זרימת עבודה טומוגרפיה של מערך לרכישה ממוקדת של מידע אודות אמצעי אחסון באמצעות סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים

Summary

אנו מתארים את הכנת רצועות של מקטעים טוריים ואת האוסף שלהם על תמיכה בהעברה גדולה לשימוש כדגימות טומוגרפיה של מערך, יחד עם הליכי הדמיה אוטומטיים במיקרוסקופ אלקטרונים סורק. הפרוטוקול מאפשר סינון, אחזור והדמיה ממוקדת של אירועים מקומיים ונדירים ורכישת אמצעי אחסון גדולים של נתונים.

Abstract

מיקרוסקופיית אלקטרונים מיושמת בביולוגיה וברפואה להדמיה של פרטים תאיים ומבניים ברזולוציית ננומטר. מבחינה היסטורית, מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM) סיפקה תובנה על מבנה תאים, אך בעשור האחרון, הפיתוח של מיקרוסקופים אלקטרונים סריקה מודרניים (SEM) שינה את הדרך להסתכל בתוך התאים. למרות שהרזולוציה של TEM עדיפה כאשר יש צורך בפרטים מבניים ברמת החלבון, רזולוציית SEM מספיקה לרוב השאלות הקשורות לביולוגיה של התא ברמת האברונים. ההתקדמות בטכנולוגיה אפשרה פתרונות אוטומטיים לרכישת נפח כגון הדמיית פנים בלוק טוריות (SBF-SEM) וקרן יון ממוקדת SEM (FIB-SEM). עם זאת, עד היום, שיטות אלה נשארות לא יעילות כאשר הזיהוי וניווט לתחומי עניין הם קריטיים. ללא האמצעים לוקליזציה מדויקת של אזורי יעד לפני ההדמיה, המפעילים צריכים לרכוש הרבה יותר נתונים ממה שהם צריכים (ב- SBF-SEM), או גרוע מכך, להכין רשתות רבות ולצלם את כולם (ב- TEM). אנו מציעים את האסטרטגיה של "סינון לרוחב" באמצעות טומוגרפיה מערך ב- SEM, המאפשרת לוקליזציה של תחומי עניין, ואחריו הדמיה אוטומטית של החלק הרלוונטי של נפח המדגם הכולל. דגימות טומוגרפיה של מערך נשמרות במהלך ההדמיה, וניתן לסדרן בספריות מקטעים המוכנות להדמיה חוזרת. מספר דוגמאות מוצגות שבהן סינון רוחבי מאפשר לנו לנתח פרטים מבניים מאתגרים להפליא לגשת אליהם בכל שיטה אחרת.

Introduction

למרות החשיבות של טכניקות הקשורות ל- EM, המאמץ הנדרש כדי לשלוט בהם שומר על התחום כולו מוגבל למספר קטן של מומחים. קושי משמעותי אחד הוא זיהוי ואחזור של אזור עניין (ROI) בדגימות שנשמרו עבור EM. המראה של אותה מדגם שונה במידה ניכרת כאשר מנותח על ידי מיקרוסקופיה אופטית ולאחר עיבוד לתצפית EM. השינויים עבור דגימות מוכנות כימית כוללים התכווצות מדגם אניזוטרופי לאחר שלבי התייבשות (~ 10% בכל ממד) ואובדן פלואורסצנטיות בעת שימוש אוסמיום בפרוטוקול הקיבעון והכתמת (איור 1A). עבור החלק האולטרה-דק, הדגימות מוטבעות בשרף אפוקסי או אקרילי באמצעות אסטרטגיות שונות(איור 1B). לקבלת תוצאות מוצלחות של הכנה זו, המדגם כולו חייב להיות מחולק לחתיכות שאינן עולות על 1 מ"מ x 1 מ"מ. כדי לעמוד בדרישות התצפית הסטנדרטיות של מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM), חלק זעיר זה של המדגם מחולק עוד יותר לפרוסות בעובי 50-150 ננומטר. התמונות המתקבלות בגווני אפור מציגות ארגון רקמות ומבנה אברונים של שבריר דקה של המדגם כולו בפירוט רב יותר מכל טכניקת מיקרוסקופיה אחרת (איור 1C). ערכת נתונים טיפוסית של TEM מספקת מידע 2D, תיאורטית המוערך כדי להבין את התהליכים המתרחשים באופן טבעי בחלל תלת-ממדי בתאים וברקמות. איור 1D מציג את האתגר של רכישת כרכים אולטרה-מבניים: אם קובייה של צד 1,000 מיקרומטר נקטעת בעובי של 50 ננומטר, יידרשו 20,000 מקטעים כדי לכסות את כל הנפח; עבור קוביה צדדית של 500 מיקרומטר, זה יהיה 10,000 חלקים. כדי לכסות נפח של 50 מיקרומטר x 50 מיקרומטר, ייתכן שיהיה צורך בנפח של 1,000 מקטעים "בלבד". השגת נפח זה באופן ידני היא כמעט בלתי אפשרית ומאתגרת ביותר לביצוע עם אוטומציה. אם בנוסף לעומק המדגם, עלינו לכסות את כל פני השטח של קוביות היפותטיות כאלה, הכיסוי של משטח 1 מיקרומטר² ברזולוציה סבירה הופך לבעיה לוגיסטית חמורה (איור 1E). בעוד שעבור פרויקטים בקנה מידה גדול יוצא דופן, כגון גישות קונטימיקה, מספר גדול של סעיפים הוא קריטי, עבור רוב הפרויקטים EM "שגרתי", יצירת חלקים נוספים הנדרשים לתצפית מהווה חיסרון משמעותי.

ישנן מספר שיטות לרכישת מידע אולטרה-מבני תלת-ממדי: חתך סדרתי של מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM), טומוגרפיה של TEM, טומוגרפיה של מערך (AT), הדמיית פנים בלוק טורית סורקת מיקרוסקופיית אלקטרונים (SBF-SEM) ומיקרוסקופיית אלקטרונים סריקת קרן יון ממוקדת (FIB-SEM). ההבדלים העיקריים בין שיטות אלה הם אסטרטגיית החלוקה והאם רכישת התמונה מצמידה לדור¹סעיף . בחתך טורי TEM, מקטעים רציפים נאספים ברשתות חריץ, תמונות TEM נוצרות מרצפים אלה ומיושרות^2,3,4,5. בטומוגרפיה של TEM, הטיית סדרות מקטעים של 150-300 ננומטר ברשת, וכאשר הם מצדים לחתך סדרתי, ספקו רזולוציה גבוהה מאוד, אם כי כרכים קטנים יחסית^6,7,8. גישת AT משתמשת בחתך פיזי עם נימוסים ידניים וחצי אוטומטיים מגוונים של אוסף מקטעים על תמיכה גדולה יחסית, כגון כיסוי זכוכית, ופלים מסיליקון או קלטת מיוחדת. לרכישת תמונה, התמיכה מנותחת ב- SEM, עם אסטרטגיות רכישת תמונה מגוונות זמינות^{9,10,11,12,13,14,15} . עבור SBF-SEM, חתך פיזי מושג באמצעות מיני מיקרוטום עם סכין יהלום היישר בתוך תא SEM, עם תמונת SEM שנוצרה מפני השטח של בלוק השרף^16,17,18,19. עבור FIB-SEM, מקור היונים מסיר שכבות דקות של המדגם, ואחריו הדמיה אוטומטית של המשטח החשוף על ידי SEM^20,21. TEM-טומוגרפיה ו- AT יוצרים מקטעים פיזיים, שניתן לדמיין מחדש במידת הצורך, בעוד FSBF-SEM ו- FIB-SEM מבטלים את המקטע לאחר ההדמיה. שילוב עדכני של מקטעים פיזיים שצוטטו על ידי SEM מרובה קורות מספק שילוב של שיטות שפותרות את בעיית "צוואר הבקבוק" של מהירות רכישת^{התמונה 22}. כל אחת מהטכניקות הללו חוללה מהפכה באופן שבו ניתן להשיג ולנתח נתוני EM, ולכל גישה יש השפעות מעשיות הקשורות לשאלת מחקר נתונה.

בהתחשב באופי ההכנה ובהיקף הממדים האולטרה-מבניים, אין זה פשוט לחזות היכן ממוקם מבנה יעד ספציפי בבלוק המדגם (איור 1D,E). פתרון אחד עבור לוקליזציה ROI הוא הקלטת התמונות מכל הבלוק ברזולוציה הרצויה מההתחלה. המבנים מעניינים יכולים להיות בנפח הנתונים שנרכש כאשר הם רחוקים מהמיקרוסקופ. זמן הרכישה וטיפול בנתונים המשויכים לאסטרטגיה זו הם בעייתיים. רצוי להפחית את כמות הנתונים המתועדים, במיוחד אם החזר על שוק ההון הם הרבה יותר קטנים מאשר בלוק הרקמה, כלומר, אם האובייקטים של עניין הם סוגים ספציפיים של תאים (לא איברים שלמים). טכניקות מיקרוסקופיות שונות של אור ואלקטרון (CLEM) יכולות להצליח כאשר הפלואורסצנטיות נשמרת ומקומת לפני או אחרי ההכנה באותה מדגם^{23,24,25,26,27,28,29}. עם זאת, מבנים תאיים רבים ניתנים לזיהוי גם ללא מתאם פלואורסצנטיות, רק על סמך המבנה האולטרה ידוע. במקרים אלה, אנו מאמינים כי טומוגרפיה של מערך ההקרנה לרוחב מספקת החלפה מאוזנת בין המאמץ שהושקע בוקליזציה של ROI לבין איכות המידע האולטרה-מבנית. באמצעות אסטרטגיה זו, תת-קבוצה של מקטעים על הוופל נבדקים במרווחי זמן קבועים, אשר ניתן לקבוע בהתבסס על גודלו ואופיו של ROI. לאחר שנמצאים החזרי השקעה, רכישת נתונים מוגדרת בסדרה רציפה של מקטעים שמתחילים לפני ומסתיימות לאחר סעיף העוגן, ואוספים את המידע הרלוונטי באופן ממוקד.

