אוויר-אינפלציה של ריאות מורין עם זילוף וסקולרי-קיבוע

Summary

מוצגת שיטה לאינפלציית אוויר עם זיבולון כלי דם של הריאות המשמרת את מיקום התאים בתוך דרכי הנשימה, alveoli ואינטרסטיום עבור ניתוחים פונקציה מבנה. לחץ קבוע על דרכי הנשימה נשמר עם תא אינפלציה אוויר בעוד קיבוע הוא perfused דרך החדר הימני. הריאות מעובדות למחקרים היסטולוגיים.

Abstract

היסטולוגיה ריאות משמש לעתים קרובות כדי לחקור את התרומות המסופקות על ידי תאי המרחב האווירי במהלך הומאוסטזיס ריאות ופתוגנזה המחלה. עם זאת, שיטות קיבעון מבוססות הטמעה נפוצות יכולות לעקור תאי מרחב אווירי וריר לתוך דרכי הנשימה הסופיות ויכולות לשנות את המורפולוגיה של הרקמות. לשם השוואה, טכניקות קיבוע זלוף כלי דם עדיפים על שימור המיקום והמורפולוגיה של תאים במרחב האווירי ובבטנה הרירית. עם זאת, אם לחץ חיובי על דרכי הנשימה אינו מיושם בו זמנית, אזורים של הריאות עלולים לקרוס ונימים עלולים להתבלט לתוך החללים המכתשיים, מה שמוביל לעיוות של אנטומיה הריאות. להלן, אנו מתארים שיטה זולה לאינפלציית אוויר במהלך זיבולון כלי דם כדי לשמר את המורפולוגיה והמיקום של תאי דרכי הנשימה והמכתש והאינטרסטיום בריאות מורין למחקרים היסטולוגיים במורד הזרם. לחץ אוויר קבוע מועבר לריאות דרך קנה הנשימה מתא אטום ומלא אוויר השומר על לחץ באמצעות עמוד נוזלי מתכוונן בעוד הקיבוטיב מחדיר דרך החדר הימני.

Introduction

היסתולוגיה של ריאות מייצגת את תקן הזהב להערכת ארכיטקטורת הריאות במהלך בריאות ומחלות והיא אחד הכלים הנפוצים ביותר על ידי חוקרי ריאות¹. אחד ההיבטים הקריטיים ביותר של טכניקה זו הוא בידוד ושימור נאותים של רקמת הריאה, שכן שונות בשלב זה יכולה להוביל לאיכות^רקמותירודה ותוצאות שגויות 1^,2,3. בבעלי חיים, נפח הריאות נקבע על ידי האיזון בין רתע אלסטי פנימי של הריאה לבין כוחות חיצוניים המועברים מקיר החזה והסרעפת על ידי מתח פני השטח. בהתאם לכך, כאשר בית החזה נכנס, כוחות חיצוניים הולכים לאיבוד והריאה מתמוטטת. לחלקים היסטולוגיים המוכנים מריאות שקרסו יש מראה צפוף וגבולות בין תאים אנטומיים (כלומר, מרחבים אוויריים, כלי דם ואינטרסטיום) יכולים להיות קשים להבחין. כדי לעקוף את האתגר הזה, החוקרים לעתים קרובות לנפח את הריאות במהלך קיבעון כימי, כך גודל המרחב האווירי ואדריכלות נשמרים.

ריאות יכולות להיות מנופחות עם אוויר או נוזל. הלחץ הדרוש כדי לנפח את הריאות לאותו נפח שונה בין אוויר לאינפלציה נזילה בשל כוחות בין-מולקולריים בממשק נוזלי האוויר. לחץ גבוה יותר (למשל, 25 ס"מ₂O) נדרש במהלך אינפלציית אוויר מאשר אינפלציה נזילה (למשל, 12 ס"מ₂O) כדי להתגבר על מתח פני השטח ולפתוח את alveoli שקרס⁴. לאחר גיוס alveoli, לחץ נמוך יותר יכול לשמור על alveoli פתוח באותו נפח כמו רמות עקומת נפח הלחץ, ולחצים להשוות בכל רחבי הריאה על פי החוק של פסקל^4,5,6,7,8.

