בידול וניתוח התבגרות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים שמקורם בתאי גזע עצביים

Summary

אנו מתארים את הייצור של תרבויות מעורבות של אסטרוציטים ותאי מבשר אוליגודנדרוציטים הנגזרים מתאי גזע עצביים עובריים או בוגרים המתבדלים לאוליגודנדרוציטים בוגרים, ומודלים במבחנה של גירויים מזיקים. הצימוד עם טכניקת סינון תוכן גבוהה מבוססת תא בונה מערכת סינון סמים אמינה וחזקה.

Abstract

המשוכה העיקרית בפיתוח טכניקות סינון תרופות להערכת היעילות של אסטרטגיות טיפוליות במחלות מורכבות היא איזון בין פישוט במבחנה לבין יצירה מחדש של סביבת vivo המורכבת, יחד עם המטרה העיקרית, המשותפת לכל אסטרטגיות הסינון, של השגת נתונים חזקים ואמינים, הצפויים מאוד לתרגום in vivo.

בתחום המחלות demyelinating, רוב אסטרטגיות סינון התרופה מבוססות על קווי תאים מונצחים או תרבויות טהורות של תאים מקדימים oligodendrocyte ראשוני מבודד (OPCs) מבעלי חיים שזה עתה נולדו, המובילים להטיות חזקות בשל היעדר הבדלים הקשורים לגיל וכל מצב או מורכבות פתולוגיים אמיתיים.

כאן אנו מראים את ההתקנה של מערכת במבחנה שמטרתה מודל ההבחנה הפיזיולוגית / התבגרות של תאי גזע עצביים (NSC) נגזר OPCs, מניפולציה בקלות כדי לחקות תנאים פתולוגיים האופייניים demyelinating מחלות. יתר על כן, השיטה כוללת בידוד ממוחות עובריים ומבוגרים, המעניקה מערכת המבדילה באופן דינמי מ- OPCs לאוליגודנדרוציטים בוגרים (OLs) בתרבות משותפת ספונטנית הכוללת גם אסטרוציטים. מודל זה דומה מבחינה פיזיולוגית המיאלינציה בתיווך הורמון בלוטת התריס ותהליך תיקון המיאלין, המאפשר תוספת של מפריעים פתולוגיים אשר מודל מנגנוני המחלה. אנו מראים כיצד לחקות את שני המרכיבים העיקריים של מחלות demyelinating (כלומר, היפוקסיה / איסכמיה ודלקת), לשחזר את השפעתם על מיאלינציה התפתחותית ותיקון מיאלין למבוגרים ולקחת בחשבון את כל רכיבי התא של המערכת לאורך כל הדרך, תוך התמקדות בהבחנה OPCs.

מודל מעורב ספונטני זה, יחד עם טכנולוגיות סינון בעלות תוכן גבוה המבוססות על תאים, מאפשר פיתוח של מערכת סינון תרופות חזקה ואמינה לאסטרטגיות טיפוליות שמטרתן להילחם בתהליכים הפתולוגיים המעורבים בדמיאלינציה ובזירוז מינלין.

Introduction

במערכת העצבים המרכזית (מערכת העצבים המרכזית), מיאלין יוצר תאים (אוליגודנדרוציטים, OLs) ומבשריהם (תאי מבשרי אוליגודנדרוציטים, OPCs) אחראים על מיאלינציה התפתחותית, תהליך המתרחש בתקופות פרי- ופוסט לידה, ועל מחזור ותיקון מיאלין (remyelination) בבגרות¹. תאים אלה הם מיוחדים מאוד, אינטראקציה אנטומית ותפקודית עם כל שאר הרכיבים גליה נוירונים, מה שהופך אותם לחלק בסיסי של מבנה ותפקוד CNS.

Demyelinating אירועים מעורבים פציעות מערכת חולים שונות ומחלות², ופועלים בעיקר על OPCs ו OLs באמצעות מנגנונים רב-גורמיים, הן במהלך הפיתוח והן בבגרות. המבשרים הלא מובחנים מונעים על ידי גורמים מבדילים, בעיקר הורמון בלוטת התריס (TH), בתהליך מסונכרן³ שמוביל את OPC לזהות ולהגיב לגירויים ספציפיים הגורמים להתפשטות, הגירה לאקסון הלא מיאלין, ובידול ל- OLs בוגר אשר בתורו לפתח את נדן המיאלין⁴. כל התהליכים הללו נשלטים בקפידה ומתרחשים בסביבה מורכבת.

