כבר מחדש מלא)
      הערה: כלוב ממוצע של n = 5 זכר בוגר C57BL/6J עכברים לצרוך בממוצע 0.25 – 0.30 מ"ג / g/day, אשר בדרך כלל נשאר עקבי באמצעות ליביתום אד ותקופות זמן ללא מזון. ריכוזים אלה לגרום מינונים משוערים של 24 מ"ג/ק"ג/יום בטא-ציקלודקסטרין, ו 9.5 מ"ג/ק"ג/יום CORT^15,16.
4. לחץ תבוסה חברתית (SDS)
   1. השתמש בפרוטוקולי לחץ תבוסת חברתית סטנדרטיים כמתואר^{לעומק במקום אחר 24,29}.
5. משימת מחסום Y-מבוך
   1. מניעת מזון למשימת מחסום Y-maze
      1. יום לאחר השלמת בדיקת האינטראקציה החברתית, שקול את כל העכברים בקרה וניסיוני. זה יהיה משקל הגוף שלהם האכלה חופשית.
         הערה: בכאן, אנו משתמשים ב"בקרה" ו"ניסיונית" כדי להתייחס הן לבקרת SDS והן לעכברים ניסיוניים של SDS, כמו גם לעכברים המנוהלים על-ידי רכב ו-CORT בפרדיגמות SDS ו-CORT המתאימות.
      2. כדי למנוע מהעכברים, הסר רק את האוכל של המעבדה מהצד C57BL/6J של כל כלוב.
      3. לשקול את כל העכברים, כמו גם את כמות האוכל מעבדה כי יינתן מדי יום, על מנת לשמור כראוי על משקל הגוף על כ 90% של משקל האכלה חופשית לאורך כל הבדיקות.
         הערה: כמות המזון הנמסר בכלוב הביתי של כל עכבר או עכבר תהיה תלויה במשקל הגוף המשתנה ובכמות כדורי הגמול הנצרכת בכל יום של אימון או בדיקות במבוך Y.
      4. לבסס היכרות עם כדורי הפרס. לזרוק כף קטנה של 20 מ"ג של כדורי מזון מבוססי תבואה (Bio-Serv) לתוך הכלוב הביתי. זה יהיה לבסס היכרות עם הכדורים ולהניע את העכברים לצרוך אותם ב-Y-מבוך באימונים קבועים ואימונים ראשוניים.
6. Y-מבוך 2 מנואם
   1. לבנות מבנה Y-מבוך של לבן אטום 3/16 "רוחב פרספקס, עם שלוש זרועות מדידה 26 ס"מ אורך, 20 ס"מ גובה, ו 7 ס"מ רוחב.
   2. השתמש במחיצות המחליקות בין חריצים במבוך Y כדי לאפשר לחוקר לסגור את תיבת ההתחלה שבה העכברים ממוקמים בתחילה, או להכיל את העכבר לתוך כל זרוע לאחר שהם בחרו ונכנסו לזרועות השמאליות או הימניות של מבוך Y.
   3. צור מספר מחסומים 10, 15 ו-20 ס"מ גבוהים Y-מבוך מתוך רשת התיל עבור הצד האנכי, ועם פרספקס בזווית של כ- 45° בצד האחורי בזווית. זה מאפשר לעכברי C57BL/6J לאחוז ולטפס על צד רשת התיל האנכית של כל מחסום, ולאחר מכן לחצות את הצד הזוויתי פרספקס של המחסום.
      1. הוסף שלבים דקים בצד הזוויתי כדי לאפשר משיכה גדולה יותר.
7. Y-מבוך מגורים
   1. לתכון את כל העכברים בקרה וניסיוניים ל-Y-מבוך.
      1. יום לאחר מניעת מזון, מניחים מספר גדול של 20 כדורי מזון מ"ג מבוססי תבואה (למשל, Bio-Serv) בכובע של צינור צנטריפוגה 50 מ"ל והמקום בקצוות של כל זרוע של מבוך Y. כובעים אלה משמשים ככלי קיבול מזון קטנים לעכברים, והעכברים ילמדו בקלות לאכול את כדורי המזון.
