만성 스트레스는 마우스의 Y-미로 장벽 작업에서 노력과 관련된 선택 행동을 변화시합니다.

요약

Y-미로 장벽 작업은 보상을 위한 노력을 소비하는 동기를 검사하는 행동 테스트입니다. 여기에서는 만성 코르티코스테론과 사회적 패배 스트레스를 비롯한 여러 가지 잘 검증된 만성 스트레스와 여성에게 효과적인 새로운 만성 비차별적 사회적 패배 스트레스(CNSDS)를 테스트하는 데 대해 논의합니다.

초록

주요 우울증 장애를 포함 하 여 기분 장애, 만성 스트레스에 의해 침전 될 수 있습니다. Y-미로 장벽 작업은 노력을 소비하고 보상을 받을 동기를 측정하는 노력 관련 선택 테스트입니다. 마우스에서 만성 스트레스 노출은 스트레스가 없는 마우스에 비해 더 적은 가치 보상이 자유롭게 제공될 때 더 높은 가치 보상을 위해 일하도록 동기 부여에 크게 영향을 미칩니다. 여기서 우리는 Y-미로 장벽 작업에 대한 노력의 변화를 낳는 만성 코르티코스테론 관리 패러다임을 설명합니다. Y-미로 작업에서 한 팔에는 4개의 음식 펠릿이 포함되어 있으며, 다른 팔에는 2개의 펠릿만 포함되어 있습니다. 마우스가 높은 보상 팔을 선택하는 법을 배운 후, 점진적으로 높이가 증가하는 장벽은 여러 테스트 세션을 통해 높은 보상 팔에 도입됩니다. 불행히도, 대부분의 만성 스트레스 패러다임 (코르티코스테론 및 사회적 패배를 포함) 남성 마우스에서 개발 하 고 여성 마우스에서 덜 효과적이다. 따라서, 우리는 또한 만성 비 차별적 사회적 패배 스트레스 (CNSDS), 우리가 개발하고 있는 스트레스 패러다임은 남성과 여성 마우스 둘 다에 효과적이다 토론합니다. 남성과 여성 마우스에서 여러 개의 별개의 만성 스트레스와 함께 반복 결과 번역 관련 행동 작업의 증가 사용과 결합 하는 어떻게 만성 스트레스 기분 장애를 침전시킬 수 있는 이해를 발전 하는 데 도움이 될 것입니다.

서문

우울증과 불안과 같은 기분 장애는 오늘날의 사회에서 매우 널리 퍼져 있습니다. 수십 년의 작업은 지속적으로 이러한 복잡한 장애를 연구하기 위해 개선 된 치료 및 관련 설치류 모델을^{검색했다 1.} 만성 스트레스는 우울증 과 같은 기분 장애에 대 한 기여 요인^2. 따라서 만성 사회적 패배 스트레스(SDS) 및 만성 코르티코스테론 투여(CORT)와 같은 만성 스트레스 패러다임은 남성 마우스에서 개발되었으며, 현재 만성 스트레스 노출의 신경생물학적 및 행동 효과를 평가하는 데 널리 사용되고 있다. 만성 스트레스 효과를 평가하기 위한 가장 널리 사용되는 행동 테스트에는 고가의 미로, 오픈 필드 및 참신억제 수유와 같은 회피 행동과 관련된 작업 또는 강제 수영 테스트와 같은 항우울제 효능이 포함됩니다. 그러나 설치류의 이러한 행동은 틀림없이 얼굴이 부족하며, 더 중요한 것은 우울증과 같은 인간 질환에 대한 예측 타당성 및 번역 관련성이 부족하다는 것입니다.

인기 있는 만성 스트레스 패러다임, 만성 예측할 수 없는 가벼운 스트레스(CUMS)는 자당 선호도^3과같은 행동을 광범위하게 사용하여 검증되었습니다. CUMS는 물에 비해 1% 자당 용액에 대한 선호도를 감소시키고 역사적으로 안도니아 관련 동작^4,,5로해석된다. 그러나, 자당 선호도에 있는 이 감소는 중요한 우울장애를 가진 인간에서 관찰되지 않습니다^6,,7. 또한, 자당 특혜는 노력 보상 동기의 연구를 허용하지 않습니다.

최근, 일부 연구는 동기 부여와^{8보상8,9와}관련된 다른 행동에 초점을 이동했다. 상대적으로 유사한 행동 평가는 인간과 설치류 모두에서 수행 될 수 있기 때문에 이러한 작업은 유망한 번역 값을 가지고있다. 여기에서는 보상을 위한 노력을 기울이기 위한 동기부여를 측정하는 Y-미로 장벽 행동 작업에서 CORT 및 SDS 패러다임과 그 효과를 설명합니다. 그런 다음 우리가 개발한 새로운 만성 스트레스 패러다임, 만성 비 차별적 사회적 패배 스트레스 (CNSDS)에 대해 논의합니다.