בשל האופי המורכב של מיאלינציה, רמיאלינציה ואירועי demyelination, יש צורך גדול בשיטת במבחנה פשוטה ואמינה ללמוד את המנגנונים הבסיסיים ולפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות, תוך התמקדות בנגן הסלולר העיקרי: OPC⁵.

כדי שמערכת הפריה תהיה אמינה, יש לקחת בחשבון מספר גורמים: המורכבות של הסביבה התאית, הבדלים מהותיים הקשורים לגיל, בידול פיזיולוגי בתיווך TH, מנגנונים פתולוגיים, ואת החוסן של הנתונים⁶. ואכן, הצורך הבלתי ממומש בתחום הוא מודל המחקה את המורכבות של מצב in vivo, שלא הושג בהצלחה באמצעות תרבויות OPC טהורות מבודדות. בנוסף, שני המרכיבים העיקריים של demyelinating אירועים, דלקת היפוקסיה / איסכמיה (HI), ישירות לערב רכיבי תאים אחרים שעשויים להשפיע בעקיפין על ההבחנה הפיזיולוגית וההתבגרות של OPCs, היבט אשר לא ניתן ללמוד במודלים במבחנה פשוטה מדי.

החל ממערכת תרבות חזויה ביותר, האתגר הבא והכלל יותר הוא ייצור נתונים חזקים ואמינים. בהקשר זה, סינון תוכן גבוה מבוסס תא (HCS) היא הטכניקה המתאימה ביותר⁷, שכן המטרה שלנו היא ראשית לנתח את התרבות כולה בזרימת עבודה אוטומטית, הימנעות ההטיה של בחירת שדות מייצגים, ושנית להשיג את הדור האוטומטי ובו זמנית של נתונים מבוססי תוכן גבוה מבוסס הדמיה⁸.

בהתחשב בכך שהצורך העיקרי הוא להשיג את האיזון הטוב ביותר בין פישוט במבחנה לבין מורכבות חיקוי ויוו, כאן אנו מציגים שיטה הניתנת לשחזור גבוהה להשגת OPCs הנגזרים מתאי גזע עצביים (NSCs) המבודדים מהבם החזה העוברי והאזור התת חדרי למבוגרים (SVZ). מודל מבחנה זה מקיף את כל תהליך הבידול של OPC, מ- NSC רב-תכליתי ועד OL בוגר / מיאלינציאלי, באופן פיזיולוגי התלוי ב- TH. התרבות המתקבלת היא מערכת מבדילה/התבגרות דינמית, אשר גורמת לתרבות משותפת ספונטנית המורכבת בעיקר מ- OPCs ואסטרוציטים מבדילים, עם אחוז נמוך של נוירונים. תרבות ראשונית זו מחקה טוב יותר את הסביבה המורכבת של vivo, בעוד נגזרת תאי הגזע שלה מאפשרת לבצע מניפולציות פשוטות כדי להשיג את העשרת שושלת התא הרצויה.

בניגוד לאסטרטגיות אחרות של סינון תרופות באמצעות קווי תאים או תרביות טהורות של OPCs ראשוניים, השיטה המתוארת כאן מאפשרת לחקור את ההשפעה של מפריעים פתולוגיים או מולקולות טיפוליות בסביבה מורכבת, מבלי לאבד את ההתמקדות בסוג התא הרצוי. זרימת העבודה של HCS המתוארת מאפשרת ניתוח של כדאיות התא ומפרט שושלת היוחן, כמו גם מוות תאים ספציפיים לשושלת היוחוס ופרמטרים מורפולוגיים.