      2. מקם כל עכבר בתיבת ההתחלה של מבוך Y עם המחייצה תיבת התחלה במקום.
      3. לאחר מספר שניות, הסר את המחייצה, ואפשר לכל עכבר לחקור את מבוך ה-Y למשך 15 דקות. כמות זמן זו מאפשרת לעכבר לחקור כראוי את כל זרועות המבוך ולבסס היכרות עם ההתניות.
         הערה: עכברים מסוימים אינם רשאים לצרוך כדורי מזון ביום זה של מגורים.
   2. ביום שלמחרת, להשלים 15 דקות 2-מבוך מגורים באמצעות הליך זהה.
      1. שימו לב לעכברים שלא אכלו כדוריות. לעכברים האלה, זרוק עוד סקופ קטן של כדורים לתוך הכלובים הביתיים שלהם.
8. אימון בחירה כפויה של מבוך Y
   1. ציין את הגמול הגבוה (HR) ואת זרוע התגמול הנמוך (LR) עבור כל עכבר.
      1. הקצה עכברים באופן אקראי הן בקבוצות בקרה והן בקבוצות ניסיוניות, הזרוע השמאלית כזרוע התגמול הגבוה (HR) והיד הימנית כזרוע התגמול הנמוך (LR), או להיפך. לפיכך, 4 כדורי יהיה זמין בכל משפט בצד שמאל, זרוע HR, ו 2 כדורי זמין בצד ימין, זרוע LR, או ההפך.
      2. איזון נגדי של זרועות LR ו-HR ייעודיות אלה הן בקבוצה בקרה והן בקבוצה ניסיונית, כך שכמחצית מכל קבוצה הייתה זרוע שמאל כזרוע משאבי אנוש, ולמחציתן הייתה הזרוע הימנית כזרוע משאבי אנוש.
   2. ניסויי בחירה כפויה
      1. לאחר 2 ימים של מגורים Y-מבוך, יש עכברים להתחיל 3 ימים של 10 ניסויים של אימון בחירה כפויה.
      2. עבור כל ניסוי בחירה כפויה, מקם את העכבר בתיבת ההתחלה ולאחר מכן הסר את המחיצה, ואפשר לעכבר 60 s להזין את הזרוע השמאלית או הימנית ולצרוך את הכדורים הזמינים. עבור כל בלוק ניסיון בחירה כפויה את הזרוע הנגדית עם המחיצה, מכריח את העכבר לבחור את הזרוע השנייה. עבור ניסיון בחירה כפויה של משאבי אנוש, חסום גישה לזרוע LR, או להיפך.
      3. הסר את העכבר לאחר המשפט וחדש את כדוריות השונות שנאכלו.
      4. ניסויים חלופיים לבחירה כפויה עבור כל עכבר בכל יום אימון, כך שעכברים משלימים 5 HR ו- 5 LR לניסויים בבחירה כפויה.
         הערה: ניסויים בבחירה כפויה מאמנים את העכברים לשייך יד אחת לתגמול הגבוה יותר והשנייה עם הפרס הנמוך יותר.
      5. המקם את העכבר בחזרה לתוך הכלוב הביתי שלו ולאחר מכן להפעיל לא יותר מ 3-5 העכברים הבאים על מנת לשמור על מרווח בין משפט 5 דקות עבור כל עכבר.
9. אימון בחירה חופשית מבוך Y
   1. ניסויים בבחירה חופשית
      1. התחל כל מפגש בחירה חופשית עם ניסיון בחירה כפויה של משאבי אנוש ו- LR. לכן, עכברים יחוו להיות נאלץ לתוך כל זרוע לפני תחילת 10 ניסויים בחירה חופשית.
      2. מקם כל עכבר בתיבת ההתחלה והסר את המחייצה. לאחר שהעכבר בחר זרוע וחצה אותה עד הסוף שבו ממוקמת הספל המכיל את הכדורים, הנח את מחיצת הזרוע במקום בצד זה, ותנעל את העכבר עד שהוא נצרך את הכדורים.
      3. הסר את העכבר בחזרה לכלוב הבית שלו והריץ את 3-5 העכברים הבאים המשמשים במחזור זה כדי לאפשר מרווח זמן של 5 דקות בין ניסיון.