אנו מציגים פרוטוקולים עבור AT המפשטים ומאיצים את רכישת אזורים או אירועים בעלי עניין במקטעים רבים ומניבים נפחי תמונה מיושרים יותר. סינון רוחבי ורכישה מרובתstep מייצרים נתונים ברזולוציה גבוהה מאוד באזורים ממוקדים בדיוק. ההליך שאנו מתארים מטפל במספר אתגרים של רכישת נתונים EM תלת-ממדיים, כפי שהוא מספק: תאימות למגוון רחב של דגימות מבלי לשנות מהיסוד את זרימת העבודה של הכנת המדגם; לוקליזציה ממוקדת עבור רכישות חתך ו- SEM; זמן ומאמץ מופחתים במהלך ההתקנה; הדמיה של אזורים במקטעים מרובים עם יישור טוב יותר של אמצעי האחסון המתקבלים; והליך תפירה ויישור חלק כדי להדר תמונות שונות לתמונת פסיפס תפורה. בחרנו להפגין את עוצמת השיטה שלנו עם מספר דוגמאות מפרויקטים שפורסמו ומתמשכים. אנו מאמינים כי גישה זו יכולה להקל באופן משמעותי על ייצור ורכישה של נתוני EM ממוקדים, גם עבור חוקרים עם ניסיון EM מוגבל.

Protocol

הערה: שיטות הכנה לדוגמה מתוארות במקומות אחרים^14,30,31ואינן מכוסות בפרסום זה. בקיצור, הדוגמאות המוצגות תוקנו כימית עם glutaraldehyde, לאחר קבוע עם 1% OsO₄, ולאחר מכן טופל עם 1% אצטט אורניל מימי לפני הטבעה שרף הטמעה. לחלופין, ניתן להכין דגימות באמצעות הקפאה בלחץ גבוה, להקפיא תחליף עם 0.1% אורניל אצטט אצטון, מוטבע שרף אקרילי. בלוקים לדוגמה הוכנו בשיטת הטבעה שטוחה המאפשרת תצוגה ברורה של המדגם, מה שמקל על הכיוון שלה לחתך (איור 1B).

1. הליך יצירת מערך

1. כיוון וגיזום לדוגמה מוטבעים
   1. באמצעות המשקפת/מיקרוסקופ, זהה וסמן את ההבשלה על משטח הבלוק המוטבע על-ידי גירוד קל של פני השטח של הבלוק עם סכין גילוח. זה יעזור לכוון את המדגם בתוך ultramicrotome ויפחית את משטח החתך.
   2. מהדקים את הדגימה על מחזיק האולטרה-מיקרודום(איור 2A).
   3. חותכים את השרף סביב המדגם, תחילה עם סכין הגילוח (חיתוך גס) וממשיכים בכלי חיתוך היהלום (חיתוך עדין; איור 2א). השתמש בסכינים עם נטייה של 20° או 90° לקצה כדי להבטיח שהמשטחים העליונים והתחתוניים של הבלוק מקבילים לחוד החנית של הסכין.
      הערה: שלב זה הוא קריטי עבור עריכה טורית ורכישה של סרטים ישרים.
   4. מערבבים קסילן ודבק בפרופורציה של 3:1. עם ריס המחובר לקיסם, יש למרוח את התערובת על החלק העליון ועל הקצוות התחתונים של הבלוק החתוך. תן לו להתייבש ביסודיות.
2. הכן את התמיכה בהרכבת המערך A (כלומר, ופלים מסיליקון).
   1. חותכים את חתיכת הוופל באמצעות כלי מחשוף רקיק (EMS), התאמת גודלה ליעד הפרויקט. 2 ס"מ x 4 ס"מ נוח הן תצפיות מיקרוסקופיה אור ואלקטרון.
   2. נקו את הוופל במים מזוקקים כדי להיפטר מהפסולת.
   3. פריקה זוהרת / פלזמה לנקות את פני השטח באמצעות ציוד סטנדרטי. הפרמטרים המדויקים יהיו תלויים במכונה המשמשת. התחל עם הפרמטרים עבור הפרשות הרשתות ולהתאים אמפירית את השעה. שלב זה חיוני להפצה טובה של הסעיפים על התמיכה בזמן שהמקטעים מתייבשים ואין להשמיטם.
3. הכנת התמיכה בהרכבת מערכים B (כלומר, כיסוי זכוכית)
   1. אם אתם מתכננים ניסויים בסימון אימונו מולטיפלקס, העבירו את הדגימות על כיסוי כדי לזהות טוב יותר את אות הפלואורסצנטיות. כדי לשפר את דבקות כיסוי, השתמש בהליך ציפוי ג'לטין מפורט מתואר בעבר⁹.
   2. להגביר את המוליכות על ידי ציפוי השקופיות עם האינדום-פח תחמוצת (ITO) או זהב על ידי אידוי. שמור את כיסויי הכנה בסביבה נקייה. זוהר לפרוק את הדגימות כמתואר ב 1.2.3.

2. חתך המדגם

1. הכנת סכין AT
   הערה: כדי ליצור את המערכים, השתמש בסכין שונה (ATS), שנועד להקל על רכישת סרטים ארוכים. סכיני היסטו-ג'מבו או סכינים דומים שהגה לדור הסעיפים על תמיכות גדולות יכולים לשמש גם לחתך AT.
   1. חברו את המחט לתחתית הסכין באמצעות הסרט הדביק הקצף ונקבו אותה(איור 2B). מניחים את סכין ה-ATS במחזיק האולטרה-מיקרודום ב-0°. כוונן את קצה הסכין במקביל למשטח הבלוק באמצעות ההליך הרגיל.
   2. מביאים את הבלוק החתוך לקצה הסכין בתנוחה מוכנה לחיתוך.
   3. מניחים את הוופל/ מכסה בתוך אגן הסכין וממלאים אותו במים לאותה רמה כמו קצה הסכין. תן לקצה היהלום של הסכין לח כראוי, ובמידת הצורך למשוך מים באמצעות המזרק המצורף(איור 2C).
2. סידור מקטעים והעברה של מערך
   1. הגדר את המיקרוטומיה לפרמטרים הרצויים לחיתוך. עם סכין ATS, טווח של 50-100 ננומטר ומהירות חיתוך של 0.6-1 מ"מ / s מומלץ. התחל חתך (איור 2Di).
   2. השג רצועת כלים באורך שתכסה אמצעי אחסון z ייעודי ותעצור את האוסף. בהתאם לגודל הבלוק, להומוגניות של הרקמה ולסוג השרף, הסרט יהיה ישר יחסית(איור 2D-ii). דגימות רבות לא ייצרו סרטים ישרים, למרות המאמץ המושקע וסוג הסכין משמש.
   3. בהתאם למטרה הסופית, הפוך סרט ארוך אחד או מספר סרטים קצרים מיושרים זה לצד זה. תמיכה של 2 ס"מ על 4 ס"מ יכולה להכיל בנוחות 100 עד 1,000 חלקים. הסידור של רצועת הכלים על שלב התמיכה הוא צעד הדורש מיומנות וידיים יציבות. עם זאת, עקומת הלמידה עבור מיומנות זו נרכשת במהירות.
   4. נתק את הסרט מקצה הסכין באמצעות קצה נקי ולא דביק של ריס המודבק עלהקיסם (איור 2Diii).
   5. בעזרת הריסים, הזז בעדינות את רצועת הכלים מעל מרכז מדיום התמיכה. בשלב זה, השתמש בכלורופורם או עט חימום למתיחת המקטעים במידת הצורך. עם זאת, זכור כי מניפולציה זו עלולה לגרום לשבירת סרט ומעיוות.
   6. התחל לנקז את המים על ידי משיכת המזרק. עבור סרטים עדינים יותר או נסיגה איטית יותר במים, תן למים לטפטף על ידי ניתוק המזרק מהצינור. כאשר מפלס המים יורד לרמת הוופל, שלוט ברצועת הכלים ומיקום מחדש במידת הצורך, על-ידי דחיפת רצועת הכלים בעדינות למרכז. לאחר יישוב הסרטים על משטח הוופל, המשיכו להתנקז עד שהמים הנותרים נסוגים לחלוטין מהאגן.
      הערה: אם לא משתמשים בסכין ATS של נסיגה במים התחתונים, הפחיתו בזהירות את המים מצדי סכין ה- ATS כדי לא לגרום למערבולת.
   7. השאירו את החלקים על התמיכה בתוך האמבטיה כדי לאפשר יבש לחלוטין. בהתאם להידרופוביה של רמת התמיכה והלחות הסביבתית, המים יתאדו בקצב שונה(איור 2Div). חשוב לתת לדגימה להתייבש לאט כדי להפחית או להימנע לחלוטין מכל הקפלים על המדגם.
   8. מעבירים את הדגימה היבשה לקופסה סגורה היטב כדי להגן מפני זיהום לכלוך ומניחים אותה לתנור של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות. במידת הצורך, מקטעי כתם נגדי המשתמשים במתכות כבדות כדי לשפר את הניגודיות הכוללת.
   9. בסוף ההליך, לנקות בזהירות את הסכין בעקבות הוראות היצרן
      הערה: העברת מקטעים מרובים או טוריים על רקיק (איור 2E) בהשוואה להעברה ברשת חריצים (איור 2F) משנה לחלוטין את חוויית ההכנה ל- EM. המקטעים והאיסוף ללא הפרעה של המקטעים בתמיכה יחידה מפחיתים את כמות הטעויות הקשורות לסעיף ואיסוף מקטעים בתדירות גבוהה בסעיפים טוריים. המקבילה של 100 קטעים של 1000 מיקרומטר x 500 מיקרומטר שנאספו על רקיק אחד תואמת ל-33 רשתות חריץ(איור 2G).