Protocol

כל הפרוטוקולים של בעלי החיים המתוארים בזאת בוצעו על פי הנחיות מועצת הקהילה האירופית (86/609/EEC) ועומדים בהנחיות שפורסמו במדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. פתרונות ות reagents

1. הכן בינוני סטנדרטי: DMEM / F12 גלוטמקס 1x; 8 mmol / L HEPES; 100 U/100 מיקרוגרם פניצילין/סטרפטומיצין (1% P/S); 1x B27; 1x N-2.
2. הכן בינוני נוירוספירה: להוסיף 10 ננוגרם / מ"ל bFGF; 10 ng / mL EGF למדיום סטנדרטי.
3. הכן אוליגוספירה / OPC בינוני: להוסיף 10 ng / mL bFGF; 10 ננוגרם ל'/מ"ל PDGF-AA לבינוני סטנדרטי.
4. הכן בינוני בידול אוליגודנדרוציטים: להוסיף 50 nM T3; 10 ננוגרם לונג/מ"ל CNTF; 1x N-אצטיל-L-ציסטאין (NAC) למדיום סטנדרטי.
5. הכן מאגר דיסוציאציה לא אנזימטי: הוסף 1% P/S למאגר דיסוציאציה לא אנזימטי ולשמור על קר כקרח.
6. הכן פתרון סוכרוז: HBSS, סוכרוז 0.3 גרם /mL.
7. הכן פתרון כביסה BSA: EBSS, 40 מ"ג / מ"ל BSA, 0.02 מ"ל / L HEPES.
8. הכן חיץ דיסוציאציה אנזימטי: HBSS, 5.4 מ"ג / מ"ל D-גלוקוז, 15 mmol / L HEPES, 1.33 מ"ג / מ"ל טריפסין, 0.7 מ"ג / מ"ל היאלורונידדאז, 80 U / mL DNase.
9. הכן תערובת ציטוקינים: TGF-β1, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17 ו- IFN-γ (20 ננוגרם / מ"ל כל אחד).
10. הכן רכב מיקס ציטוקינים: 0.04% מהמניות (10% גליסול/100 ננומטר גליצין/25 ננומטר טריס, pH 7.3).
11. הכן בינוני מניעת חמצן גלוקוז: בינוני סטנדרטי באמצעות DMEM w/o גלוקוז. בהתאם למתחמרות של מצב מניעת הגלוקוז הרצוי, ניתן להסיר גם B27 ו/או N2 מהמדיום כדי למנוע תרכובות הקשורות לגלוקוז (למשל, D-גלקטוס ב- B27).

2. ביתיתש ובידוד המל"ל

הערה: NSCs עוברי ומבוגרים היו מבודדים מ E13.5 מוח תחתון עוברי או 2.5 חודשים מבוגר אזור חדר (SVZ), בעקבות פרוטוקול אהלניוס וקוקאיה⁹ עם שינויים.