קיימות שתי שיטות עיקריות לאינפלציית ריאות וקיבעון כדי לשמר את הריאות המוריניות להיסטולוגיה. בדרך כלל, המרחבים האוויריים מוחדירים בנוזל - לעתים קרובות מכילים קיבעון. היתרון העיקרי של גישה זו הוא שזה קל יחסית ודורש מעט הכשרה. בעוד הטמעה תוך-תאית של קיבעון עשויה להיות מועדפת במחקרים המתמקדים vasculature, נוזל המושרה דרך קנה הנשימה נוטה לדחוף תאים פרוקסימליים דרכי הנשימה mucins לתוך אזורים מרחב אווירי דיסטלי יותר בעוד אינפלציה אווירית לא^{1,3,4,9,10,11}. יתר על כן, ניתוק בשוגג של לויקוציטים מן האפיתל במהלך האינפלציה הנוזלית משנה את המורפולוגיה שלהם, נותן להם מראה פשוט, מעוגל^4,10,11,12. לבסוף, האינפלציה של הריאות עם נוזל יכול לדחוס בשוגג את הביניים^4,10,11. יחד, גורמים אלה יכולים לעוות את האנטומיה הרגילה ואת ההתפלגות התאית בתוך הריאות המשומרות, ובכך להגביל את הטכניקה.

שיטה חלופית לשימור רקמות היא קיבוע זלוף וסקולרי. בשיטה זו, קיבוע הוא perfused לתוך vasculature ריאתי דרך הוועד הנבוב או החדר הימני. שיטה זו משמרת את המיקום והמורפולוגיה של התאים במרחב האווירי לומן. עם זאת, אלא אם כן הריאות מנופחות במהלך זילוף-קיבעון, רקמת הריאה צפויה להתמוטט.

אינפלציית אוויר עם קיבוע זלוף וסקולרי רותמת עוצמות מכל אחת מטכניקות הקיבעון הנ"ל. כאן אנו מספקים פרוטוקול לטכניקה זו. החומרים והציוד הנדרשים זולים יחסית וניתן להשיגם ולהרכיבם בקלות. ההתקנה שהושלמה, המוצגת באיור 1A, מספקת לחץ קבוע בדרכי הנשימה לריאות באמצעות עמוד מתכוונן ומלא נוזלים, בעוד משאבה פריסטלטית מספקת קיבוע דרך החדר הימני. לאחר מכן ניתן לעבד ריאות עם מורפולוגיה משומרת עבור ניתוחים של תפקוד מבנה.

Protocol

כל השיטות המתוארות בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים (IACUC) של בריאות יהודית לאומית.

הערה: הפרוטוקול מאורגן לשלושה רכיבים. המרכיב הראשון מפרט את בניית אינפלציית האוויר עם ציוד זלוף / קיבוע. סעיף שני מתאר כיצד להגדיר את הציוד לניסוי. החלק האחרון מתאר כיצד להכין את החיה ולבצע את הניסוי.

1. בניית מנגנון עמוד המים (איור 1B)

1. הסר את הבוכנה ממזרק קצה החלקה של 60 מ"ל.
2. צרף קלטת סביב המזרק בסימן 30 מ"ל. הגדר את גובה המזרק לסימן זה ללחץ האינפלציה הראשוני של 25 ס"מ₂O. זה גם המקום שבו מפלס המים בעמודה צריך להיות לאורך כל ההליך. סמן את הקלטת כ-"25 ס"מ" (כמתואר באיור 1A)או כ"אינפלציה".
   הערה: לחץ אינפלציה של 25 ס"מ₂O משמש כדי להבטיח גיוס של מרחבים אוויריים שקרסו. לאחר גיוס alveoli, הלחץ יורד ל 20 cmH₂O כדי להבטיח כי המרחבים האוויריים אינם נפיץ.
3. מודדים 5 ס"מ מהסרט לכיוון קצה הבוכנה ומצמידים עוד פיסת סרט למזרק. הזז את המזרק למטה לסימן זה כדי להוריד את לחץ האינפלציה ל 20 ס"מ₂O במהלך קיבעון. סמן את הקלטת כ-"20 ס"מ" (כמתואר באיור 1A)או כ"קיבעון".
4. צרף 180 צינורות פוליוויניל כלוריד (PVC) לקצה החלקה של המזרק. אורך הצינורות תלוי במרחק שבין המזרק לתא האינפלציה האווירית (כ-25-30 ס"מ).
5. הנח טי זכר בסגנון חוט (2) (אורך 1.219 אינץ', גובה 0.904 אינץ', קוטר פנימי של 0.0904 אינץ') בקצה השני של הצינורות. לור זכר זה יתחבר לעצירת תא האינפלציה האווירית (שלב 2.4).