   2. הקלט את הנתונים הבאים: השהיה לבחירת זרוע, בחירת זרוע והשעיה כדי להגיע לגביע כדורי.
      1. הקלט איזו זרוע העכבר נכנס וחוצה באופן מלא לגביע כדורי. כמו כן להקליט את ההשעיה כדי לבחור את הזרוע ולהגיע לגביע כדורי.
      2. שקול כל ניסיון שבו עכבר אינו בוחר זרוע או אינו צורך את כל 4 או 2 כדורי כמשפט שהושמט.
   3. 70% קריטריון בחירה חופשית
      1. רטו איזו זרוע נבחרת עבור כל 10 הניסויים בבחירה חופשית מדי יום.
      2. לאחר שעכבר בחר את זרוע משאבי האנוש ב- 7 מתוך 10 הניסויים ביום אימון בחירה חופשית (70% קריטריון), הזז את העכבר למפגשי בדיקות מחסום.
         הערה: המשך באימון בחירה חופשית עד שכל העכברים יגיעו לקריטריון זרוע ה-HR בשיעור של 70% כדי להבטיח אפליה נאותה של זרועות משאבי אנוש ו-LR ושעכברים יפגינו העדפה שווה לזרוע משאבי האנוש.
10. בדיקת מחסום מבוך Y
    1. הפעלת בדיקת מחסום של 10 ס"מ
       1. מניחים את מחסום ה-10 ס"מ באמצע הדרך במורד זרוע משאבי האנוש במבוך Y.
       2. התחל עם מספר ניסויים בבחירה כפויה עבור שתי הזרועות. עכברים עמידים לטיפוס על המחסום יכולים להיות מתבקשים עם חתיכת פרספקס ארוכה ודקה.
          הערה: מניסיון, אנו ממליצים על לפחות 2 ניסויים לבחירה כפויה עבור זרועות HR ו- LR בתחילת כל מפגש בגובה מחסום חדש. אנו ממליצים להקליט ניסויים היכן שיש צורך להנחות את העכבר לטפס מעל המחסום אם זה הופך להיות נחוץ. עכברים בדרך כלל ללמוד לטפס על מחסום 10 ס"מ, שהוא לא כל כך גבוה שהם לא יכולים לעמוד ולראות על זה, בתוך 1-2 ניסויים. המחסום יצטרך להיות מונח בצד השני עבור עכברים עם הזרוע היריבה כזרוע משאבי אנוש המיועדת.
       3. מקם כל עכבר בתיבת ההתחלה, הסר את המחיץ ואפשר לעכבר לחצות את המבוך ולבחור זרוע ל- 10 ניסויים בבחירה חופשית המכילה את מחסום 10 ס"מ בזרוע משאבי האנוש.
       4. אם העכבר בוחר בצד משאבי אנוש, הוא יטפס מעל המחסום כדי לקבל את הפרס הגדול יותר, 4 כדורי. אחרת, הוא יבחר את זרוע LR ופשוט יחצה את רצפת המבוך עבור הפרס הנמוך יותר, 2 כדוריות.
       5. הקלט את הזרוע שנבחרה ואת ההשעיה כדי לבחור זרוע ולהגיע לגביע הכדורי עבור כל הניסויים. באופן דומה לסובב 4-6 עכברים סה"כ מחזור, כדי לשמור על מרווח בין ניסיון של 5 דקות.
          הערה: ספריי 70% אתנול במבוך Y ולנגב יבש באופן עקבי ובין כל עכבר.
    2. הפעלת בדיקת מחסום של 15 ס"מ
       1. ביום שלמחרת להשלים את כל השלבים המפורטים כאמור לעיל (שלב 1.10.1), אך עם מחסום 15 ס"מ גבוה בזרוע HR.
    3. הפעלת בדיקת מחסום של 20 ס"מ
       1. ביום שלמחרת להשלים את כל השלבים המפורטים כאמור לעיל (שלב 1.10.1), אך עם מחסום 20 ס"מ גבוה בזרוע HR.