1. תרבויות המל"ל העוברי
   הערה: לפני תחילת הניתוחים, להכין צינורות 1.5 מ"ל המכילים 150 μL של חוצץ דיסוציאציה לא אנזימטית כל אחד; לנקות את מנות פטרי ולהוסיף HBSS קר כקרח.
   1. לאסוף את העוברים ב E13.5 - 14.5 מעכברים בהריון מתוזמן ומניחים בצלחת פטרי המכילה HBSS קר.
   2. לערוף את ראש העוברים באמצעות מלקחיים.
   3. מניחים את ראשי העוברים בצלחת פטרי נקייה המכילה PBS קר כקרח ומסירים את העור מהגולגולת עם מלקחיים, באמצעות משקפיים מגדילים או סטריאוסקופ.
   4. ברגע שהמוח נראה ומנוקה מהעור, סוחט אותו על ידי הפעלת לחץ בצדדים עם מלקחיים.
   5. הסר את המוח הקטן, לשמור רק את המוח המקודם ולהסיר את קרום המוח עם מלקחיים.
   6. מניחים את הרקמה המבודדת במאגר הניתוק הלא אנזימטי וחוזרים על שלבי הניתוח עם העוברים האחרים. הכנס את הרקמה מ 2-3 בעלי חיים לתוך כל צינור המכיל את המאגר.
   7. דגירה ב 37 °C (55 °F) במשך 15 דקות תחת רעד מתמשך.
   8. לאחר הדגירה, מוסיפים 850 μL של מדיום סטנדרטי ומערבבים על ידי צנרת עד שהמתלים נקיים מגושים.
   9. אם רקמה לא מנותקת עדיין גלויה, המתן 2 דקות ב- RT עד שהוא מפקיד בתחתית הצינור.
   10. כאשר הניתוק הושלם, לספור את התאים צלחת אותם בהשעיה בצפיפות של 10-50 תאים / μL בבקבוק T-25 או T-45 המכיל 10-30 מ"ל של מדיום נוירוספירה, נשמר במצב אנכי כדי למנוע הידבקות תאים.
2. תרבויות המל"ל למבוגרים
   1. להקריב בעלי חיים על ידי נקע צוואר הרחם.
   2. לאסוף מוחות מ 4-5 עכברים בצינור 50 מ"ל המכיל HBSS קר כקרח.
   3. מניחים את המוח על משטח סטרילי קר. למטרה זו, להשתמש בקבוק T-25 מלא במים להציב ב -20 °C (50 °F) לילה. בזמן הניסוי, לכסות את הבקבוק עם רדיד אלומיניום סטרילי.
   4. הנח את צד הגחון של המוח כלפי מטה, בכיוון רוסטרו-caudal, ולהסיר את נורות הריח באמצעות סכין גילוח.
   5. בעזרת סכין גילוח, חותכים 2-3 פרוסות קורונל בעובי 1 מ"מ, מקליפת המוח ועד הצ'יזמה האופטית.
   6. מניחים את הפרוסות על המשטח הקר בתנוחת חדר-דור ומזהים את הקורפוס קאלוסום ואת שני החדרים לרוחב.
   7. באמצעות משקפיים מגדלים או סטריאוסקופ, לבודד את הקירות של החדרים לרוחב, דואג לא לשאת חתיכות של קלוסום קורפוס.
   8. שים את הרקמה המבודדת במאגר דיסוציאציה אנזימטי (5-10 מ"ל) ודגרה ב 37 °C (15 דקות).
   9. מערבבים את הפתרון, צנרת מספר פעמים (לפחות 50), ודגר שוב ב 37 °C (50 °F) במשך 10 דקות.
   10. לנטרל את טריפסין על ידי הוספת 5 מ"ל של בינוני תרבות סטנדרטית ולסנן את הפתרון באמצעות מסנן 70 מיקרומטר.
   11. צנטריפוגה הפתרון המסונן במשך 5 דקות ב 400 x g.
   12. resuspend הכדור בתמיסת סוכרוז וצנטריפוגה במשך 10 דקות ב 500 x g.
   13. יש להזרים את הכדור בתמיסת הכביסה של BSA ואת הצנטריפוגה למשך 7 דקות ב-400 x גרם.
   14. תתקן מחדש את הכדור במדיום התרבות הסטנדרטי, ספר את התאים ובצע ציפוי כמתואר לעיל (בשלב 2.1.10).

3. נוירוספרות ראשוניות

1. הוסף את גורמי הצמיחה (bFGF/EGF) כל יומיים.
2. כל 4-6 ימים (בהתאם לצפיפות התא), לשנות חצי המדיום כדלקמן:
   1. העבר את כל השעיית התא לצינור 15 או 50 מ"ל.
   2. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-400 x גרם.
   3. הסר מחצית מנפח האחסון.
   4. הוסיפו את אותה כמות של מדיום טרי, מערבבים בעדינות על ידי צנרת ומוסיפים גורמי גדילה.

4. אוליגוספירות

הערה: בידול Oligodendrocyte מבוצע בעקבות פרוטוקול^{Chen 10} עם שינויים.