만성 코르티코스테론 투여 (CORT)는 실제 스트레스 노출없이 만성 스트레스를 모방하도록 설계된 패러다임입니다. 시상 하부 -뇌하수체-부신축의 활성화는 인간에서 부신 스테로이드 코티솔의 내인성 방출을 초래하여^10,,,11,12 및 corticosterone 마우스에서^13,,14. 적어도 4주 동안 성인 남성 마우스의 식수를 통해 코르티코세론을 전달하면 개방장, 고액^,플러스 미로, 참신억제수10,^{,10,11,,12,13,,14,15,16등의}회피 작업에서 부적응성 행동 반응이 발생한다. 흥미롭게도, CORT는^,또한 기악 작업^{16,17,18,,19에서}보상 처리에 영향을 미친다.^, 여기에 설명된 CORT 패러다임은 100 ng/mL CORT 이하의 일관된 혈청 농도를 생성하며, 이는 강제^{수영(15)과}같은 급성 스트레스에 의해 생성된 것보다 5배 이상 적습니다. 따라서 만성 CORT 투여는 고고체혈증을 유발할 가능성이 낮습니다. 만성 CORT는 남성^{마우스(20)에서만}효과적이지만, 최근에는 Y-미로 장벽^{작업(21)에서}힘있는 반응에 견고한 변화를 일으킨다는 것을 입증했습니다. 우리의 지식에, 이것은 남성 마우스에 있는 노력 관련 선택 행동에 만성 스트레스의 효력을 검토하는 첫번째 연구 결과의 한개이었습니다^21. 한 이전 연구는 먼저^쥐22의노력 기반 의사 결정에 급성 구속 스트레스의 영향을 보여 주었다. 노력 과 관련된 선택 행동에서, 동물은 고부가가치 보상을 위해 노력을 기울이거나 더 자유롭게 사용할 수있는 낮은 가치의 보상을 수락하기로 결정합니다. 인간에서 보상 작업(EEfRT)에 대한 노력 지출은^{마우스(23)의}노력 관련 선택 작업과 유사하게 개발된 컴퓨터 게임이다. 우울증은 EEfRT에 있는 적응형 반응 귀착됩니다 (고부가가치 보상에 대한 어려운 작업을 선택하는 가능성 감소). 따라서 설치류의 노력 관련 선택 작업은 번역 관련성 때문에 특히 흥미롭습니다.

만성 사회적 패배 스트레스 (SDS)는 남성 마우스에서 보다 널리 사용되는 전임상 스트레스 모델 중 하나입니다. 그것은 10 일 프로토콜 어디 큰, 공격적인 은퇴 개종 CD-1 남성 공격 실험 마우스, 일반적으로 C57BL/6J, 5 분 매일 세션^24. 이것은 실험마우스의 하위 집합에 있는 강력한 적응성 행동 표현형을 생성합니다. 사회적 상호 작용 시험은 패배 스트레스에 탄력또는 영향을 받기 쉬운 인구로 마우스를 계층화하는 데 사용되며, 여러 연구는 스트레스 의존과 감수성의 근본적인 분자 및 신경 회로 메커니즘을 조사하기 위해 SDS의 이 독특한 특성을 사용했습니다. 여기에서는 CORT 패러다임의 세부 사항과 Y-미로 장벽 행동 작업에 대한 구현에 대해 설명합니다. 우리는 또한 Y-미로 장벽 작업에 SDS 효과에 대해 논의합니다. Y-미로 장벽 작업은 주로 쥐에 사용되는 T-미로 장벽 작업을 기반으로하며, 주로 쥐가 미로^,8,9,925의두 팔에 존재하는 높고 낮은 보상에 대한 노력을 소비하는 동기를 측정합니다. 이 작업은 또한 마우스에서 카페인 또는 도파민 길항제를 투여한 마우스에서 열심히 반응하는 것을 연구하기 위해 구현되었다^26. 설치류는 더 높은 보상 값을 위해 미로의 한 팔에 점진적으로 높이증가의 장벽을 등반하여 더 큰 노력을 소비 할 수 있습니다, 일반적으로 4 보상 펠릿, 또는 미로의 다른 팔에 훨씬 적은 노력을 소비만 2 보상 펠릿^9. 10일 사회적 패배 패러다임은 약 30일 동안 지속되는 취약한 쥐에서 강력한 적응형 표현형을 생성하므로, 30일 기간^내에모든 실험을 완료하기 위해 Y-미로 장벽 작업을 보다 신속하게 훈련하고 테스트하도록 수정하였다. 따라서, 여기에서우리는 또한 만성 스트레스 노출 마우스에 있는 보상을 위한 노력을 소모하기 위하여 동기를 측정하기 위하여 응축된 훈련 세션 및 단 하나 장벽 시험 세션을 포함하는 Y-미로 장벽 행동 작업 프로토콜을 상세히 설명합니다.

불행히도, 만성 코르티코스테론과 만성 사회적 패배 스트레스는 남성 마우스에서 개발되었으며 여성 마우스에서 덜 효과적입니다. 이것은 여자가 불경기^1와같은 기분 장애로 진단될 남자 보다는 확률이 높기 때문에 높게 문제가 됩니다. SDS에 영리한 적응은 여성 마우스에서 사용을 허용하지만 어려운 수술이나 지루한 소변 수집^26,,27을필요로한다. 우리는 최근에 만성 비 차별적 사회적 패배 스트레스 (CNSDS)에게 불린 SDS 패러다임에 대한 간단한 수정을 기술했습니다. CNSDS는 실험적인 남성 과 여성^{마우스(28)의}민감하고 탄력적인 계층화를 허용한다. CNSDS에 노출된 암컷과 남성 용해성 마우스 모두 높은 플러스 미로와 열린 필드에 있는 중앙에 있는 열린 무기의 증가한 회피를 보여주고 참신억제된 먹이에서 먹기 위하여 증가한 대기 시간을 표시합니다. CNSDS는 또한 SDS에 대한 다른 수정보다 더 효율적이며, 남녀모두 패배 세션에서 결합되기 때문에. 이것은 프로토콜을 완료하는 데 필요한 시간과 노력의 관련 된 증가 없이 실험 마우스의 증가 수율 결과. 따라서, 우리는 최근 개발 된 만성 스트레스 패러다임의 심층적 인 프리젠 테이션으로이 원고를 결론을 내립니다.