          הערה: מניסיון, על ידי גובה מחסום 20 ס"מ רוב העכברים SDS רגישים או CORT ניסיוני (ואפילו כמה עכברי בקרה) יזיזו את תגובותיהם לזרוע LR, כפי שהם לא מוטיבציה מספיק כדי לטפס על מחסום גבוה 20 ס"מ. כמו כן, מתאם פרספקס ייתכן שיהיה צורך להשתמש כדי למנוע מעכברים לטפס מראש מחסום זה אל הקצוות של קירות מבוך Y. איננו ממליצים לבנות מבוך Y גבוה יותר, כפי שזה הופך להיות קשה יותר עבור הנסוי למלא את הכדורים בכל ולהסיר את העכברים לאחר כל ניסוי.
    4. מפגש מבחן אפליה תגמול
       1. כדי להבטיח שעכברים ניסיוניים ובקרה יציגו מנופים נאותים ודומים של אפליה בתגמול, ערכו בדיקת אפליה.
       2. בצע את כל השלבים לעיל (שלב 1.10.1) אך מקם מחסום של 10 ס"מ בזרוע LR. עכשיו, שתי הזרועות מכילות מחסומים של 10 ס"מ, והעכברים יצטרכו לטפס מעל או כדי להשיג את פרס 4 או 2 כדורי.
       3. הקלט השהיה ובחירה בזרוע עבור כל 10 הניסויים.
          הערה: מכיוון שעכברים יצטרכו לבזבז את אותו מאמץ כדי להשיג גמול, עכברים צריכים לבחור את זרוע משאבי האנוש ברוב הניסויים. כדי לבחון השהיות לבחירת זרוע משאבי אנוש ו- LR, חשב השהיה ממוצעת של זרוע משאבי אנוש והשעיה ממוצעת של זרוע LR עבור כל עכבר בודד. לאחר מכן, השווה השהיה לבחירת שתי הזרועות באמצעות ANOVA מעורב דו-מבין, עם SDS (בקרה, SDS-רגיש, SDS-גמיש) כגורם בין הנושאים, וזרוע (זרוע HR, זרוע LR) כגורם בתוך הנושאים.

2. מתח תבוסת חברתית כרונית לא מפלה (CNSDS)

1. מסך להתנהגות אגרסיבית בעכברי CD-1
   1. הכן זכר אחד ועכבר C57BL/6J אחד בכלוב הביתי של כל תקליטור-1 למשך 180 שניות או עד שה-CD-1 יתקוף את שני העכברים. עכברים אלה C57BL6/J לא צריך להיות נאיבי, ולא ישמש בניסויים נוספים. במהלך שלב הקרנה תוקפני זה, לא cohouse עכברים C57BL/6J עם עכברי CD-1.
      1. הקלטה של ההמהיה כדי לתקוף את שני עכברי C57BL/6J עבור כל תקליטור-1.
      2. בחר את כל התוקפים CD-1 לתקוף הן זכר ונקבה C57BL/6J עכברים בתוך 60 שניות על הפעלות רצופות מתוך סך של 3 הפעלות הקרנה. אחרים יכולים לשמש לדיור מוגן בכלובים ביתיים.
         הערה: אזהרה חשובה של תבוסה חברתית היא הנוכחות של פציעה כתוצאה של תוקפנות פיזית. כל עכבר בהקרנה ושלבים ניסיוניים יש לבדוק פצעים ולטפל עם כלורו-הקסאן חיטוי אם נגעים בעור קטן נוכח. יש להסיר כל עכבר עם פצע שרוחבו יותר מ-1 ס"מ מהניסוי.
2. הקצה עכברים לקבוצות בקרה וניסיוניות.
   1. אסוף את כל העכברים הנאיביים זכר ונקבה C57BL/6J, כמו גם מוקרנים זכר בדימוס CD-1 מגדלים, כמו גם זכרים CD-1 לשימוש בדיור מוגן.
      1. הקצה באופן אקראי עכברים זכר ונקבה בוגרים C57BL/6J כדי לשלוט או תנאים ניסיוניים. כל זכר ונקבה יהיו מזווגים לכל מפגשי התבוסה החברתית בקבוצה הניסיונית CNSDS. זכרים ונקבות בקבוצת בקרת CNSDS יסתובבו בכל יום.