1. כאשר הנוירוספרות מגיעות לקוטר של 100-150 מיקרומטר, הן מוכנות לעבור. כדי לעשות זאת, להעביר את כל השעיית התא לצינור 15 או 50 מ"ל, וצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 400 x גרם.
   1. להעריך במהירות את הקוטר על ידי צילום תמונות של הכדורים באמצעות מיקרוסקופ אור מועבר הפוך ופתיחתם על ידי תוכנת ImageJ.
   2. לחץ על תפריט ניתוח ומהחלון כלים, בחר סרגל קנה מידה.
   3. הגדר 150 מיקרומטר כרוחב במיקרונים והשווה את סרגל קנה המידה עם הכדורים.
2. הסר את כל הנפח על ידי היפוך ו resuspend הכדור ב 180 μL של מדיום תרבות סטנדרטית טרייה. פיפטה 50 פעמים כדי לאפשר פירוק של הספירות.
3. הוסף 810 μL של מדיום תרבית סטנדרטי טרי, לספור את התאים, ולצלחת אותם מחדש כמתואר עבור נוירוספירות.
4. הוסף bFGF/PDGF-AA 10 ננוגרם/מ"ל כל יומיים.
5. כל 4-6 ימים (בהתאם לצפיפות התא), לשנות חצי המדיום כדלקמן:
6. העבר את כל השעיית התא לצינור 15 או 50 מ"ל.
7. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-400 x גרם.
8. הסר מחצית מנפח האחסון.
9. הוסיפו את אותה כמות של מדיום טרי, מערבבים בעדינות על ידי צנרת ומוסיפים גורמי גדילה.

5. ציפוי צלחת

1. ציפוי פולי-די, L-אורניתין/למינין: לפחות יומיים לפני ציפוי OPCs, להוסיף 50 מיקרוגרם / מ"ל פולי-D, פתרון L-ornithine, מדולל PBS, לכל באר (40 μL / well עבור 96-טוב צלחות) ודגרה ב RT לילה.
2. למחרת, להסיר את הנוזל לשטוף שלוש פעמים עם מים סטריליים מזוקקים.
3. תן לצלחות להתייבש ב-RT למשך הלילה. למחרת, להוסיף פתרון למינין מדולל PBS (5 מיקרוגרם / מ"ל; 40 μL / well עבור 96-טוב צלחות) ודגרה עבור 2 שעות ב 37 °C (37 °F).

6. זריעת תאים

1. כאשר האוליגוספירות מגיעות לקוטר של 100-150 מיקרומטר, הן מוכנות לניתוק ולזריעה על הלוחות מצופים פולי-די, L-אורניתין/למינין. כדי לעשות זאת, להעביר את ההשעיה התא כולו לצינור 15 או 50 מ"ל, וצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 400 x g (כפי שצוין בשלב 4.1)
2. הסר את כל הנפח על ידי היפוך ו resuspend הכדור ב 180 μL של מדיום תרבות סטנדרטית טרייה. פיפטה 50 פעמים כדי לאפשר פירוק של הספירות.
3. הוסף 810 μL של מדיום תרבות סטנדרטי טרי וספור את התאים.
4. הסר את פתרון למינין מן בארות צלחת התאים ב 3,000 תא / ס"מ^{2 צפיפות} (100 μL / באר עבור לוחות 96-באר).

7. אינדוקציה של בידול OPC

1. לאחר 3 ימים, להסיר את המדיום כולו ולהוסיף את אותו נפח של מדיום בידול אוליגודנדרוציטים.
2. החליפו חצי מהמדיום כל 4 ימים והוסיפו תערובת בידול טרייה (T3/CNTF/NAC) כל יומיים.

8. אינדוקציה של בלוק בידול בתיווך דלקת

1. לאחר דיסוציאציה נוירוספירה וייצור אוליגוספירה (סעיף 4), להוסיף את תערובת ציטוקינים למדיום התרבות ולשמור על אוליגוספירה חשופה ציטוקינים עבור כל שלב היווצרות כדורים.
   הערה: אמצעי האחסון תלוי במספר התאים, שכן עבור הכדורים היוצרים תאים זרעים ב 10-50 תאים / μL.
2. אם צריך לשנות את המדיום, לשנות את כל הנפח ולהוסיף את תערובת ציטוקינים שוב.