프로토콜

이러한 실험은 NIH 실험실 동물 관리 지침에 따라 수행되었으며 러트거스 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 만성 코르티코스테론 (CORT)

1. 임의로 치료 그룹에 마우스를 할당합니다. 무작위로 차량 및 코르티코스테론 (CORT) 그룹으로 성인 남성 C57BL / 6J 마우스를 분할.
   1. 그들의 처리가 케이지의 물 병을 통해 전달되는 때, 다른 사람의 구별되는 새장에 있는 차체 마우스 및 CORT 마우스를 집.
   2. 동물 관리 직원에게 물병에 실험에 필요한 솔루션이 포함되어 있음을 통보하는 케이지에 특수 워터 카드를 라벨로 지정합니다.
2. 3.375g의 베타 사이클로덱스트린을 750mL 크기의 L 스크류 톱 유리 용기에 수돗물로 용해하여 차량 용액을 만드십시오.
   1. 이 솔루션으로 차량 케이지 물 병을 채웁니다. 병이 액체 소비를 측정하기 위해 누출되지 않도록 하십시오.
   2. 용기에 라벨을 부착하고 실험실 선반의 실온에서 보관하십시오. 차량 용액을 사용하여 약 1 주일 동안 케이지 병을 채웁니다.
   3. 일주일 내내 차량 병을 리필하십시오. 필요에 따라 주 중에 케이지 병을 1x-2x 리필하십시오. 주 중 시작 또는 끝에 신선한 병 1x로 변경합니다.
      참고: 1주일 후 베타-사이클로덱스트린이 물병 안쪽을 코팅하기 시작하여 용액이 흐리게 됩니다.
   4. 일주일에 두 번 소비되는 액체의 양을 모니터링하고 기록합니다. 각 병의 무게와 기록, 어떤 액체를 유출하지 않도록주의. 각 병을 리필하고 반환합니다.
      참고: 5 마우스의 케이지는 3-4 일 안에 80-120 mL의 액체를 마실 것입니다.
3. 먼저 크기 1 L 나사 상단 유리 용기에 수돗물의 750 mL에 베타 사이클로덱스트린의 3.375 g을 용해하여 CORT 솔루션을 확인합니다. 그런 다음 26.25 mg의 코르티코스테론을 추가합니다.
   1. CORT 용액을 초음파 처리하여 CORT를 물에 용해시합니다. 용기를 초음파 청정 수조에 놓습니다. 약 30분 동안 40kHz에서 초음파 처리하거나 코티코스테론이 용해되고 액체가 맑아질 때까지 초음파 처리합니다.
      참고: 초음파 균질화제(팁 스타일)도 CORT용용으로 도용됩니다.
   2. 모든 CORT 케이지에 대한 물병을 솔루션으로 채웁니다. 라벨 용기와 실험실에서 선반에 실온에 보관하십시오. CORT 용액은 약 1 주일 동안 케이지 병을 채우는 데 사용할 수 있습니다.
      참고: CORT가 빛에 민감하기 때문에 갈색 유리 물병이나 플라스틱 불투명 병을 사용하십시오.
   3. 일주일에 두 번 소비되는 액체의 양을 모니터링하고 기록합니다. 모든 차량과 CORT 마우스를 매주 계량하여 각 케이지 내의 마우스 중량과 소비되는 액체를 비교합니다.
   4. 소비된 액체의 부피(mL/g/day)를 확인하려면 다음 방정식을 사용하십시오.
      (지난 3~4일 동안 마신 부피 케이지) / (케이지내 마우스의 평균 체중) 차량 또는 CORT 병이 재충전된 이후의 일 수)
      참고: n=5 성인 남성 C57BL/6J 마우스의 평균 케이지는 평균 0.25 – 0.30 mg/g/day로 소비하며, 이는 일반적으로 광고 리비도 및 음식 박탈 기간 동안 일관성을 유지합니다. 이러한 농도의 대략적인 복용량 귀 착24 mg/kg/day 베타-사이클로덱스트린, 그리고 9.5 mg/kg/일 CORT^15,,16.
4. 사회적 패배 스트레스 (SDS)
   1. 다른 곳에서 깊이에 설명 된 표준 사회적 패배 스트레스 프로토콜을 사용^24,,29.
5. Y-미로 장벽 작업
   1. Y-미로 장벽 작업에 대한 식량 박탈
      1. 사회적 상호 작용 테스트를 완료 한 다음 날, 모든 제어 및 실험 마우스의 무게. 이것은 그들의 자유로운 먹이 체중이 될 것입니다.
         참고: 본명, 우리는 각각의 SDS 및 CORT 패러다임에서 SDS 제어 및 SDS 실험 마우스뿐만 아니라 차량 및 CORT 투여 마우스를 지칭하기 위해 "제어"와 "실험"을 사용합니다.
      2. 음식이 마우스를 박탈하기 위해 각 케이지의 C57BL /6J 측에서 실험실 차우만 제거하십시오.
      3. 모든 마우스의 무게, 뿐만 아니라 매일 주어질 실험실 차우의 양, 제대로 에 체중을 유지하기 위해 90% 테스트 기간 동안 무료 공급 무게의.
         참고: 각 마우스 또는 마우스의 홈 케이지에서 전달되는 음식의 양은 체중 변동과 Y-미로에서의 훈련 또는 테스트의 매일 소비되는 보상 펠릿의 양에 따라 달라집니다.