2. בניית תא האינפלציה האווירית (איור 1C)

1. לקדוח שני חורים (כ 4 מ"מ קוטר) במיכל פלסטיק 500 מ"ל עם מכסה בורג על. החורים צריכים להיות באותו גודל כמו Luers הנשי (1.224 אינץ 'אורך, 0.312 אינץ 'גובה, 0.098 אינץ 'קוטר פנימי).
   הערה: ניתן להשתמש במיכלי מדיה או חיץ ריקים עבור תא האינפלציה האווירית.
2. מעיל חוטים של Luers הנשי עם יצרן אטם סיליקון ומניחים את הצד הקטן לתוך החורים שנקדחו מראש של המיכל.
3. מוסיפים יצרן אטמי סיליקון סביב הנקבות הלוהות, שם הן נכנסות למיכל כדי להבטיח אטם אוויר הדוק.
4. בורג על עצירה חד כיוונית על Luer הנשי התחתון בתא אינפלציית האוויר.
5. חותכים צינורות לאורך של כ -25 ס"מ ומצמידים את Luers זכר לקצוות החופשיים של הצינורות. חברו את הלואר הזכר בקצה אחד של הצינורות לנקבת הלואר החינמית בתא האינפלציה האווירית. הזכר השני לולר יתחבר למיכל עיבוד בעלי החיים.

3. בניית מיכל עיבוד בעלי חיים (איור 1D)

1. קודחים חור (בקוטר של כ-4 מ"מ) בצד מיכל פלסטיק גדול. החור צריך להיות הקוטר של הנקבה Luer. מיכל הפלסטיק נדרש כדי לתפוס פתרון קיבוע עודף.
   הערה: נעשה שימוש במיכל אחסון פלסטיק 30 ס"מ x 22 ס"מ.
2. מעיל חוטים של Luer נקבה עם יצרן אטם סיליקון ומניחים את הצד הקטן לתוך החור predrilled של המיכל.
3. מוסיפים את יצרן אטם הסיליקון סביב הנקבה Luer שבו הוא נכנס ויוצא המיכל כדי להבטיח אטם אוויר הדוק.
4. תדפק עצירה חד-כיוונית על הנקבה לאר. צינורות מתא האינפלציה האווירית יתחברו לעצירה הזו.

4. הכנת פתרונות

1. פתרון הפרין
   1. מלאו מיכל ב-PBS והפרין נטולי סידן (20 U/mL). הכן פתרון הפרין בסך הכל של 10 מ"ל עבור כל עכבר. הפרין הוא נוגד קרישה המונע מקרישי דם להיווצר בכלי הדם במהלך זילוף-קיבעון. תמיסת הפרין תשמש לשטיפת דם מהריאות לפני קיבוע זלוף.
2. פתרון קיבועי
   אזהרה: קיבועים יכולים להוות סכנה בריאותית ויש להשתמש בהם במכסה אדים כימי. כל המנגנונים מוגדרים במכסה אדים כימי כדי למנוע שאיפה של קיבעונים.
   1. מלאו מיכל ב-PBS ללא סידן ובפרפורמלדהיד (4% ריכוז סופי). הכן פתרון מתקן בסך הכל של 50 מ"ל עבור כל עכבר.
      הערה: סוג הקיבעון המשמש עשוי להשתנות ויהיה תלוי במחקרים היסטולוגיים במורד הזרם.

5.   הכנת מנגנון זלוף

הערה: משאבה peristaltic מוצעת לאספקת נוזלים לתוך vasculature כדי להבטיח קצב זרימה קבוע. ההוראות הבאות הן להגדרת המשאבה ההיסטלית ועשויה להיות שונה עבור כל דגם. לחלופין, אם משאבה פריסלטית אינה זמינה, ניתן לבנות מנגנון עמוד מים שני כדי להחדיר נוזלים מגובה של 35 ס"מ H₂O.