9. אינדוקציה של מוות תאי מניעת חמצן-גלוקוז

1. ב-1 DIV (יומיים לאחר זריעת התא בצלחות רב-וול), מוציאים את המדיום ומשסכים אותו בצלחת רב-וולית חדשה.
2. הוסף מחצית מנפח האחסון (50 μL עבור לוחות 96-well) של OGD-בינוני (קבוצת OGD) או בינוני טרי (קבוצת ביקורת). חצי כמות הנפח משמשת להפחתת חילופי החמצן בין הנוזל לאוויר.
3. מקם את התרבויות הקבוצתיות של OGD בתא היפוקסיה אטום רווי ב-95% N₂ ו-5% CO₂. כדי להשיג רוויה של התא, לתת את תערובת הגז לזרום במשך 6 דקות ב 25 l /min לפני סגירת צינורות התא.
4. לדגור על התא ההיפוקסי באינקובטור במשך 3 שעות. יש להשאיר את קבוצת הביקורת ולוחות המכילים את המדיום שהוסרו ושמורים בשלב 9.1 באינקובטור.
5. הסר את הגלוקוז ללא גלוקוז (קבוצת OGD) או את המדיום החדש (קבוצת הביקורת) והוסף את המדיום שהוסר ושמובטח בשלב 9.1.

10. אימונוציטוכימיה

1. בנקודת הזמן הרצויה, לתקן את התאים עם קר 4% paraformaldehyde במשך 20 דקות ב RT.
2. לשטוף פעמיים עם PBS (10 דקות של דגירה עבור כל לשטוף ב RT).
3. דגירה 1 שעות ב RT עם פתרון חסימה (PBS Triton 0.3% המכיל 1% BSA ו 1% חמור / עז סרום רגיל).
4. דגירה עם תערובת נוגדנים ראשונית(טבלה 1),מדוללת בטריטון PBS 0.3%, לילה ב 4 °C (70 °F).
5. לשטוף פעמיים עם PBS (10 דקות של דגירה עבור כל לשטוף ב RT).
6. דגירה עם נוגדן משני(טבלה 1)פתרון מדולל ב- PBS טריטון 0.3% הוספת Hoechst 33258 במשך 30 דקות ב 37 °C (7 °F).
7. לשטוף פעמיים עם PBS (10 דקות של דגירה עבור כל לשטוף ב RT).

11. ניתוח HCS של כדאיות התא, הרכב שושלת היוחן ומוות תאים ספציפי לשושלת היוחוס

הערה: התמונות וזרימת העבודה המייצגות של HCS מוצגות באיור 2A,B.