      4. 보상 펠릿에 익숙해. 20 mg의 곡물 기반 식품 펠릿 (Bio-Serv)을 홈 케이지에 작은 국수로 덤프하십시오. 이것은 펠릿에 익숙하게 설치하고 습관과 초기 훈련 세션에서 Y-미로에서 그들을 소비하는 마우스를 동기를 부여합니다.
6. Y-미로 장치
   1. 불투명한 흰색 3/16" 너비 플렉시글라스의 Y-미로 구조를 구성하고, 길이 26cm, 높이 20cm, 너비 7cm의 3개의 팔을 가진 플렉시글라를 구성합니다.
   2. Y-미로의 슬롯 사이를 미끄러지는 디바이더를 사용하여 연구원이 마우스가 처음 배치되는 시작 상자를 닫거나 마우스를 선택하고 Y-미로의 왼쪽 또는 오른쪽 팔에 입력하면 마우스를 팔에 포함시킬 수 있도록 합니다.
   3. 수직 측에 대한 와이어 메쉬에서 여러 10, 15 및 20cm 높이의 Y-미로 장벽을 만들고, 플렉시글라스는 뒤쪽 각진 면에 약 45° 각도로 만듭니다. 이를 통해 C57BL/6J 마우스는 각 장벽의 수직 와이어 메쉬 측면을 잡고 올라간 다음 장벽의 각진 플렉시글라스 측면을 통과할 수 있습니다.
      1. 각진 측면에 얇은 계단을 추가하여 더 큰 견인력을 허용합니다.
7. Y-미로 습관
   1. 모든 제어 및 실험 마우스를 Y-미로 장치에 습관화합니다.
      1. 음식 박탈 다음날, 50mL 원심분리기 튜브의 캡에 20 mg 곡물 기반 식품 펠릿 (예를 들어, Bio-Serv)의 큰 숫자를 배치하고 Y-미로의 각 팔의 끝에 배치. 이 모자는 마우스를 위한 작은 음식 소켓으로 봉사하고, 마우스는 음식 펠릿을 먹는 것을 쉽게 배울 것입니다.
      2. 시작 상자 디바이더가 있는 Y-미로의 시작 상자에 각 마우스를 놓습니다.
      3. 몇 초 후, 각 마우스가 15 분 동안 Y-미로를 탐험 할 수 있도록 칸막이를 제거합니다. 이 시간의 양은 마우스가 미로의 모든 팔을 적절하게 탐구하고 장치에 익숙해 할 수 있습니다.
         참고: 일부 마우스는 이 첫 번째 습관의 날에 어떤 음식 펠릿도 섭취하지 않을 수 있습니다.
   2. 다음 날, 동일한 절차를 사용하여 두 번째 15 분 Y-미로 습관을 완료합니다.
      1. 어떤 펠릿을 먹지 않은 쥐에 주의하십시오. 이 마우스를 위해, 그들의 홈 케이지에 펠릿의 또 다른 작은 국수를 덤프.
8. Y-미로 강제 선택 교육
   1. 각 마우스에 대해 높은 보상(HR) 및 낮은 보상(LR) 암을 지정합니다.
      1. 제어 및 실험 그룹 모두에 마우스를 임의로 할당하여 좌측 암(HR) 팔과 오른팔을 낮은 보상(LR) 팔로 또는 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 따라서, 4개의 펠릿은 왼쪽, HR 팔 및 2개의 펠릿이 오른쪽, LR 암 또는 그 반대에서 유효할 때마다 유효할 것이다.
      2. 대조군과 실험군 모두에서 지정된 LR 및 HR 암의 균형을 맞추기 위해 각 그룹의 약 절반이 왼쪽 팔을 HR 암으로, 절반은 HR 팔로 오른팔을 가졌다.
   2. 강제 선택 시험
      1. Y-미로 습관의 2 일 다음, 마우스는 강제 선택 훈련의 10 시험의 3 일을 시작합니다.
      2. 각 강제 선택 평가판에 대해 마우스를 시작 상자에 넣고 칸막이를 제거하여 마우스 60s가 왼쪽 또는 오른쪽 팔에 들어가 사용 가능한 펠릿을 사용할 수 있도록 합니다. 각 강제 선택 평가판에 대해 칸막이로 반대 쪽 팔을 차단하여 마우스가 다른 팔을 선택하도록 강요합니다. HR 강제 선택 평가판의 경우 LR 암에 대한 액세스를 차단하거나 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
      3. 시험 후 마우스를 제거하고 먹은 각 펠릿을 보충합니다.
      4. 마우스가 5 HR 및 5 LR 강제 선택 시험을 완료할 수 있도록 각 훈련 일에 걸쳐 각 마우스에 대한 대체 강제 선택 시험.
         참고: 강제 선택 시험은 마우스가 한 쪽 팔을 더 높은 보상과 연결하고 다른 쪽은 더 낮은 보상과 연결하도록 훈련시다.
      5. 마우스를 홈 케이지에 다시 넣은 다음 각 마우스에 대해 5 분 간 간격을 유지하기 위해 3-5 개 이상의 후속 마우스를 실행하지 않습니다.
9. Y-미로 무료 선택 교육
   1. 무료 선택 시험
      1. HR 및 LR 암 강제 선택 평가판으로 각 무료 선택 세션을 시작합니다. 따라서, 마우스는 10 무료 선택 시험을 시작하기 전에 각 팔에 강제로 되는 경험이 있을 것입니다.
      2. 시작 상자에 각 마우스를 놓고 디바이더를 제거합니다. 마우스가 팔을 선택하고 펠릿이 들어 있는 컵이 있는 끝까지 통과하면 팔 칸막이를 그 쪽에 놓고 펠릿을 소모할 때까지 마우스에 잠급니다.
      3. 마우스를 홈 케이지로 다시 제거하고 해당 주기에 사용된 마우스 3-5마우스를 실행하여 5분 간 시험 간 간격을 허용합니다.