3. תצפית לדוגמה

הערה: סעיף זה מתאר את שלביזרימת העבודה כפי שהם מיושמים באמצעות תוכנה זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים ). כל תוכנה לרכישת תמונות בכל SEM המצוידת בגלאים הנכונים יכולה לשמש, עם זאת, פעולות המשתמש הספציפיות יהיו שונות ולעתים קרובות יהיו ידניות יותר.

1. השג מפה כוללת של תמונות SEM החושפת מיקומי מקטעים על הוופל. תמונת מצלמה אופטית מוכללת מסייעת בהגדרת פסיפס תמונת SEM המכסה רצועת כלים של מקטעים או את כל המקטעים. צור את הפסיפס על-ידי לחיצה וגרירה באמצעות העכבר ישירות על תמונת המצלמה של הדוגמה והתחל את הרכישה האוטומטית.
   הערה: הגדרות הדמיה גסות מאוד, כלומר, גודל פיקסל 1-2 מיקרומטר וזמן השתהות של 1 מיקרו μs מספיק. תהליך זה מומחש בחומר משלים (עמודים 2-7).
2. אתר מקטעים באמצעות הפונקציה זיהוי אוטומטי של מאתר המקטעים או אתר אותם באופן ידני. מיקומי מקטעים וקווי מתאר מאוחזרים באופן אוטומטי באמצעות תוכנה זו בהתבסס על התאמת תמונה. להמחשה של תהליך זה, ראה חומר משלים (עמודים 8 – 15).
3. במקרה שתמונות הסקירה הכללית אינן מציגות ROIs בבירור, השג תמונות ברזולוציה גבוהה יותר של מקטעים. השתמש בפונקציה 'תצוגה מקדימה של מקטע' כדי ליצור ולרכוש תמונות באופן אוטומטי. תהליך זה מומחש בחומר משלים, עמודים 16-18. יש לבחור הגדרות הדמיה בהתאם לאופי ולגודל של ה- ROI שהמשתמש מחפש.
   1. כדי למצוא הגדרות אופטימליות, הפעל את הדמיה חיה בתוכנת בקרת המיקרוסקופ ונווט אל עלה על תנאי אחד. שנה הגדרות הדמיה עד שהתמונות יראו ROIs בבירור, אך רכישת התמונה אינה ארוכה מדי.
4. הגדרת אזורי הדמיה
   הערה: מוצעות מספר אסטרטגיות שונות.
   1. אם יש להצטייר רק מקטעים ספורים, השתמש בתמונות של מקטעים שנוצרו עד כה לניווט למקטעים הרלוונטיים והשתמש במציג הניתן להגדלה המציג את כל התמונות שנרכשו במיקומים היחסיים המקוריים שלהם כדי להסתכל על כל המקטעים. לאחר שנמצא מקטע שיש לדמיין ברזולוציה גבוהה, צור אזור הדמיה בלחיצה וגרור. בחר הגדרות הדמיה ברזולוציה גבוהה ואחסן את ההגדרות בתבנית. השתמש מחדש בתבנית זו עבור מקטעים נוספים.
   2. כדי למצוא אירועים קטנים או קשים במיוחד לזיהוי אירועים נדירים, השתמש בגישה של סינון לרוחב. צור באופן ידני אזור הדמיה עם הגדרות הדמיה ברזולוציה גבוהה בכל מקטע עשירי או במקטע אחד לכל רצועת כלים ורכוש את התמונות. סקור את התמונות וסמן מקטעים המכילים את ה- ROI בתוכנה או שרשום הערה.
      1. החל מקטעים המכילים את ה- ROI, נווט קדימה ואחורה דרך ערכת המקטעים וצור אזורי הדמיה ברזולוציה גבוהה באותם מיקומים יחסיים כל עוד המבנה עדיין גלוי במקטע. ניתן לעשות זאת באופן ידני או באמצעות ההליך המתואר בשלבים הבאים.
   3. השג תמונות ביותר מעשרה מקטעים רצופים. לחץ על התחל עידון מיקום לאחר שינוי גודל התצוגה של התמונה כדי להגביר את הדיוק של מיקומי מקטע רשומים כמתואר במדריך. פעולה זו מקטינה את השונות במיקום של סדרות תמונות. ההליך מאויר ומוסבר בעמודים חומריים משלימים 19-21.
   4. לחץ וגרור בכל מקטע כדי להגדיר אזור הדמיה תוך החזקת מקש Alt לחוץ ובחר צור מערך אריחים מהתפריט תלוי ההקשר שנפתח בעת שחרור לחצן העכבר. לאחר מכן התוכנה יוצרת אזורי הדמיה באותו מיקום יחסי בכל המקטעים שנמצאו או סומנו בעבר. ניתן להגביל את ההדמיה לטווח מסוים של מקטעים באמצעות המחוון טווח מקטע.
      הערה: ניתן לחזור על הליך זה עם כל מספר של אזורי הדמיה ולכן מאפשר הקלטת תמונות קטנות רבות ברזולוציה גבוהה במקום להקליט תמונה אחת גדולה יותר בכל מקטע.
   5. לאחר יצירת, הגדר ספירת פיקסלים, גודל פיקסל, פריסת אריחים, זמן השתהות פיקסלים וכו 'בכל סדרת תמונות לפי הצורך. לאחר יצירת וגדרות של סדרות הדמיה, כולן מופיעות בסימן עבודה.
5. קביעת תצורה של פונקציות אוטומטיות והתחלת רכישת תמונות
   1. צור סדרת תמונות נפרדת עבור פונקציות אוטומטיות באותה שיטה כפי שתאר בשלב הקודם. הזז את סידרת התמונה למיקום במקטע המכיל מבנים בעלי ניגודיות גבוהה.
   2. הגדר את סדרת התמונות ל- 1024 x 884 פיקסלים ובחר גודל פיקסל המתאים לרזולוציה הגבוהה ביותר ששימשה בסדרת התמונות שהוגדרה בשלבים הקודמים. ברשימת הפונקציות האוטומטיות, סמן את המוקד האוטומטי ואת הסטיגמה האוטומטית.
   3. בחר לפי מקטע בפקדי רצף הרכישה וודא שתמונת הפונקציות האוטומטיות היא הפריט הראשון ברשימה. התחל את רכישת התמונה על-ידי לחיצה על לחצן הפעל לצד אות המשימה. הליכים אלה מודרים בחומר משלים, עמודים 22-23.
      הערה: אין צורך להתמקד באופן ידני מראש בכל מקטע. במהלך הפעלת ההקלטה, בכל פעם שהמיקרוסקופ מתקדם למקטע חדש, הפונקציות האוטומטיות יבוצעו לפני שכל התמונות האחרות ועלטו במקטע זה.