1. בחר את אלגוריתם ניתוח ממודר מהתפריט הראשי של התוכנה (HCS Studio v 6.6.0) ובחר סריקה מהתפריט הראשי פיתוח צלחת אסאי /סריקה.
2. בחלון iDev, בחרו 'חדש' ולאחר מכן בחרו 'כלי מדידה בעוצמה כללית' מהתבנית 'פיתוח עוצמה'.
3. לחץ על צור בצד השמאלי של התפריט, בחירת המטרה 10x.
4. פעולה זו תפתח את תפריט קביעת תצורה של רכישה. בחלון זה, בחר את הפרמטרים הבאים: (א) מספר ערוצים: הראשון עבור הכתמת גרעין Hoechst (BGRFR_386) ואחד עבור כל סמן ספציפי לשושלת המשמש בתגובה (ב) לבחור תוכנה להתמקד בערוץ 1 ומרווח מיקוד אוטומטי כמו 1 (ג) לבחור את דגם הלוח מהרשימה.
5. מתפריט הרכישה, הסתכלו על איכות הכתמים בבארות שונות ובתחומים שונים ובחרו ידנית את זמן החשיפה על ידי בחירת זמן חשיפה קבוע בתפריט.
6. לאחר הגדרת הפרמטרים של הרכישות, בחר מיני סריקה בחלק העליון של התפריט ובחר עשרה שדות לבאר בשתי בארות לכל מצב ניסיוני. פעולה זו תאפשר את ההגדרה של כל פרמטר הניתוח בקבוצה משנה של שדות עבור הלוח כולו.
7. כאשר הסריקה המצומצמת מסתיימת, לחץ על הפרמטר קביעת תצורה של Assay כדי להגדיר את האלגוריתם של הניתוח.
8. לחץ על קביעת תצורה של קבוצות בצד השמאלי של החלון וגרור ושחרר את בארות המיני-סריקה. לחץ על לחצן הוסף במקטע המשנה קבוצות כדי לקבוע את תצורת הקבוצות השונות.
9. בצע את זרימת העבודה בצד שמאל של החלון צעד אחר צעד כדי לפתח את האלגוריתם כולו. בחר תחילה תמונת תהליך עבור כל ערוץ ולחץ על הסרת רקע וברמה הרצויה.
10. ראשית לזהות ולבחור את הגרעינים על ידי כתמים גרעיניים. לחץ על זיהוי אובייקט ראשי – ערוץ 1 כדי לבחור את הגרעינים האמיתיים ולהימנע מניתוח חפץ ופסולת. לשם כך, התקרבו לתמונה מייצגת של כתמים גרעיניים ובדקו אם הגרעינים מוקפים היטב בהיקף שנבנה על ידי התוכנה. ניתן לשנות את ערך הסף ולהחיל אלגוריתמי פילוח כדי לזהות טוב יותר גרעינים בודדים.
11. לאחר שהגרעין מוגדר כראוי, לחץ על השלב הבא: אמת אובייקט ראשי. בחר Object.BorderObject.Ch1 כדי להימנע מניתוח גרעינים בגבול כל תמונת שדה. בחר Object.Area.Ch1, ועל-ידי הזזת הפסים "נמוך" ו"גבוה" בהיסטוגרמה, הסר את כל הפסולת המזוהה או האובייקטים הגדולים המתאימים לצבירה או לממצאים.
12. בדוק את כל התמונות המייצגות מיני סריקה של כל תנאי הניסוי כדי להיות בטוח כי הפרמטרים שנבחרו להתאים עם כולם.
13. לחץ על זיהוי כתמים עבור כל ערוץ המתאים לסמני השושלת הספציפיים, ובחר בערכי הטבעת: רוחב = 3 ומרחק = 0. זה יאפשר זיהוי של פלואורסצנטיות ציטופלסמטית. על פי צפיפות התא, ערכים אלה יכולים להיות מותאמים. התוכנה תימנע באופן אוטומטי מההתופפות בין הטבעות הסמוכות.
14. בחר רמות הפניה בזרימת העבודה כדי לבנות את הניתוח. ההגדרה של רמות הייחוס תאפשר ספירה אוטומטית של גרעינים מרוכזים, בהתבסס על גודל הגרעין ועוצמת הכתמים הגרעיניים, ושל תאים חיוביים לסמן ספציפיים, המבוססים על הפלואורסצנטיות הציטופלסמטית שזוהתה על ידי הטבעת.
15. לחץ תחילה על Object.Area.Ch1. בתמונות הסריקה הקטנות, בחר גרעין מרוכז והזז את סרגל ה-"LOW" על ההיסטוגרמה כדי לבחור כ"מרוכז" בכל הגרעינים תחת גודל זה.
16. לחץ על Object.AvgIntensity.Ch1. בתמונות הסריקה הקטנות, בחר גרעין מרוכז והזז את סרגל ה"HIGH" על ההיסטוגרמות כדי לבחור כ"מרוכז "בכל הגרעינים מעל עוצמת הפלואורסצנטיות הזו.
17. לחץ על Object.RingAvgIntensity עבור כל ערוץ של סמנים ספציפיים שושלת. בחר בתמונות הסריקה הקטנות שלך תא חיובי והזז את סרגל "HIGH" על ההיסטוגרמות כדי לבחור כ"חיובי "את כל התאים מעל עוצמת פלואורסצנטיות זו.
18. בדוק את כל התמונות המייצגות מיני סריקה של כל תנאי הניסוי כדי להיות בטוח כי הפרמטרים שנבחרו להתאים עם כולם.
19. בתפריט העליון, בחר אפיון אוכלוסין ובחר אכלוס אירועים.
20. כאירוע מסוג 1, בחר ObjectAreaCh1 ברשימה הימנית ולאחר מכן לחץ על לחצן > וסוף סוף בחר ObjectAvgIntensityCh1. זה יאפשר זיהוי של גרעינים מרוכזים, כשילוב של שטח נמוך ועוצמה גבוהה.
21. באותו חלון, בטלו את הבחירה בכל מגבלות הסריקה.
22. לחץ על בחר תכונות לאחסון בתפריט העליון, כדי לבחור את הפרמטרים שיש לשמור בניתוח.
23. בחר תכונות Well ועבור מהרשימה השמאלית לימין רק את הפרמטרים הרצויים: (א) SelectedObjectCountPErValidField (ב) %EventType1ObjectCount (ג) %High_RingAvgIntensity (עבור כל ערוץ של סמני השושלת הספציפיים).
    הערה: ניתוח זה ייתן לקריאה את המספר הכולל של תאים, את אחוז הגרעינים המרוכזים ואת אחוז התאים החיוביים הספציפיים לשושלת היוחז עבור כל סמן מנותח במספר התא הכולל. אם אחוז השושלת השונות נחוץ רק בתאים חיים, האם ניתן לשמור על הערך "High_RingAvgIntensity" עבור הערוץ (מספר מוחלט של תאים חיוביים) ולחשב מחדש את האחוז על סך מספרי התאים לאחר חיסור אחוז התאים המתים.
    1. לחלופין, ניתן להסיר את התאים המתים מהניתוח הגדרת אותם פרמטרים המשמשים לזיהוי גרעינים מרוכזים (שלבים 11.14– 11.15) באימות הגרעינים (שלב 11.11).
24. בחר צלחת סריקה מהתפריט העליון הראשי ולחץ על סמל הצלחת בתפריט המשנה הגדרת סריקה בחלק העליון כדי לזהות את הבאר שיש לנתח.
25. כתוב את שם הניסוי ואת התיאור ולאחר השלמת כל ההגדרות, הקש על סמל ההפעלה.