   2. 다음 데이터를 기록합니다: 팔, 팔 선택 및 펠릿 컵에 도달하기 위한 대기 시간을 선택합니다.
      1. 마우스가 들어오고 완전히 펠릿 컵으로 통과하는 팔을 기록합니다. 또한 해당 팔을 선택하고 펠릿 컵에 도달하는 대기 시간을 기록합니다.
      2. 마우스가 팔을 선택하지 못하거나 4 또는 2 개의 펠릿을 모두 생략 된 시험으로 사용하지 않는 시험을 고려하십시오.
   3. 70% 무료 선택 기준
      1. 매일 10개의 무료 선택 시험에서 어떤 팔을 선택하지 않는지 기록합니다.
      2. 마우스가 무료 선택 훈련일(기준 70%)에서 10번의 시험 중 7개에서 HR 암을 선택하면 마우스를 장벽 테스트 세션으로 이동합니다.
         참고: 모든 마우스가 70% HR 암 기준에 도달할 때까지 무료 선택 교육을 계속하여 HR 및 LR 암의 적절한 차별을 보장하고 마우스가 HR 암에 대해 동등한 선호도를 입증합니다.
10. Y-미로 장벽 테스트
    1. 10cm 배리어 테스트 세션
       1. 10cm 장벽을 Y-미로에 HR 암 의 중간 아래로 놓습니다.
       2. 두 팔에 대한 여러 강제 선택 시험으로 시작합니다. 장벽을 오르는 데 내성있는 마우스는 길고 얇은 플렉시글라스 조각으로 자극될 수 있습니다.
          참고: 경험상 각 세션이 시작될 때 HR 및 LR 암에 대해 최소 2개의 강제 선택 시험을 새로운 장벽 높이에서 권장합니다. 필요한 경우 마우스가 장벽 위로 올라가도록 유도해야 하는 시험을 기록하는 것이 좋습니다. 마우스는 일반적으로 1-2 시험 안에, 참을 수 없는 이렇게 높지 않은 10 cm 장벽을 위로 올라가는 것을 배웁니다. 장벽은 지정된 HR 팔로 반대 팔을 가진 마우스의 반대편에 배치되어야 합니다.
       3. 각 마우스를 시작 상자에 놓고, 칸막이를 제거하고, 마우스가 미로를 통과하고 HR 암에 10cm 장벽을 포함하는 10개의 무료 선택 시험을 위해 팔을 선택할 수 있도록 합니다.
       4. 마우스가 HR 측을 선택하면 더 큰 보상, 4 개의 펠릿을 얻기 위해 장벽 위로 올라갈 것입니다. 그렇지 않으면, 그것은 LR 팔을 선택하고 단순히 적은 보상, 2 펠릿미의 바닥을 통과합니다.
       5. 선택한 팔을 기록하고, 모든 시험을 위해 팔을 선택하고 펠릿 컵에 도달하는 대기 시간을 기록합니다. 마찬가지로 사이클 당 총 4-6 마우스를 회전, 5 분 시험 간 간격을 유지 합니다.
          참고: Y-미로에 70% 에탄올을 뿌리고 각 마우스 사이에 일관되게 건조를 닦아냅니다.
    2. 15cm 장벽 테스트 세션
       1. 다음 날 에는 위에 나열된 모든 단계(1.10.1 단계)를 완료하지만 HR 암에 15cm 높이의 장벽이 있습니다.
    3. 20cm 장벽 테스트 세션
       1. 다음 날 에는 위에 나열된 모든 단계(1.10.1 단계)를 완료하지만 HR 암에 20cm 높이의 장벽이 있습니다.
          참고: 경험에서, 20cm 장벽 높이에 의해 SDS 의 대다수 취약 또는 CORT 실험 마우스 (심지어 여러 제어 마우스) LR 팔에 그들의 응답을 이동 합니다., 그들은 키가 20 cm 장벽을 통해 올라갈 충분히 동기 부여 되지 않습니다. 또한, 플렉시글라스 어댑터는 마우스가 이 장벽의 상단에서 Y-미로 벽의 가장자리까지 올라가는 것을 방지하기 위해 사용될 필요가 있을 수 있다. 실험자가 각 컵의 펠릿을 리필하고 각 시험 후 마우스를 제거하는 것이 더 어려워지기 때문에 더 높은 Y-미로를 만드는 것이 좋습니다.
    4. 보상 차별 테스트 세션
       1. 제어 및 실험 마우스가 보상 차별의 적절하고 유사한 레버를 모두 표시하도록 하려면 차별 테스트 세션을 실시합니다.
       2. 위의 모든 단계 (단계 1.10.1)를 따르지만 LR 암에 10cm 장벽을 놓습니다. 이제 두 팔 모두 10cm 장벽을 포함하고 있으며, 마우스는 4 또는 2 펠릿 보상을 얻기 위해 위로 올라가야 합니다.
       3. 모든 10번의 시험에서 대기 시간 및 암 선택을 기록합니다.
          참고: 마우스는 보상을 얻기 위해 동일한 노력을 소비해야 하므로 마우스는 대부분의 시험에서 HR 암을 선택해야 합니다. HR 및 LR 암을 선택하기 위해 대기 시간을 검사하려면 각 개별 마우스에 대한 평균 HR 암 대기 시간과 평균 LR 암 대기 시간을 계산합니다. 그런 다음, 대기 시간을 비교하여 양방향 혼합 ANOVA를 사용하여 두 팔을 선택하며, SDS(제어, SDS-취약, SDS-탄력성)를 피험자 간 요인으로, 팔(HR 암, LR 암)을 피험자 내 요인으로 선택한다.