4. יישור וניתוח נתונים

1. ייצוא נתונים
   1. ודא שהנתונים נשמרים בתבנית .tif, כך שאין צורך בפונקציית ייצוא ייעודית. מיין נתונים למבנה תיקיות המתאים ישירות לשכבות ולרכיבים בעץ השכבות.
   2. לאחר שתועדו פסיפסי תמונה, השתמש בפונקציה StitchAll כדי לתפור באופן אוטומטי את כל האריחים.
2. יישור וחיתוך מחסנית בפיג'י
   הערה. ניתן להשתמש בחבילות תוכנה רבות (בחינם ובמסחריות) כדי לעבוד עם נתוני טומוגרפיה של Array. השלבים שלהלן מוצגים עם תוכנית קוד פתוח פיג'י³² כי הוא זמין באופן נרחב ומכיל את כל הפונקציות הנדרשות.
   1. יבא ערימה של תמונות (או תמונות תפורות) לפיג'י כערימה וירטואלית.
   2. אם יש לנרמל ניגודיות/בהירות, בחר ניגודיות משופרת... מתפריט תהליך. הגדר פיקסלים רוויים ל- 0.1 או פחות, ובדוק את עבד את כל הפרוסות.
   3. מתפריט תוספים, בחרו 'רישום | יישור מחסנית ליניארית עם SIFT.
   4. בחרו 'קשיח' או 'אפין' מהתפריט הנפתח 'המרה צפויה'. אחרת, שמור על הגדרות ברירת המחדל. התחל את היישור על-ידי לחיצה על אישור.
      הערה: טעינת הנתונים כערימה וירטואלית מאפשרת לפיג'י לטפל בערימות בכל גודל. הפלט של היישור נוצר ב- RAM; עם זאת, פעולה זו יכולה להגביל את הגודל המרבי של ערימות שניתן לעבד. במקרה זה, השתמש באפשרות רשום פרוסות מחסנית וירטואלית, שהוא יישום תיקיה לתיקיה של אותו אלגוריתם רישום. לאחר השלמת ההרשמה, טען את נתוני הפלט כערימה וירטואלית.
   5. חתוך את מחסנית התמונות על-ידי לחיצה על חתוך כך שתכיל רק את ה- ROI.
   6. שמור את המחסנית כתמונה .tif בודדת או כסדרה של תמונות .tif.
      הערה: שלבים קריטיים של טומוגרפיה של מערך מוצגים באיור 3.

תוצאות

הדוגמאות שלהלן נועדו להדגים את הרבגוניות של זרימות העבודה המומלצות. האיורים של מקרה מבחן הם פרויקטים שעבורם התקשינו להשיג תוצאות מספקות בכל טכניקה אחרת. בחרנו במבוגר Drosophila כדי להמחיש אתגרים אופייניים שאפשר להיתקל בהם עם סוגים רבים של דגימות. איבר צינורי זה באורך של כ-6 מ"מ, 500-1000 מיקרומטר בחתך רוחב, מחולק לאזורים שונים עם פונקציה ייחודית והרכב תאי (איור 4A)^33. בהתאם לכיוון החתך, מידות פרופיל המעיים ומראהו במקטע משתנים. מקטעים רוחביים או אורך הם גדולים יחסית, ורק זוג יכול להיות ממוקם על רשת TEM אחת (איור 2F). רק חלק קטן של הרקמה ניתן לדמיין ב- FIB, עבור SBF-SEM, הקושי דומה לכל דגימות לא הומוגניות. AT מספקת החלפה יעילה לניתוח של דגימות כאלה והטבעה שטוחה מקלה על לוקליזציה של ROI. חיתוך זהיר של עודף השרף סביב האזור הנבחר(איור 4B)חשוב לאיסוף יעיל של המערכים מהאזור הרלוונטי(איור 4C). ניתן לאסוף מאות חלקים על רקיק בודד ברצף או באקראי(איור 4D). בהתאם לשאלת המחקר, סינון ורכישה לדוגמה ידרשו אסטרטגיה שונה, אשר אנו שרירותיים מחולקים למספר תרחישים. כדי להמחיש תרחישים מוצגים שונים בצורה ממוקדת יותר, בחרנו במספר מקרי בוחן מפרויקט המחקר השונה.

ניתוח של מבנים גדולים רבים שהופצו באקראי 1-10 מיקרומטר טווח (איור 4E)
לעתים קרובות, נתונים אולטרה-מבניים נדרשים לאמת השערה שנבעה ממספר גישות ניסיוניות, תוך השוואת מצב סטנדרטי ושונתה באופן ניסיוני. במקרים אלה, מספר מקטעים נאספים בדרך כלל באופן אקראי ברשתות ומוקרנים כדי להתאים לשפות מקומיות ולדמות את תחומי העניין. טקטיקה זו היא בדרך כלל פחות שיטתית ומוגבלת למספר קטן של קטעים מנותחים. אנו מציעים להקליט סקירות של עשרות / מאות מקטעים ברזולוציה בינונית מסרטן נתון (איור 4D). עבור קטעים טיפוסיים של 70 ננומטר, 200 מקטעים ישתרעו על פני כ 14 מיקרומטר, אשר יכיל תאים רבים, באופן מלא או חלקי, הושלמו בתוך חצי שעה. כצעד הראשון, הסקירה ברזולוציה נמוכה של הסרט כולו נרשמת, והסקירה מסייעת להשמיט את החלקים המציגים חפצי הכנה (לדוגמה, קפלים, לכלוך). לאחר מכן, ניתן לבצע את הרכישה באופן ידני או אוטומטי ישירות בחלקים שנבחרו של המקטע, או במקטע שלם, באמצעות הדמיה בודדת או פסיפסית, ולאחר מכן תפירה (איור 4E). לאחר מכן, ניתן לרכוש תמונות מהאזור שנבחר באמצעות פרמטרים ברזולוציה גבוהה. לדוגמה, מיטוכונדריה, גרעינים ומיקרובילי יכולים להפיק תועלת משיטת שיפור סטטיסטי כזה (איור 4Ei-iii).

ניתוח של מבנים קטנים מרובים, מפוזרים בדלילות 500-1,000 ננומטר טווח (סרט משלים 1)
בתרחיש זה, לא ניתן לזהות את ה- ROI בסריקה כללית בהגדלה נמוכה, ויש צורך בתמונות ברזולוציה גבוהה. בדגימות TEM קונבנציונליות, יש צורך בהגדלה וישורת של הגדלה וישורת של המקטע עד למציאת התכונה הנדרשת. לעתים קרובות, הדמיה מספר מיקומים עצמאיים בדגימות מרובות רלוונטית יותר מבחינה סטטיסטית מאשר יצירת כרך גדול אחד. במקרים כאלה, המורכבות של רכישה ידנית גדלה באופן אקספוננציאלי. למרות שמספר פתרונות TEM מאפשרים רכישות אוטומטיות או סינון של רשתות מרובות, גודל הרשת ואתגרי החתך הסידורי הופכים לעתים קרובות את הגישה לבלתי תואמת עבור דוגמאות רבות. במקרים דומים, אנו יוצרים מפה מלאה ברזולוציה בינונית של ROI כולל בסעיפים מרובים ברזולוציה מספיק כדי לזהות את המבנים של עניין. במהלך שלב סינון רוחבי זה, מומלץ לדלג על מספר חלקים בכל פעם, במטרה לפגוע לפחות בחלק ממבנה העניין כאשר ניגשים אליו באופן אקראי. זה יהיה תלוי במידה רבה בממדים הכוללים של המבנה: למשל, אם הגודל הכולל של המבנה הוא 500 ננומטר וחלקים הם בעובי 50 ננומטר, לפחות תשעה קטעים רציפים ברציפות יכילו ככל הנראה חלק ממבנה העניין. בדרך זו, דילוג של 6-7 חלקים יהיה יעיל למציאת סוגים רבים ושונים של מבנים באזורים מרובים. רכישה אוטומטית של מפות הפסיפס שנפתרו של מקטעים נבחרים מאפשרת סינון זהיר של מקטעים אלה לאחר רכישתם. לאחר רכישת מפה ברזולוציה גבוהה כזו, ניתן לחתוך מספר ROIs או להשתמש בהם כדי להגדיר אזורי הדמיה מקומיים נוספים על ROIs(סרט משלים 1). Golgi, centrioles, צמתים, microtubules, סוגים שונים של שלל הם דוגמאות טובות של המבנים שעשויים להפיק תועלת מתרחיש זה (סרט משלים 1).

ניתוח של ROIs גדול מופץ בדלילות בדגימות גדולות (איורים 4F-4H)
תרחיש זה כרוך באירועים נדירים, המתוארים לעתים קרובות כ"מחט בערימת שחת "שבה הבעיה אינה בזיהוי ROI אלא לוקליזציה שלה. עבור דגימות רבות גישה קורלטיבית אינה אפשרות תקפה, אך לעתים קרובות החזר על ההחזר יש מבנה אולטרה חושפני, וכאשר מקומי, ניתן לזהות עם אמינות גבוהה. עבור דגימות אלה, חיוני ליישם רכישה מדורגת, החל בדגימות מוקרנות מראש עם עשרות עד מאות סעיפים ברזולוציה בינונית. בתוכנה המשמשת כאן, ישנן שתי אסטרטגיות שונות להשגת ערכות תמונה של מקטעים מרובים: הקלטת תמונות התצוגה המקדימה ברזולוציה גבוהה יותר או רכישת ערכת אריחי מערך עם הגדרות מתאימות (איור 4F). סוגי תאים מיוחדים שוניםבמעיים Drosophila מופצים באופן אקראי (למשל גזע, תאים enteroendocrine), וחתך דק בכיוון אקראי. עם זאת, ניתן להבחין ביניהם חזותית לאחר הקרנת התמונות המתקבלות באמצעות פרמטרים ברזולוציה גבוהה ממקטעים בודדים או כאוסף של תמונות סדרתיות (איור 4G). לאחר היישור, ניתן לעבד את הערימות באמצעות פתרונות תוכנה שונים(איור 4H, סרט משלים 2).