      2. הקצה זכרים CD-1 לשימוש במפגשי תבוסה חברתית או להיות באירוח משותף עם זכרים ונקבות ניסיוניים לאחר כל מפגש, אשר יהיה לסירוגין מדי יום עבור כל זוג של עכברים זכר ונקבה C57BL/6J.
3. לחץ כרוני לא מפלה תבוסה חברתית (CNSDS)
   1. הבא את כל העכברים לחדר תבוסה חברתי ייעודי, כולל כל זכרי CD-1, עכברי CNSDS Control זכר ונקבה C57BL/6J, ועכברים ניסיוניים של CNSDS C57BL/6J.
      1. ליישר 4-6 כלובים של זכרים CD-1 עם C57BL / 6J זכרים ונקבות עם כלובים CD-1 בחזית ו C57BL / 6J כלובים מאחור.
      2. ציין עם תגי זיהוי כלוב איזה עכבר מותקף ולאחר מכן שותה יחד עם איזה CD-1 כדי להבטיח את הארגון של כל העכברים.
         הערה: לאחר אתחול ניסויים ביום הראשון, עכברים ניתן לסובב עבור הנותרים 9 מפגשי תבוסה כך שכל זוג זכר ונקבה C57BL/6J מסובבים כלוב אחד שמאלה עבור כל מפגש. הדבר מאפשר אינטראקציה חדשה עם תקליטורי CD-1 חדשניים בכל הפעלה.
   2. הליך קבוצתי ניסיוני של CNSDS
      1. מקום זכר בוגר אחד ועכבר C57BL/6J בוגר אחד לתוך הכלוב הביתי של כל זכר תוקפני CD-1 למפגש תבוסה חברתית של 5 דקות.
      2. שיא השהיה התקפה ותדירות של התקפה עבור שני זכר ונקבה ניסיוני C57BL / 6J עכברים.
      3. לאחר 5 דקות, הסר עכבר C57BL/6J זכר והמקום בכלוב של זכר CD-1 המשותק במקום, המופרד על ידי מחסום פרספקס ברור ומחורר. הפרד את ה-CD-1 ועכבר C57BL/6J עם מחסום פרספקס ברור ומחורר דומה. לסירוגין אם זכר או נקבה C57BL/ 6J העכבר שיהיה עם התוקפן CD-1 בכל יום.
         הערה: לאחר כל אינטראקציה יומית של 5 דקות, כל עכבר ייבחן לפציעות ופצעים שטופלו אם פחות מ-1 ס"מ. כל פצע גדול מ- 1 ס"מ יגרום להסרת המתת חסד מיידית של העכבר. לכן, עכברים ניסיוניים זכר ונקבה הם בשותף עם התוקפן CD-1 במשך 5 ימים עם הרומן CD-1 לא בשימוש במפגש ההתקפה במשך 5 הימים הנותרים. מחסומי פרספקס ברורים ומנוקבים מונעים אינטראקציה פיזית אך מאפשרים מגע חושי עם תוקפן CD-1 ב-24 השעות שבין המפגשים. שפות הנרתיק ניתן לבצע על כל העכברים הנשיים כ 30 דקות לאחר תבוסה בכל יום כמתואר קודם^{לכן 28.}
   3. הליך קבוצת בקרה של CNSDS
      1. מקם נקבה שליטה אחת בכלוב הבית של עכבר אחד C57BL/ 6J זכר שליטה.
      2. לאחר 5 דקות, עכברים נפרדים ולהוות מפריד פרספקס ברור, מחורר בין העכברים.
      3. החזירו עכברים לחדר המושבה והניצו על מדף נפרד ככלובים ניסיוניים של CNSDS. בחדר המושבה יש לנו מדפים ייעודיים שבהם עכברים לחוצים שוזמנו בנפרד מעכברים אחרים בחדר המושבה. בנוסף, ניתן לראות את ההשפעות בעכברים שאינם לחוצים אם הם היו עדים לתוקפנות המתרחשת, כפי שניתן לראות בפרדיגמה^{תבוסה חברתית עקיפה 30}
      4. שים לב לכל התקפה או התנהגות הרכבה במהלך כל אינטראקציה של בקרה.