2. 만성 비차별적 사회적 패배 스트레스 (CNSDS)

1. CD-1 마우스에서 공격적인 행동을 위한 화면
   1. 180 s에 대 한 각 CD-1의 홈 케이지에 1 개의 수컷과 하나의 여성 C57BL/6J 마우스를 배치 하거나 CD-1 두 마우스를 공격 할 때까지. 이러한 C57BL6/J 마우스는 순진할 필요가 없으며 추가 실험에서 사용되지 않습니다. 이 가해자 선별 단계 동안, CD-1 마우스와 C57BL/6J 마우스를 공동 수용하지 마십시오.
      1. 각 CD-1에 대해 C57BL/6J 마우스를 모두 공격하기 위한 대기 시간을 기록합니다.
      2. 총 3회 선별 세션 중 60초 이내에 남성과 여성 C57BL/6J 마우스를 공격하는 모든 CD-1 공격자를 선택합니다. 다른 것들은 홈 케이지의 공동 주택에 사용할 수 있습니다.
         참고: 사회적 패배의 중요한 주의사항은 신체적 침략의 결과로 상처가 있다는 것입니다. 스크리닝 및 실험 단계의 각 마우스는 작은 피부 병변이 존재하는 경우 상처를 검사하고 클로로 헥산 소독제로 처리해야합니다. 1cm 이상의 상처를 가진 마우스는 실험에서 제거해야합니다.
2. 제어 및 실험 그룹에 마우스를 할당합니다.
   1. 모든 순진한 성인 남성과 여성 C57BL/6J 마우스를 수집, 뿐만 아니라 검사 은퇴 남성 CD-1 브리더, 뿐만 아니라 CD-1 남성 공동 하우징에 사용.
      1. 무작위로 성인 남성 및 여성 C57BL/6J 마우스를 제어 하거나 실험 조건을 할당. 각 남성과 여성은 CNSDS 실험 그룹의 모든 사회적 패배 세션에 대해 짝을 이룰 것입니다. CNSDS 대조군의 남성과 여성은 매일 회전합니다.
      2. CD-1 남성을 할당하여 사회적 패배 세션에 사용하거나 각 세션 후 실험적인 남성과 여성과 공동 수용할 수 있으며, 이는 C57BL/6J 남성과 여성 마우스의 각 쌍을 매일 번갈아 가며 합니다.
3. 만성 비 차별적 사회적 패배 스트레스 (CNSDS)
   1. 모든 CD-1 남성, CNSDS 제어 남성 및 여성 C57BL/6J 마우스, CNSDS 실험 남성 및 여성 C57BL/6J 마우스를 포함한 모든 마우스를 전용 사회 패배실에 데려올 수 있습니다.
      1. C57BL/6J 남성 및 암컷과 CD-1 케이지를 앞면에 CD-1 케이지와 C57BL/6J 케이지로 정렬합니다.
      2. 마우스가 공격중인 케이지 ID 태그를 표시한 다음 모든 마우스의 조직을 보장하기 위해 CD-1과 공동 보관합니다.
         참고: 첫날 실험을 초기화한 후, 마우스는 남은 9개의 패배 세션동안 회전할 수 있으며, 각 C57BL/6J 남성과 여성 쌍은 각 세션마다 하나의 케이지를 왼쪽으로 회전시다. 이를 통해 모든 세션에서 새로운 CD-1과 새로운 상호 작용을 할 수 있습니다.
   2. CNSDS 실험 그룹 절차
      1. 성인 남성 1명과 성인 여성 C57BL/6J 마우스 1개를 각 CD-1 공격자 남성의 홈 케이지에 넣고 5분 간의 사회적 패배 세션을 진행합니다.
      2. 기록 공격 대기 시간 및 남성과 여성 실험 C57BL/6J 마우스에 대 한 공격의 주파수.
      3. 5 분 후, 남성 C57BL / 6J 마우스를 제거하고 명확하고 천공 플렉시 글라스 장벽으로 분리 된 공동 수용 CD-1 남성의 케이지에 배치합니다. 유사한 명확한, 천공 플렉시 글라스 장벽과 별도의 공격 CD-1 및 여성 C57BL /6J 마우스. 남성 또는 여성 C57BL/6J 마우스가 매일 공격자 CD-1로 수용되는지 여부를 대체합니다.
         참고: 각 마우스는 매일 5분 씩 상호 작용한 후 1cm 미만의 경우 치료된 부상과 상처에 대해 평가됩니다. 1cm 보다 큰 상처는 마우스의 제거 및 즉각적인 안락사를 초래할 것입니다. 따라서, 남성과 여성 실험 마우스는 5일 동안 CD-1 공격자와 공동 수용되며, 나머지 5일 동안 공격 세션에서 사용되지 않는 새로운 CD-1을 가진다. 투명하고 천공된 플렉시글라스 장벽은 물리적 상호 작용을 방지하지만 세션 사이의 24시간 동안 CD-1 공격자와의 감각 접촉을 허용합니다. 질 용암은^이전에설명된 바와 같이 매일 패배 후 약 30분 동안 모든 여성 마우스에서 수행될 수 있다.
   3. CNSDS 제어 그룹 절차
      1. 하나의 제어 남성 C57BL /6J 마우스의 홈 케이지에 하나의 제어 여성을 배치합니다.
      2. 5 분 후, 마우스를 분리하고 마우스 사이에 명확하고 천공 플렉시 글라스 분할을 배치합니다.
      3. 마우스를 콜로니 룸으로 돌려놓고 CNSDS 실험 케이지로 별도의 선반에 놓습니다. 식민지 방에서 우리는 스트레스 마우스가 식민지 방에있는 다른 마우스와 별도로 보관되는 선반을 지정했습니다. 또한, 그(것)들이 일어나는 침략을 목격한 경우에 비 스트레스 마우스에서, 대리사회적 패배 패러다임^30에서 볼 수 있듯이, 효력은 비 스트레스 마우스에서 볼 수 있습니다
      4. 각 제어 상호 작용 중에 공격 또는 장착 동작을 기록합니다.