תרחיש 1: אורנואידים במעיים (איור 5A)
אורגנואידים הופכים במהירות לאחד הכלים החדשניים ביותר של מדעי החיים המודרניים. מודל איברים כמעט פיזיולוגי זה שמקורו בתאי גזע מתמדים מאפשר מחקר מדויק של מגוון תהליכים ביולוגיים ב-vivo, כולל חידוש רקמות, תגובה לתרופות ורפואה רגנרטיבית. צינורות מיני-מעיים³⁴ שהוצגו לאחרונה פותחים דור חדש של טכנולוגיית אורגנויד, הדומה באופן הדוק לפיזיולוגיה של רקמת vivo, הרכב סוג התא והומיאוסטזיס, ומאפשרים נקודות מבט רחבות למידול מחלות, אינטראקציה בין חיידק מארח וגילוי תרופות. עם זאת, כאשר נדרש אפיון אולטרה-מבני, לוקליזציה של סוגי תאים שונים ברקמה כה גדולה באמצעות דגימות אקראיות יכולה להיות מאתגרת. כמו כן, ב"זיהום " משתנה, חיוני לוודא שהניתוח חושף שלבים התפתחותיים שונים המשפיעים על הרקמה. עבור מחקרים כאלה, כיסוי משמעותי סטטיסטית של המדגם הוא מרכזי, אך קשה להשיג באמצעות הגישה המסורתית של TEM ברשת. AT-scenario 1 מועיל במקרים כאלה: ניתן ליצור מקטעים רציפים רבים על רקיק (איור 5Aii) ולהקרין באמצעות פרמטרים ברזולוציה נמוכה כדי להתאים את האזורים הכלליים של עניין (איור 5Aiii; חצים). ניתן למקד אזורים אלה לניתוח נוסף באמצעות פרמטרי רכישה מתקדמים (איורים 5Aiv ואיור 5Av). כאשר מזוהה מבנה רלוונטי (בדרך כלל אשכול של 5-10 מקטעים פעם אחת בכל 100-300 מקטעים), קל להתרכז בכל אחד ממבני העניין ולרכוש תמונות בודדות באופן ידני או להשתמש בתכונות האוטומציה כדי לרכוש אמצעי אחסון של תמונות על פני מקטעים מרובים.

תרחיש 2: דרוזופילה פופאל נוטום ( איור5B)
לימוד חלוקת התאים והמנגנונים השולטים בהתקדמות דרך מחזור התא חיוני להבנת תהליכים סטנדרטיים ומשתנים באורגניזמים רב-תאיים. מידע שקיים נגזר לעתים קרובות ממערכות חד-תאיות; עם זאת, פתרון זה חסר את ההקשר הקריטי של אינטראקציות 3D בין התאים ברקמה. מונו-שכבתית חד-תאית של הנטום, הגב המתפתח של זחל הדרוזופילה, היא מודל מושלם לאינטראקציה בין תאי האפיתל בכלל לבין חלוקת התא בפרט³⁵. זהו מודל מבוסס למחקרי אינטראקציות מולקולריות ותאיות באמצעות שילוב הנתונים הזמינים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ומניפולציות גנטיות. הימנעות, השלב האחרון של חלוקת התאים, מבטיחה את ההפרדה הסופית בין שני תאים מתחלקים, ואפיון השינויים המבניים המתרחשים במהלך ההימנעות חיוני להבנתנו את המיטוזה. עם זאת, לא קל להתאים את החלוקות המיטוטיות ב-notum ברמה האולטרה-מבנית: התאים גדולים יחסית, בהשוואה לאזור ההימנעות (איור 5B). היחס בין הגודל הכולל של אזור ההימנעות לבין פני השטח של המקטע לכיסוי הוא גדול (איור 5Bi). למרות שניתן למקם את אזור ההימנעות באמצעות שיטות TEM או SBF-SEM³⁶, המשימה היא מייגעת. בתרחיש זה, ניתן להשתמש בתמונות הסקירה האוטומטיות ברזולוציה בינונית של הקפיצות של מקטעים של 20-40 כדי להתאים את התאים המפרידים לשפות שונות (איור 5Bii). כאשר תאים כאלה מזוהים, המקטעים משמשים עוגן לבדיקה מדוקדקת יותר של החלקים בסביבה, וניתן למצוא ונבחר תאים מתחלקים רבים לניתוח נוסף. בדרך זו, ניתן לאתר ולדמות את אזור ההימנעות בשלמותו(איור 5Biii). בהתאם לשאלה, ניתן לאסוף תמונות בודדות ברזולוציה גבוהה או רצפי תמונות של 3-7 כדי לכסות את עומק המבנה (איור 5Biv).

תרחיש 3: נוירונים טנציציט עכבר (איור 5C)
העכבר מספק מודל מבוסס היטב להתפתחות המוח ומתועד היטב ברמות שונות, כולל על ידי EM. למרות ששיטות אוטומטיות שונות של חסימה טורית שימשו בהרחבה לחקר רקמת המוח, ישנם מקרים שבהם AT מותאם טוב יותר לאיסוף הנתונים הדרושים. ההיפותלמוס הוא מודל מדעי המוח מבוסס היטב, חלק במוח המכיל פונקציות סוגים עצביים מרובים. טניצטים היפותלמיים מייצגים תת-קבוצה מסוימת של תאים אפנדימוגליים המרפדים את תחתית החדר השלישי, עם תהליכים ארוכים במיוחד (עד 300 מיקרומטר) וקצה גדול (~ 5 מיקרומטר)³⁷. זה עושה אותם לא נוחים לניתוח על ידי שיטות TEM או FIB. המשימה מסובכת עוד יותר כאשר מספר טנציציטים עצמאיים צריכים להיות מקומיים וניתוח. אחת הגישות כדי להקל על משימה זו יכולה להיות פילוח מתאם למחצה, שבו מפת הפלואורסצנטיות מתקבלת מדגימות שכותרתו פלואורסצנטית לפני תיקון והטבעה עבור EM. החלק מבוצע על האזור שנתפס על ידי שילוב המידע המיקוםי מדגם הפלואורסצנטיות והעתק הפלסטיק המוטמע השטוח. לאחר מכן, ניתן להשתמש בתרחיש AT 3: תמונות פסיפס סקירה ברמה גבוהה נוצרות כדי לחשוף את האזורים עם אשכולות endfeet tanycyte. לאחר מכן, תכונות אוטומציה בתוכנה משמשות כדי להגדיר את רכישת רצפים של התמונות מאזור אחד או כמה בתמונה אחת או במצב אריחים. ניתן לנתח תמונות אלה בנפרד, כערימות מיושרות או מעובדות לאחר מכן.

העוצמה של שיטת AT מאפשרת "שדרוג" יחסית של נתונים מ-2D לתלת-ממד: המפות זמינות מהרכישה העיקרית, וניתן להשיג את הנפחים מהאזור הנבחר וסביבתו. ניתן ליישר את המחסנית המתקבלת ולאחר מכן לעבד אותה. חשוב לקבוע מראש אילו רזולוציות ואיכות תמונה נדרשות כדי למצוא ROIs. הדמיה אמורה לאפשר זיהוי של ROIs, אך לא מעבר לערך זה מכיוון שזמן הרכישה משתנה באופן פרופורציונלי לזמן השתהות הפיקסלים ולריבוע ההופכי של גודל הפיקסלים.