   4. שליטה בעכברים זכר ונקבה יוכנסו conspecific חדש בימים הבאים כפי שנעשה בקבוצות מסורתיות בקרת מתח תבוסה חברתית. השלם 10 ימים רצופים של בקרת CNSDS ומפגשים ניסיוניים.
      1. לאחר השלמת 10^{ו הסופי בקרה} או מושב CNSDS ניסיוני, לשתף את כל העכברים ולשמור על דיור משותף זה לאורך כל הבדיקות ההתנהגותיות. כל כלוב יכלול 2 עכברים המופרדים משני צדי המחיץ פרספקס כדי לאפשר חשיפה חושית. עכברי שליטה שוחסנים בעכברים אחרים לשליטה במין השני, בעוד עכברים ניסיוניים נמצאים במקום עם עכברים ניסיוניים ממין נגדי.
      2. כל נקבה C57BL/6J בקרה היא בשותף עם זכר C57BL / 6J בקרה זה אינטראקציה עם במפגש^10, עם ברור, מפריד פרספקס ממוקם לתוך הכלוב להפריד בין שני העכברים.
      3. כ-24 שעות לאחר התבוסה הסופית, הפעל בדיקת אינטראקציה חברתית סטנדרטית כדי לקבוע אם CNSDS מפחית את ההתנהגות החברתית עם עכבר CD-1 חדשני בהשוואה לשליטה, ולשכב עכברים "גמישים" או "רגישים" ללחץ^24,29.
   5. בדוק בקרת CNSDS ועכברים ניסיוניים זכר ונקבה בהתנהגויות אחרות, כולל המשימה מחסום Y-maze, ולשכב את קבוצת CNSDS לקבוצות CNSDS-עמיד CNSDS ו- CNSDS רגיש.
4. בדיקת אינטראקציה חברתית
   1. כיוונון ראשוני עבור בדיקת אינטראקציה חברתית
      1. 24 שעות לאחר מפגש התבוסה האחרון של CNSDS, ערכו בדיקת אינטראקציה חברתית.
      2. קח את כל העכברים בקרה וניסיוניים, כמו גם זכר CD-1 רומן לא בשימוש בפרדיגמה CNSDS, לחדר התנהגות נפרד כדי להפעיל בדיקת אינטראקציה חברתית.
      3. הגדר תא שדה פתוח סטנדרטי (75 ס"מ על 75 ס"מ) מתחת למצלמת הקלטה המחוברת לתוכנה למעקב התנהגותי (לדוגמה, את'ויז'ן) הפועלת במחשב ייעודי.
      4. הקימו ניסוי חדש עם אזור אינטראקציה חברתית של 24 ס"מ על 24 ס"מ סביב מיכל אינטראקציה (מיכל פרספקס קטן ומחורר שמודד כ-10 ס"מ על 10 ס"מ על 10 ס"מ) שימקם את הרומן CD-1 לאורך קיר אחד של השדה הפתוח, בשני מתוך 2 ניסויים רצופים של 2.5 דקות. כך, אזור אינטראקציה ברוחב 7 ס"מ מקיף את המיכל המכיל את עכבר CD-1 החדשן.
   2. הפעלת עכבר במבחן האינטראקציה החברתית
      1. מקם כל עכבר בפינה רחוקה של השדה הפתוח למשך ניסיון של 2.5 דקות ללא הווה CD-1 והתחיל את תוכנת ההקלטה.
         הערה: זכור שיש לשים את הגורם המכיל של האינטראקציה במרכז קיר אחד של השדה הפתוח ולא להכיל עכבר CD-1 עבור ניסיון ראשון זה.
      2. לאחר 2.5 דקות, הסר את העכבר בחזרה לכלוב הביתי שלו. נקה את השדה הפתוח עם 70% אתנול.
      3. מקם את הרומן CD-1 זכר לתוך קוביית פרספקס מחוררת שנייה לאורך אמצע קיר אחד של השדה הפתוח.