תוצאות

השלב הראשון של התרבות עשוי להשתנות משך הזמן, בהתאם לצפיפות הזריעה והאם הספירות הן ממוצא עוברי או מבוגר. יתר על כן, אוליגוספירות מציגות הכפלה מופחתת של האוכלוסייה בהשוואה לנוירוספירות(איור 1B). יתר על כן, ייצור כדורים מרקמות מבוגרות הוא איטי יותר וזה עלול לקחת 2-3 שבועות כדי לי...

Discussion

האופי המורכב של תהליכי מיאלינציה/רמיאלינציה ואירועים דמיאלינטיים הופכים את התפתחותן של מערכות במבחנה לניבוי מאתגרת ביותר. מערכות סינון התרופות במבחנה הנפוצות ביותר הן בעיקר קווי תאים אנושיים או תרביות OL טהורות ראשוניות, עם שימוש גובר בתרבויות משותפות מורכבות יותר או במערכות אורגנוטיפי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plates - untreated	NUNC	267313
B27 supplement (100x)	GIBCO	17504-044
basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	GIBCO	PHG0024
BSA	Sigma-Aldrich	A2153
Ciliary Neurotropic Factor (CNTF)	GIBCO	PHC7015
DMEM w/o glucose	GIBCO	A14430-01
DMEM/F12 GlutaMAX	GIBCO	31331-028
DNase	Sigma-Aldrich	D5025-150KU
EBSS	GIBCO	14155-048
Epidermal Growth Factor (EGF)	GIBCO	PHG6045
HBSS	GIBCO	14170-088
HEPES	GIBCO	15630-056
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3884
IFN-γ	Origene	TP721239
IL-17A	Origene	TP723199
IL-1β	Origene	TP723210
IL-6	Origene	TP723240
laminin	GIBCO	23017-051
N-acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A9165
N2 supplement (50x)	GIBCO	17502-048
Non-enzymatic dissociation buffer	GIBCO	13150-016
PBS	GIBCO	70011-036
Penicillin / Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA)	GIBCO	PHG0035
poly-D,L-ornitine	Sigma-Aldrich	P4957
TGF-β1	Origene	TP720760
TNF-α	Origene	TP723451
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T2752-1G
Trypsin	Sigma-Aldrich	T1426