איור 1: אתגרים של הכנת מדגם EM ורכישת נפח. (A)אובדן הפלואורסצנטיות וההתכווצות מתרחשים עקב ריכוז גבוה של מתכות כבדות והתייבשות במהלך הכנת המדגם. (1) ציור סכמטי של דגימה שנצפתה תחת LM (ii) אותה דגימה שהוכנה עבור EM, שהופכת אטומה לחלוטין ומאבדת כ -10% מהנפח שלה. (B)הטבעה לדוגמה נעשית בדרך כלל באמצעות שרף אפוקסי או אקרילי. בלוקים מסורתיים (i) ניתן להשתמש בהצלחה עבור דגימות הומוגניות שאינן דורשות כיוון מסוים. בלוקים שטוחים (ii) מועילים כאשר חיוני למקד ולכוון תחת המיקרוסקופ, אזור מדויק המיועד לחיתוך, למשל, בדגימות לא הומוגניות או בהליכי מיקרוסקופיה קורלטיביים. (C)מכל אמצעי האחסון לדוגמה, רק חלק מוגבל מיוצג במקטע יחיד של 50 ננומטר, ומספק תמונה 2D של דגימת תלת-ממד, לעתים קרובות בכיוון לא מוכר. (D)כדי להמחיש את הבעיה של הקלטת כרכים גדולים מדי לעומת פילוח מדויק, בחרנו שלוש קוביות קונצנטריות עם הפנים של 1000, 500 ו 50 מיקרומטר מאורגנים לכלול מדגם היפותטי 1000 x 500 x 500 מיקרומטר (חום כהה). אם קוביות מדגם היפותטיות כאלה נחתכות ביסודיות עם פרוסות של 50 ננומטר, כדי לכסות את כל הנפח, זה ידרוש סך של 20,000, 10,000 ו-1,000 פרוסות, ו-800 tb, 100 tb ו- 100 gb, בהתאם (רזולוציית הדמיה 5 ננומטר x 5 ננומטר x 50 ננומטר, נתוני 8 סיביות). זה מראה את החשיבות של תכנון רכישת נתונים EM רק כדי לרכוש את הנפח המינימלי הדרוש. (E)כדי לכסות שטח פנים מדגם גדול ברזולוציה גבוהה מציג בעיה דומה לזו של נפח גדול. חלוקת מספר תמונות ברזולוציה גבוהה לאחת היא פתרון מועיל לבעיה כזו. עם זאת, כדי לכסות משטח 1 מ"מ x 1 מ"מ באמצעות מסגרת 2024 x 1048 בהגדלה של פי 10,000 תדרוש מספר עצום של אריחים, אשר יכול להיות מאתגר לתפור. יתר על כן, אם מקטעים נדחסים או מעוותים באופן משתנה במהלך החיתוך, ערימות הנתונים המתקבלות הופכות כמעט בלתי אפשריות ליישר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: זרימת העבודה עבור הדור הישיר של מערכי המקטעים בתמיכה גדולה. (A)לחיתוך הדוק באמצעות כלי החיתוך, בלוקים מאובטחים בתוך מחזיק המיקרוטומיה. שלב זה מסייע להבטיח צדדים מקבילים של בלוק וגם מפחית שרף ריק סביב המדגם. (ב)סכין מותאמת לרכישות מקטעי AT. סירה גדולה מאפשרת את העברת הסעיפים ואת המניפולציה שלהם במהלך חתך מדגם והעברה על התמיכה. אגן גדול מאפשר מניפולציה של הסעיפים; מערכת הניקוז מגבילה את תנועת הסרטים במהלך שלב הניקוז, התחתית השטוחה הופכת ייבוש הדרגתי של התמיכה לאמין. (C)הסכין, מוכנה לחתך עם רקיק זוהר שהונח בתחתית האגן והמים התיישרו עד לקצוות. בניית הסכין שומרת על המחט מוטבעת, מבלי להפריע לתמיכה. (D)יצירת מערך, תצוגה עליונה באזור החלקה של המיקרוטומים. (i) החלקים הראשונים הם בדרך כלל קל להשיג כפי שהם מקל אחד על השני ויוצרים סרט רגיל. (ii) כאשר מקטעים נוספים נוספים לרצועת הכלים, והוא מתארך, רצועת הכלים מאבדת את יציבותה ומעקלת לעתים קרובות. חשוב לשמור על רצועות הרצף מאורגנות ברצף כהכנה לשלב רכישת התמונה. (iii) כאשר רצועה של מקטעים מגיעה לאורך הרצוי, הוא מנותק בזהירות מקצה הסכין באמצעות ריס. (4) מים מנוקזים מהכיור; הוופל נשאר בפנים עד שהוא יבש לחלוטין. שלב זה חיוני, שכן הוא מסייע ליישר את החלקים ולהימנע מהיווצרות קפלי המיקרו. הוופל ממוקם בתנור ב 60 מעלות צלזיוס לפחות 30 דקות כדי לצרף את החלקים על תמיכה. (ה)דוגמה לופלים עם המקטעים שהועברו. למרות שזה נוח להשיג סרטים ישרים ומדויקים, דגימות בפועל למנוע היווצרות של סרטים אידיאליים כאלה ברוב המקרים. עם זאת, אפילו סרטים "מרושלים" הם מאוד אינפורמטיבי עבור מספר עצום של מקרים, ואת החשיבות של הסרט "מסודר" יהיה תלוי באסטרטגיה מחקרית שעבורה הסעיפים נאספים. סרגל קנה מידה 1 ס"מ. (F) רשתות חריץ לדוגמה עם המקטעים הסידוריים. גם כאשר חלקים רבים נאספים על רשת אחת, זה עדיין שבריר זעיר של מה שניתן לאסוף על רקיק אחד. המיומנות הנדרשת כדי לשלוט בהעברת המקטעים ברשת (רשת חריץ בפרט) ייצגה צוואר בקבוק משמעותי לשליטה בהכנת דגימת מיקרוסקופיה אלקטרונית. סרגל קנה מידה 500 מיקרומטר. (G) לא משנה באיזו שיטת איסוף מקטעים נעשה שימוש, נקודות החוזק של גישת AT היא הקלות היחסית של יצירת מקטעים רציפים, בהשוואה לאוסף ברשת. אם נשקלת חסימת דגימה של 1000 מיקרומטר x 500 מיקרומטר, אין בעיה להתאים לסביבות 100 מקטעים על רקיק 2 ס"מ x 4 ס"מ (i). מקטעים באותו גודל ברשת חריץ יתאימו רק לשלושה מקטעים/רשת במקסימום (ii). אנו מספקים תמונה בקנה מידה כדי להראות כמה רשתות עשויות להידרש כדי לכסות את אותו מספר מקטעים, מבלי להזכיר את הקושי באיסוף מקטעים סידוריים ברשת. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: שלבים קריטיים בזרימת העבודה של טומוגרפיה של המערך. סכמטי של זרימת העבודה עבור רכישה ללא התערבות של ערימות תמונות ברזולוציה גבוהה. כל שלבי ההכנה הם אוטומטיים (סמלי הילוכים ירוקים) ואינם דורשים לבצע פעולות באופן ידני, מקטע אחר סעיף. ניתן ליישר ערימות תמונה בכל תוכנה לניתוח תמונה המסוגלת ליישור קשיח או אפיון אוטומטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: שלושה תרחישי רכישה עם הבטן הבוגרת של דרוזופילה כמודל הדגמה. (א)ציור של מידגוט דרוסופילה ניתח, עם שלושה אזורים עיקריים המיועדים בצבעים שונים: הקדמי, האמצעי והאחורי. (B)בלוק שטוח גזוז שבו המעיים מכוונים לחיתוך רוחבי. שים לב כי כמות שרף ריק מאוזן בקפידה סביב הרקמה המכילה את אזור העניין (מלבן לבן). (C)קטעים סדרתיים רוחביים צפים על פני המים בתוך אגן סכין AT. כל התמונות נרכשו במצב SEM אלקטרוני משני באמצעות גלאי המראה עם הניגודיות ההפוכה. (ד)תמונת פסיפס תפורה של קטעים סדרתיים רוחביים על רקיק. סרגל קנה המידה הוא 1000 מיקרומטר.(E)חתך דרך המעיים Drosophila. סרגל קנה מידה 20 מיקרומטר. התמונה היא פסיפס תפור של 7 x 7 תמונות לטווח בינוני. Insets - הגדלה גבוהה יותר ותמונות רזולוציה של אזורי העניין הספציפיים: (ii) גרעין, (iii) גבול מברשת, ו- (i) מיטוכונדריה. סרגל קנה מידה 5 מיקרומטר לכולם. (ו)תמונה לטווח בינוני של מקטע רוחבי דרך המעיים המתמקדת במיקום התאים המתפתחים (ריבוע). סרגל קנה המידה הוא 20 מיקרומטר. (G) המערך הממוקד של מקטעים טוריים שנאספו בהתבסס על האזור המותאמים לשפות אחרים במהלך הניתוח של המקטע הנוכחי בלוח F. סרגל קנה מידה הוא 10 מיקרומטר. (H) דגם 3D מעובד בהתבסס על רצף מחסנית 50 מקטעים המתקבל מהרכישה הטורית הממוקדת בלוח G. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: ניתוחי מקרה עבור תרחישי יישום AT. (A)לוקליזציה של מבני תאים שונים באורגנויד המעי. (i) שבב סיליקון משובץ. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (ii) תמונת פסיפס תפורה של 127 חתך דרך החלק המרכזי של השבב. סרגל קנה מידה = 1500 מיקרומטר (iii) ארבע תמונות ברזולוציה נמוכה של מקטע רוחבי מלא דרך החלק של האורגנויד במעיים. החצים מצביעים על אתר העניין הפוטנציאלי. סרגל קנה המידה הוא 20 מיקרומטר. (iv) ROIs שונים, המיועדים למיקרוגרפים ברזולוציה נמוכה שנבחרו לניתוח נוסף. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (v) תמונה ברזולוציה גבוהה של תא העניין הנגוע. ניתוח של אותו אזור במקטעים הסמוכים יכול לספק מידע תלת-ממדי ממוקד במידת הצורך. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. (B)לוקליזציה של גוף בינוני בדרוסופילה מלנוגאסטר פופל נוטום. (i) מבט סכמטי של גולם Drosophila ניתח. נוטום חשוף לחיתוך (בז ') לאחר הסרת החלק של גוון מגן (חום). הקו השחור מציין את כיוון החתך (ii) חתך רוחב דרך האזור המוצג בדיאגרמה. התמונה משלבת תמונות SEM ברזולוציה גבוהה של 3x7 שנתפרו ברצף ללוח פסיפס אחד. המלבן השחור מפריד את האזור המכיל תא מתחלק. סרגל קנה המידה הוא 15 מיקרומטר. (iii) תמונה מוגדלת בתא המפריד מלוח ii. בהגדלה וברזולוציה זו, גוף האמצע ניכר (חצים לבנים). המקטע כולו מנותח כדי למצוא את התאים המפרידים. קפיצה בין רצועות שונות של מקטעים במרווחי זמן של 20-30 מקטעים במהלך שלב ההקרנה לרוחב מאפשרת למקם זוגות תאים רבים. סרגל קנה המידה הוא 5 מיקרומטר (iv) כאשר תא חלוקה הוא לוקליזציה, תמונות רציפים של גוף האמצע שנאסף מארבעה חלקים סביב גוף האמצע מופרד על ידי ריבוע צהוב בלוח (iii). סרגל קנה המידה הוא 1 מיקרומטר. (C)Tanycytes endfeet לוקליזציה בהיפותלמוס עכבר. (i) תמונת פלואורסצנטיות של פרוסת ויברטום. טנציטים מבטאים חלבון פלואורסצנטי tdTomato (אדום). מלבן לבן תוחם את תחום העניין. סרגל קנה מידה 500 מיקרומטר. (ii) אותו קטע ויברטומה שהוכן עבור EM ייחתך בקפידה סביב תחום העניין בהתבסס על המתאם העקיף של מידע פלואורסצנטי מהלוח (i). הקו הלבן המקווקו מייצג את האזור של חתך דק במיוחד. סרגל קנה המידה הוא 50 מיקרומטר עבור שני הלוחות. (iii) חתך דרך פרוסת הוויברטום באזור העניין. תמונת פסיפס SEM מורכבת מ- 75 תמונות תפורות. מספר מקטעים מיועדים על-ידי סינון רוחבי ומדומים עם פרמטרים דומים. המקטעים מנותחים "לא מקוון" על מנת למצוא את החזר על ההשערות - endfeet tanycyte. המלבן השחור מייצג את האזור המכיל את הקצה הטניציט. סעיף זה ישמש עוגן לניתוח נוסף. סרגל קנה המידה הוא 15 מיקרומטר. (iv) רזולוציה גבוהה, תמונה הגדלה גבוהה של endfeet tanycyte סביב כלי דם. לאחר ההשלמה הראשונית של ה- ROI במקטע אחד, רצף z נאסף מהקטעים הסמוכים במעלה הזרם למקטע העוגן (לוח iii). סרגל קנה מידה 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: בעיות במהלך אולטרה-מיקרוטומיה, איסוף מקטעים ואחסון מקטעים עלולים להוביל לחפצים. (א)מקטעי דגימת מוח על רקיק. רוב השרף הריק מנותק מהרקמה ומקופל על עצמו (ספיה). קופסה שחורה מקווקו מייעדת אזור המשמש להכלת המקטע כולו. סרגל קנה מידה 500 מיקרומטר. (B)קפל מקומי קטן על פני השטח של קטע דגי זברה בעובי 50 ננומטר. סרגל קנה מידה 1 מיקרומטר. (C) סימן סכין על פני השטח של קטע מוח עכבר 70nm. סרגל קנה מידה 5 מיקרומטר. (D)השיער (כוכבית) על פני השטח של הוופל המכסה חלקית קטע שריר של דג זברה. בצהוב, הרקמה מיועדת לניתוח. בוורוד, תא המשמש כהפניה לגודל האזור המושפע. סרגל קנה מידה 50 מיקרומטר. (E) דג זברה notochord עם קמטים בפינה הימנית התחתונה (חצים שחורים), שבו רקמה עצבית צפופה (מוצלל בכחול) גובלת ברקמת שריר רכה יותר ושרף ריק (חצים שחורים). סרגל קנה מידה 10 מיקרומטר. (F) פילוח נפח של ערימה של 50 תמונות כמו ב- E, מראה כי אזור זה הראה קמטים ברוב המקטעים. מצולע מקווקו מתאר את האזור המוצג בסרגל G. Scale 10 מיקרומטר. (G) XY תצוגה של אותו פילוח נפח כמו ב- F, מראה את הקמטים כמו משיכות שחורות קצרות במחצית הימנית של הבלוק. שים לב כי היישור של הערימה בחלקים הנותרים של הרקמה אינו מושפע הקמטים. סרגל קנה מידה 5 מיקרומטר. (H) הקרנת XZ של אותו אזור כמו ב- G, המציגה את הקמטים בכל 50 החלקים. סרגל קנה מידה 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