   4. 대조군 남성과 여성 마우스는 전통적인 사회적 패배 스트레스 조절 그룹에서 수행되는 것과 같이 후속 일에 새로운 동특화에 소개될 것입니다. CNSDS 제어 및 실험 세션의 10일 연속 완료.
      1. ^10th 및 최종 제어 또는 실험 CNSDS 세션을 완료한 후 모든 마우스를 공동 수용하고 모든 행동 테스트를 통해 이 공동 하우징을 유지합니다. 각 케이지는 감각 노출을 허용하기 위해 플렉시 유리 칸막이의 양쪽에 분리된 2개의 마우스로 구성됩니다. 대조군 마우스는 다른 이성 조절 마우스와 함께 수용되며, 실험용 마우스는 이성 실험 마우스와 함께 수용된다.
      2. 각 대조군 C57BL/6J 암컷은^10회 세션에서 상호작용한 제어 C57BL/6J 남성과 공동 으로 수용되며, 두 마우스를 분리하기 위해 케이지에 배치된 투명플시유리 칸막이가 있다.
      3. 최종 패배 세션 후 약 24시간 동안 표준 사회적 상호작용 테스트를 실행하여 CNSDS가 제어에 비해 새로운 CD-1 마우스로 사회적 행동을 감소시키는지 확인하고, 마우스를 "탄력적" 또는 "민감성"으로 계층화하여^{응력(24,29)에29}대해 "탄력적" 또는 "민감성"을 계층화한다.
   5. 테스트 CNSDS 제어 및 Y-미로 장벽 작업을 포함한 다른 행동에 있는 실험적인 남성 및 여성 마우스를 시험하고, CNSDS-탄력성 및 CNSDS-취약한 단으로 CNSDS 단을 계층화합니다.
4. 사회적 상호 작용 테스트
   1. 사회적 상호 작용 테스트를 위한 초기 설정
      1. 최종 CNSDS 패배 세션 후 24 시간, 사회적 상호 작용 테스트를 실시.
      2. CNSDS 패러다임에 사용되지 않는 새로운 CD-1 남성뿐만 아니라 모든 쌍 으로 보관된 제어 및 실험 마우스를 별도의 행동실로 가져가 서 사회적 상호 작용 테스트를 실행합니다.
      3. 전용 컴퓨터에서 실행되는 행동 추적 소프트웨어(예: EthoVision)에 연결된 레코딩 카메라 아래에 표준 오픈 필드 챔버(75cm x 75cm)를 설정합니다.
      4. 24cm x 24cm 사회 상호작용 영역을 둘러싼 상호작용 용기(약 10cm x 10cm x 10cm 크기의 작은 천공 플렉시글라스 컨테이너)로 새로운 실험을 설정하여 2회 연속 2.5분 시험의 두 번째 에서 오픈 필드의 한 벽을 따라 새로운 CD-1을 수용할 수 있습니다. 따라서, 상호작용 영역7cm 폭은 새로운 CD-1 마우스를 수용하는 컨테이너를 둘러싸고 있다.
   2. 사회적 상호 작용 테스트에서 마우스 실행
      1. 각 마우스를 열려 있는 필드의 먼 구석에 놓고 CD-1이 없는 2.5분 평가판에 배치하고 녹화 소프트웨어 프로그램을 시작합니다.
         참고: 상호 작용 컨테이너를 열린 필드의 한 벽중앙에 배치해야 하며 이 첫 번째 평가판에는 CD-1 마우스가 포함되어 있지 않습니다.
      2. 2.5분 후 마우스를 다시 홈 케이지로 제거합니다. 70%의 에탄올로 열린 필드를 청소하십시오.
      3. 소설 CD-1 남성을 열린 필드의 한 벽 의 중간을 따라 두 번째 천공 플렉시 글라스 큐브에 놓습니다.
      4. 다시 말하지만, 이제 CD-1이 있는 두 번째 2.5분 평가판에 대한 열린 필드의 모서리에 마우스를 배치하고 기록 소프트웨어 프로그램을 시작합니다.
      5. 마우스를 제거하고 홈 케이지에 다시 배치합니다. CD-1을 제거하고 홈 케이지에 다시 배치합니다. 70%의 에탄올로 열린 필드를 청소하십시오.
   3. 남은 CNSDS 제어 및 실험 마우스를 실행하고 상호 작용 비율을 계산합니다.
      1. 각 CNSDS 제어 및 실험 마우스에 대한 시험 1 과 예심 2 모두에서 상호 작용 영역에서 소요된 시간을 정량화하기 위해 다른 모든 마우스와 이 절차를 반복하십시오.
      2. 상호 작용 비율을 계산하려면 다음 방정식을 사용하여 평가판 2(CD-1 현재)와 시험 1(CD-1 결석)에서 소셜 상호 작용 영역에서 소요된 시간을 비교합니다.
         상호 작용 비율 = (평가판 2의 상호 작용 영역의 시간)/(평가판 1의 상호 작용 영역의 시간)
   4. "CNSDS-탄력성" 또는 "CNSDS-민감성"으로 마우스를 계층화합니다. 탄력성 마우스의 상호 작용 비율을 가지고 > 1.0, 반면 취약한 마우스의 상호 작용 비율을 가지고 <=1.0.
      1. Y-미로 장벽 작업 또는 기타 행동 테스트와 같은 후속 행동 측정에서 CNSDS 실험 마우스를 이러한 CNSDS-탄력성 및 CNSDS-취약한 표현형으로 세분화합니다.
      2. 따라서 여성의 경우 CNSDS 제어, CNSDS 실험-탄력성 및 CNSDS 실험에 취약한 그룹 간에 단방향 ANOVA를 실시하여 적절한 경우 그룹 간의 차이를 결정하는 후 호크 비교를 수행할 수 있습니다.
      3. 성차 비교를 위해, CNSDS (제어, 탄력, 취약) 및 섹스 (남성, 여성)와 양방향 ANOVAs를 주제 간 요인으로 수행합니다. 적절한 경우 사후 비교를 사용합니다.