      4. שוב, מקם את העכבר בפינה של השדה הפתוח למשך ניסיון שני של 2.5 דקות, כעת עם ה-CD-1 הנוכחי, והתחיל את תוכנת ההקלטה.
      5. הסר את העכבר והמקם אותו בחזרה בכלוב הבית שלו. הסר את התקליטור-1 והחזר אותו לכלוב הביתי שלו. נקה את השדה הפתוח עם 70% אתנול.
   3. הפעל את בקרת CNSDS הנותרת ועכברים ניסיוניים וחשב את יחס האינטראקציה.
      1. חזור על הליך זה עם כל העכברים האחרים כדי לכמת את הזמן שהושקע באזור האינטראקציה הן במשפט 1 והן במשפט 2 עבור כל בקרת CNSDS ועכבר ניסיוני.
      2. כדי לחשב יחס אינטראקציה, השווה את הזמן שהושקע באזור האינטראקציה החברתית במשפט 2 (CD-1 הנוכחי) לעומת במשפט 1 (CD-1 נעדר), באמצעות המשוואה הבאה:
         יחס אינטראקציה = (זמן באזור אינטראקציה במשפט 2)/(זמן באזור אינטראקציה במשפט 1)
   4. שכבות עכברים כמו "CNSDS-גמיש" או "CNSDS רגיש". לעכברים עמידים יש יחס אינטראקציה של > 1.0, בעוד שלעכברים רגישים יש יחס אינטראקציה של <=1.0.
      1. באמצעים התנהגותיים הבאים כגון משימת מחסום Y-maze או בדיקות התנהגות אחרות, לחלק את העכברים הניסיוניים CNSDS לתוך פנוטיפים אלה CNSDS עמיד ו- CNSDS רגישים.
      2. לכן, עבור נקבות, ANOVAs חד-כיוון יכול לנוהל בין בקרת CNSDS, CNSDS ניסיוני-גמיש, ו- CNSDS ניסיוני רגישים קבוצות, עם השוואות פוסט הוק כדי לקבוע הבדלים בין קבוצות במידת הצורך.
      3. להשוואות בין הבדלי מין, נהל ANOVAs דו-מבין עם CNSDS (בקרה, עמיד, רגיש) ומין (זכר, נקבה) כגורמים בין נושאים. השתמש בהשוואות שלאחר ההוק במידת הצורך.

תוצאות

CORT כרוני היה מנוהל במשך 4 שבועות ואחריו אימון מחסום Y-מבוך ובדיקות (איור 1A). בחבורה נפרדת, פרדיגמת SDS של 10 ימים באה באופן דומה לאחר אימון ובדיקות במשימת מחסום Y-maze (איור 1C), כדי לקבוע את ההשפעה של פרדיגמות מתח כרוניות אלה על התנהגות בחירה הקשורה למאמץ בעכברים זכר...

Discussion

בעוד פרדיגמת CORT כרונית מספקת מינון CORT קבוע מי השתייה, מניסיון יכול להיות כמה שונות בכמות הנצרכת על ידי עכברים. יתר על כן, ניתן להעריך את הצריכה רק עבור הכלוב הכולל, ומוצע נלקח בהתבסס על מספר העכברים בכלוב. בנוסף, דליפה יכולה להתרחש בעת שקילת הבקבוקים, העברת העכברים לבדיקות התנהגות, או בעת שי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic Sheet	McMaster Carr	8560K215	Clear, 3/16" thick, 24" X 36"
Beta-cyclodextrin	Sigma-Aldrich	C4767	500 mg
C57BL/6J Mice	Jackson Labs	000664	Adults age 7-8 weeks
Corticosterone	Sigma-Aldrich	C2505 or C27840	100 or 500 mg
Male CD-1 Mice	Charles River	022	"Retired Breeders"
PVC Acrylic Sheet	McMaster Carr	8560K215	White, 3/16" thick, 48" X 48"
Solidstate Ultrasonic Cleaner	Fisher Scientific	FS-28	Must reach 40 kHz
Steel Wire Cloth	McMaster Carr	9219T143	1 ft X 2 ft