סרט משלים 1: תמונת מונטאז' ברזולוציה גבוהה של חתך דרך דרוסופילה חוצה אמצע. תמונת פסיפס של תמונת SE-MD SEM הפוכה. 352 אריחי תמונה נפרדים נרכשו באופן אוטומטי ברזולוציה של 5 ננומטר ותפרו כדי להציג את כל החתך. ניתן להגדיל את התצוגה לקבלת פרטים נוספים ולקבל כיסוי ממצה של הנתונים, באמצעות אותה תמונה. צמתים הדוקים, microtubuli, סוגים שונים של שלל יכול להיות בעת התקרבות. סרגל קנה המידה הוא 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.

סרט משלים 2: עיבוד תאי מעיים Drosophila. חמישים תמונות פסיפס מיושרות של החלקים באזור חלוקת תאי המעי. עיבוד IMOD של גבולות התא (כחול, טורקיז וכתום) וגרעינים (לבן). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.

חומרים משלימים. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. 

Discussion

מיקרוסקופיית אלקטרונים נותנת תובנה על המבנה האולטרה-מבני של התאים והאורגניזמים, שעבורם לעתים קרובות רצוי לדמיין מבנים בעלי עניין בהקשר התלת-ממדי שלהם. למרות טקטיקות EM רבות לניתוח אולטרה-מבני, עדיין אין פתרון "תקן זהב". הסיבה העיקרית היא מגוון רחב של דגימות, שאלות ביולוגיות רבות, אשר לעתים קרובות דורשים גישה מותאמת אישית. זרימת העבודה המוצעת של AT נועדה למזער את הזמן הדרוש לעיבוד לדוגמה, רכישת נתונים, הערכה ואחסון. יתר על כן, הסכין שונה מספק כלי מועיל כדי לפשט את רכישת המערך. הפריסה הקומפקטית של מקטעים על ופלים נוחה, הן לתצפית והן לאחסון הבא של הדגימות. סידור זה מאפשר "הקרנה לרוחב" של דוגמאות על-ידי מעבר אופקי מרצועת הכלים לרצועת הכלים וסריקת מקטע אחד בלבד בכל אחת מהן, מה שמקצר באופן משמעותי את הזמן הנדרש כדי להתאים את ההפחתה ל- ROI. תרחישי רכישת נתונים מוצעים מקלים על פילוח אזורים קטנים ומופצים באופן אקראי. לאחר שנמצא, AT/SEM מגביל הדמיה ברזולוציה גבוהה בדיוק לנפח העניין, בין אם בוצע באופן ידני או בעזרת פונקציה אוטומטית. ניתן להשלים את AT עבור אמצעי אחסון מוגבלים באופן ידני, כאשר האופרטור מנווט בין המדגם ומגדיר אזורי הדמיה בזה אחר זה. המודול האוטומטי של התוכנה מספק אסטרטגיית רכישת תמונה גמישה להדמיה של אזורים קטנים בחלקים גדולים. האוטומציה בתוכנה זו מאפשרת הקלטת תמונות גדולות ברזולוציה גבוהה על מאות מקטעים, השגת אמצעי אחסון דומים כמו SBFI. הקלטת תמונות מבט כולל של כל המקטעים מפשטת את לוקליזציה של ROI ומפחיתה את הזמן המושקע במיקרוסקופ. מכיוון שהסעיפים אינם נפגעים במהלך ההקלטה של סקירות ותצוגות מקדימות ברזולוציה גבוהה יותר, AT/SEM מאפשרת שימוש חוזר במדגם כדי לאסוף נתונים נוספים של החזרי שוק חוץ אחרים או ברזולוציה גבוהה יותר.

זמן רכישת תמונה הוא אחד ההיבטים החשובים (והיקרים ביותר) של 3D EM ולכן יש לקחת בחשבון בעיצוב הניסוי. אמנם אין זה מפתיע כי הדמיה אזורים גדולים לוקח יותר זמן מאשר הדמיה אזורים קטנים, קל להעריך את ההשפעה: בהתאם הפרמטרים הדמיה שנבחר, זמן הרכישה על כל סעיף יכול להשתנות משניות לשעות. פרמטרי הדמיה קריטיים כוללים את גודל שדה הראייה, הרזולוציה וזמן ההשתהות. בהנחה שאורוציית יעד של 10 ננומטר לפיקסל וזמן השתהות של 1 מיקרומטר, הדמיה של שדה של 20 מיקרומטר x 20 מיקרומטר, 100 מיקרומטר x100 מיקרומטר, או 500 מיקרומטר x500 מיקרומטר לוקח 4 שניות, 100 שניות או 2,500 שניות להקליט. אנו יכולים להכפיל את זמני ההדמיה לכל מקטע במספר המקטעים כדי להעריך את הזמן הנדרש עבור משימת ההדמיה המלאה. זמני הדמיה ארוכים לכל מקטע יכולים להיות מקובלים אם מספר המקטעים קטן או אם זמן כלי המיקרוסקופ אינו מדאיג.