결과

만성 CORT는 Y-미로 장벽 훈련 및 테스트(그림 1A)에이어 4 주 동안 투여되었다. 별도의 코호트에서, 10일 SDS 패러다임은 유사하게 Y-미로 장벽작업(도 1C)에서훈련 및 테스트를 거쳐 남성 마우스의 노력 관련 선택 행동에 대한 이러한 만성 스트레스 패러다임의 효과를 결정하였다. 만성 CORT 및 SDS 모두 t-test(표1)에의해 t결정된 차량 마우?...

토론

만성 CORT 패러다임은 식수에서 일정한 CORT 복용량을 제공하지만, 경험에서 마우스에 의해 소비 되는 양에 약간의 가변성이 있을 수 있습니다. 또한, 소비는 전체 케이지에 대해서만 평가될 수 있으며, 케이지내의 마우스 수에 따라 평균적인 채취를 받을 수 있다. 또한, 유출은 병을 계량하거나, 행동 테스트를 위해 마우스를 옮기거나, 신선한 케이지로 변경할 때 발생할 수 있습니다. 그러나 차량 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic Sheet	McMaster Carr	8560K215	Clear, 3/16" thick, 24" X 36"
Beta-cyclodextrin	Sigma-Aldrich	C4767	500 mg
C57BL/6J Mice	Jackson Labs	000664	Adults age 7-8 weeks
Corticosterone	Sigma-Aldrich	C2505 or C27840	100 or 500 mg
Male CD-1 Mice	Charles River	022	"Retired Breeders"
PVC Acrylic Sheet	McMaster Carr	8560K215	White, 3/16" thick, 48" X 48"
Solidstate Ultrasonic Cleaner	Fisher Scientific	FS-28	Must reach 40 kHz
Steel Wire Cloth	McMaster Carr	9219T143	1 ft X 2 ft