1. מקום ראשון הצינורות סביב הרכבת הרולר.
2. אבטחו את הצינורות לתוך העמודים החוצוצים.
3. יש להניח את המנופים למקומו על ידי הנחת הידית השמאלית סביב הצינורות והבטחתה במקום עם המנוף העליון ולאחר מכן הידית הימנית.
4. מניחים את הקצה הפרוקסימלי של הצינורות לתוך פתרון הפרין ואת הקצה הדיסטלי לתוך מיכל עיבוד בעלי חיים.
5. טען מראש את פתרון הפרין לתוך הצינורות על ידי הפעלת המשאבה כדי לגרש אוויר מהצינורות.
6. אבטח מחט 25G x 5/8" בקצה הצד השמאלי של הצינורות.

6. הכנת מנגנון אינפלציית אוויר

1. מניחים את המזרק עבור עמוד המים לתוך מחזיק טבעת.
2. מדוד גובה אנכי של 25 ס"מ מפלטפורמת בעלי החיים לסימן הסרט "25 ס"מ" (שלב 1.2) בעמודת המים.
3. חבר את קצה הצינור של עמוד המים לעצירה בתא האוויר.
4. חבר צינור מהנקבת הלואר של תא האוויר לעצירה על מיכל עיבוד בעלי החיים.
   הערה: אם תא אינפלציית האוויר בנוי כמתואר באיור 1C, חיבור צינורות בסדר הפוך עלול לגרום למים לדלוף לתוך הצינורות המתחברים לצינורית קנה הנשימה.
5. ודא כי המכסה לתא האוויר סגור היטב.
6. ודא כי stopcock בצד החיצוני של מיכל עיבוד בעלי חיים סגור ואת stopcock על הצינורות המובילים מעמוד המים לתא אינפלציית האוויר פתוח.
7. ממלאים את המזרק במים עד לסימן "25 ס"מ". מים ישאירו את המזרק דרך הצינורות לתא האוויר. ברגע שהלחץ ישתווה, המים יפסיקו לזרום.
   1. ייתכן כי מים ידלפו לאט לתוך תא אינפלציית האוויר כמו לחץ אוויר הסביבה בתוך מכסה המנוע הכימי משתנה. לפקוח עין על מפלס המים בתוך המזרק ולהוסיף עוד במידת הצורך. לשמור על מפלס המים בסימן "25 ס"מ" לאורך כל ההליך.
      הערה: בדרך כלל מפלס המים יישאר עקבי בחלק הראשון של אינפלציית האוויר ב 25 ס"מ₂O; עם זאת, סביר להניח שיהיה צורך להוסיף יותר מים למזרק במהלך הקיבעון. אם המים לא יפסיקו לזרום, סביר להניח שקיימת דליפת אוויר בתוך תא האינפלציה האווירית. ייתכן שיהיה צורך ליישם יצרנית אטם סיליקון נוספת סביב הלורס כדי למנוע דליפות אוויר.

7. הכנת בעלי חיים (איור 2)

הערה: הליך זה שונה מ Gage et al¹³. סיימנו הליך זה על עכברים בוגרים זכר ונקבה בגילאים שונים ולא לשים לב גיל או הטיית מין.

1. המת חסד את החיה עם נתרן פנטוברביטל (150 מ"ג/ק"ג, תוך-פריטוני.). ודא שהחיה מתה לפני תחילת הניתוח.
   הערה: בעוד הליך זה מבוצע על בעלי חיים מורדמים, הליך זה יכול להתבצע על בעלי חיים חיים כדי לנצל את הלב כדי לשאוב זלוף ברחבי החיה.
2. לעשות שני חתכים לרוחב דרך דופן הבטן. הפוך את החתירה הראשונה מתחת לכלוב הצלעות והשני מעל הירכיים. חותכים לאורך קו האמצע מהחתך הנחות לכיוון החתך העליון.
3. באמצעות מספריים קהים, בזהירות לעשות חתירה לתוך הצד הצדדי של הסרעפת. הריאות אמורות לקרוס ברגע שהסרעפת מנוקבת.
   הערה: יש להקפיד להימנע מנקוב הריאות. ריאה מנוקבת נוטים פחות לנפח בשלבים מאוחרים יותר.
4. חותכים לרוחב לאורך הסרעפת כדי לפתוח את חלל בית החזה.
5. חותכים בצורה מעולה לאורך בעצם החזה מתהליך xiphoid לחרוז הצוואר לרוחב מעל כלוב הצלעות כדי לחשוף באופן מלא את הלב והריאות. להצמיד את הצדדים של בית החזה.
6. לעשות חבטה בקו האמצע בצוואר מעל קנה הנשימה. הסר עור, שריר, בלוטת התריס ורקמת חיבור המקיפים את קנה הנשימה.
7. באמצעות מלקחיים מעוקלים, החלק שתי חתיכות חוט או תפר מתחת קנה הנשימה האחורי. השתמש בחתיכת תפר אחת כדי להחזיק את מתאם האינפלציה Luer-stub במקומו, והשתמש באחר בסופו של דבר כדי לקשור את קנה הנשימה בסיום אינפלציית האוויר ותיקון זלוף כלי הדם.
8. לתקוע חור קטן קנה הנשימה באמצעות מחט 18G x 1" או מספריים קפיציים Vannas.
9. הנח מתאם 20G Luer-stub לתוך החור הזה בקנה הנשימה.
10. לקשור חוט אחד סביב קנה הנשימה מיד distal למקום שבו מתאם Luer-stub נכנס להחזיק אותו במקום.
11. מעבירים את החיה למיכל עיבוד בעלי החיים.
12. חבר את מתאם תבליט הלואר לנקבת הלואר בחלק הפנימי של מיכל העיבוד של בעלי החיים.