עם זאת, יש צורך להגביל את זמן ההקלטה לעבודה לילה או עבודה בסוף השבוע ברוב המקרים. היבט קריטי באותה מידה של 3D EM שיש לקחת בחשבון, הוא הסכום והמבנה של נתוני התמונה המתקבלים. הקלטת שדות ההדמיה הנ"ל ב- 100 מקטעים יוצרת 400 mb, 10 gb או 250 gb של נתוני תמונה, בהתאמה; תמונות 500 מיקרומטר x 500 מיקרומטר מציבות את הבעיה הנוספת של להיות גדול מ 2 gb כל אחד. רבות מהתוכנות המשמשות להערכת נתונים אינן יכולות לפתוח תמונות בגודל זה.

כדי לקצר את זמן ההדמיה, חשוב לבחור זמן השתהות פיקסלים כדי לעמוד בדרישות יחס האות לרעש עבור הערכת הנתונים הבאה (לדוגמה, שחזור, מעקב) ולהגביל את ההקלטות להחזרי ROIs מוגדרים. הרחבת AT של התוכנה מאפשרת רכישת תמונה באזורים קטנים במקטעים סדרתיים. התוכנה תומכת בזרימות עבודה ידניות ואוטומטיות ובגרסאות חצי אוטומטיות רבות: ניתן למקם באופן ידני אזורי הדמיה ולהתמקד בכל מקטע, או שהמשתמש יכול להשתמש בתכונות של איתור המקטעים האוטומטי ותכונות יישור המיקום. בהתאם לרמת האוטומציה שנבחרה ונתמכת על-ידי סוג הדגימה או יעדי ההדמיה, הזמן הנדרש להגדרת רכישת תמונה במאות מקטעים יכול להימשך יום עבודה שלם (נעשה באופן ידני) או רק כמה דקות. באופן עקרוני, טומוגרפיה מערך עושה את זה מאתגר יותר מאשר שיטות EM 3D אחרות לרכוש ROIs קטנים; מיקום אזור לא מדויק במקטעים רצופים חייב להיות מתוגמל על-ידי רכישת שטחים גדולים יותר. לדוגמה, אם ה- ROI הוא בגודל של 20 מיקרומטר x 20 מיקרומטר והשונות מיקום מקטע למקטע של שדות הדמיה היא 10μm, יש לרכוש תמונות של 40 מיקרומטר x 40 מיקרומטר כדי לוודא שה- ROI נלכד במלואו בכל תמונה, בכל מקטע. השתנות מיקום התמונה בעולם האמיתי נעה בין 100 מיקרומטר ל-<10 מיקרומטר בהתאם לזמינות או לאיכות של תכונות תוכנה ליישור מיקום או סבלנות המשתמש. עם תוכנה זו, 10 מיקרומטר ניתן להשיג ללא התערבות ידנית רבה מדי ברוב הדגימות.

כמו כל טכניקה, ל- AT יש מספר נקודות תורפה שיכולות להשפיע על רכישת נתונים מוצלחת, ורבות מהן דומות לשיטות אחרות המבוססות על חתך. חוסר התפלגות הומוגנית של שרף ריק לעומת רקמה יכול לגרום מערכים מעוקלים או שבורים. במקרים קיצוניים, מקטעים יכולים להתנתק מהתמיכה (איור 6A). דחיסה משתנה או מתיחות במהלך תהליך החיתוך יכולות ליצור קפלים שיכולים לשבש את המדגם באזורים משתנים במקטעים הבאים(איור 6B). סימני סכין יכולים להופיע על פני השטח של החלקים שנאספו באמצעות סכין פגומה(איור 6C). הבדלים בתנאי החתך עלולים לגרום מדי פעם לדחיסת מקטעים ולהבדלי עובי. חלקיקי אבק או לכלוך יכולים לנחות על קטע ולטשטש חלקית את אזורהעניין (איור 6D). רכישת תמונה עלולה להיכשל עקב ניגודיות אוטומטית לא מושלמת, מיקוד אוטומטי ופונקציות סטיגמה אוטומטיות. המיקום של אזורי הדמיה שנוצרו באופן אוטומטי יכול להיות משתנה ועלול להיכשל בלכידת החזר על ההשתתפות בכל המקטעים.

מספר בעיות יכולות להתעורר בשלב של תפירה ויישור. התפירה האוטומטית של רכישות אריחי פסיפס עלולה להיכשל, למשל, בגלל השטח הריק הגדול בתוך המדגם. עקב שינוי דרסטי בצורת 3D, ערימות תמונה יכול להיות מאתגר להירשם. תוכניות שפותחו במיוחד (למשל, IMOD, פיג'י, TrackEM2, MIB או MAPS-AT) יכולות להקל על יישור חצי אוטומטי^32,38,39,40. ניתן ליישר באופן ידני מקטעים מאתגרים יותר באמצעות תוכנת עריכת תמונות. למרבה הצער, ערכות נתונים מסוימות עשויות להיות בלתי אפשריות ליישר כראוי.

דוגמאות גדולות מאתגרות עבור מקטעים טוריים של TEM המתאימים לרשתות; מצד שני, פרויקטים רבים אינם מצדיקים רכישה אוטומטית ארוכה באמצעות FIB / SEM או SBF-SEM. ה- AT הוא חלופה פשוטה למקטע סידורי מייגע TEM שבו איסוף ומניפולציה של מקטעים סדרתיים על רקיק הם פשוטים יותר מאשר עם רשתות חריץ. פותחו מספר אסטרטגיות כדי להקל על איסוף המערכים, ואנו חולקים את השיטה שלנו להרחבת ארגז הכלים הקיים. במקרים שבהם זיהוי ההשקעה הוא מאתגר, AT-SEM מספק יתרון בסיסי, עם סינון יעיל של הדגימות שבהן נדרשת רזולוציה בקנה מידה של אברונים על פני 50 עד 500 מקטעים. עבור אמצעי אחסון גדולים יותר, ניתן לאסוף ביעילות את אסטרטגיות AT של האיסוף האוטומטי אם נדרשים מקטעים נוספים. ניתן לדמיין מחדש דגימות AT מספר פעמים, מה שמקל על הדמיה ממוקדת של אזורים ברזולוציה גבוהה בהתבסס על תמונות מבט כולל שנרכשו בעבר. אנו מאמינים כי ניתוח ממוקד ודגימה יתר מופחתת על ידי AT / SEM המוצע כאן מקטין את דרישות העבודה ואחסון הנתונים. בסופו של דבר, ניתן לאסוף ולתחזק ספריות של חלקים לשימוש חוזר מאוחר יותר וייעוץ. לרכישת נפח, גישות FIB או SBF-SEM מציעות פתרון מצוין בכל פעם שקל לזהות את ה- ROI על פני הבלוק או אם יש צורך באמצעי אחסון תלת-ממדיים גדולים לניתוח. עם זאת, FIB/SBF-SEM יעילים פחות כאשר יש לאסוף את תמונת המחסנית ברזולוציה גבוהה מהפחתה מוגדרת באופן ממוקד. לסיכום, השיטות המוצעות לסינון דגימות AT והשימוש בתמונות מבט כוללות ברזולוציה בינונית מאפשרים הגבלת רכישת תמונה לחלקים הרלוונטיים של מערך המקטעים. כוונה מדויקת של אזורי הדמיה מאיצה את הזמן לנתונים ומפשטת את הערכת הנתונים.

לסיכום, למרות הרעיון של AT / SEM אינו חדשני, השימוש בו עדיין אינו נפוץ כמו היתרונות שלה היה מציע. בסך הכל, הוא מספק הליך משלים לשיטות EM קיימות אחרות. AT/SEM תואם למגוון הרחב ביותר של פרוטוקולי הכנת מדגם וזרימות עבודה של הדמיה וניתן לבצע זאת בכל מיקרוסקופ FIB/SEM או SBF-SEM כאכניקה נלווית. במאמר זה, התרכזנו AT להקלטת נתונים אולטרה-מבניים מדגימות שפחות סביר שיטופלו בהצלחה בשיטות אחרות. אנו מקווים כי ההליך המתואר לאיסוף נוח של סעיפים ואסטרטגיות רכישה אוטומטיות במידה ניכרת יסייעו בניסיונות הראשונים עבור אלה שמעולם לא נתקלו בשיטה ויסייעו לשכלל אותה עבור אלה שכבר יש להם ניסיון כלשהו.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cutting
AT sectioning knife	Diatome	DUATS3530	Diatome Jumbo knife
Diamond knife for trimming 90°	Diatome	DTB90	Diatome trimming 20° Glass knife
Pattex contact adhesive	Pattex	PCL3C
Silicon wafer	Ted Pella	16015	Resistance: 1-30 Ohms Type P: (Boron) (1 primary flat) Roughness: 2 nm No SiO2 top coating TTV: = <20 µm Wafer is polished on one side
Ultramicrotome	Leica UC6		Alternative: Leica UC7
Wafer cleaving kit	EMS	7642	EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652
Image acquisition
FESEM	Thermo Fischer Helios	1072419	Alternatives: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN
Maps 3 for SEM with Correlative Workflow & Array Tomography	Thermo Fisher Scientific	1135932	Maps provides automation of SEM imaging workflows and allows importing of 3rd party data for CLEM and navigation.
Image analysis
Amira x.y	Thermo Fisher Scientific	1131599	Amira is a 3D data visualization and analysis software with several practical functions for Array Tomography data reconstruction.
Image processing	Open source	Fiji (http://fiji.sc/#download)	IMOD, MIB (See text for refferences)