8. אינפלציית אוויר, זלוף וקיבעון הריאות (איור 2)

1. מניחים את המחט 25G x 5/8" המחוברת למנגנון זלוף צינורות לתוך החדר הימני של הלב.
2. חותכים את אב העורקים בבטן כדי לאפשר לדם להתנקז מהלב ולקדם את זרימת זלוף דרך הריאות.
3. פתח את stopcock בצד החיצוני של מיכל עיבוד בעלי חיים כדי לנפח את הריאות.
   הערה: ייתכן שייקח זמן עד שהריאות יתנפחו באופן מלא. צפה במפלס המים במזרק, זה לא צריך לרדת במהירות אלא אם כן יש דליפה בריאות.
4. לנפח את הריאות ב 25 ס"מH₂O במשך 5 דקות. אינפלציה של 25 ס"מ 2 O מתנאים מוקדמים לריאה ומסייעת בגיוס אזורי_ריאותאטאלקטטיים.
   הערה: ייתכן שיהיה צורך להוסיף כמות קטנה של מים למזרק כדי לשמור על גובה 25 ס"מ. דלקת ו/או פגיעה ניסיונית בריאה עשויות להשפיע על האינפלציה של הריאות. במקרה זה, ייתכן שיהיה צורך להגביר את לחץ האינפלציה עד למקסימום של 35 ס"מ₂O כדי לסייע בגיוס אזורים atelectatic.
5. במהלך הרגע האחרון של אינפלציית הריאות, הפעל את המשאבה peristaltic לקצב זרימה של 10 מ"ל / דקה. תמיסה הפרין צריך לזרום מהבקבוק דרך הצינורות לתוך החיה.
   1. המטרה של עירוי הפרין היא למנוע היווצרות של תרומבי בכלי הדם. בהתאם, להחדיר הפרין עד הריאות להיות לבן והם נטולי דם. אם הריאות אינן הופכות לבנות, ייתכן שיהיה צורך בהתאמת מחט החדר הימנית.
6. לאחר ניפוח במשך 5 דקות, לכבות את המשאבה peristaltic ולהחליף את צינורות זלוף מפתרון הפרין לקיבוע.
7. הורידו את מזרק עמוד המים לסימן "20 ס"מ" (שלב 1.3). זה נורמלי עבור בועות אוויר לנוע בתוך עמוד המים כמו הלחץ משתנה מ 25 ל 20 cmH₂O.
   1. בדוק את מפלס המים במזרק. זה צריך להיות בסימן "25 ס"מ". ייתכן שיהיה צורך להוסיף עוד בשלב זה.
8. המתן דקה אחת כדי לאפשר לריאות להתנפח מ 25 עד 20 ס"מ₂O.
9. הפעל מחדש את משאבת זלוף בקצב זרימה של 6.5 מ"ל / דקה.
10. תיקון זלוף כלי דם במשך 10 - 15 דקות.

9. הפקת ריאות (איור 3)

1. קשרו בחוזקה את פיסת החוט השנייה סביב דיסטל קנה הנשימה למתאם ה-Luer-stub. הסר את מתאם תבליט Luer מ קנה הנשימה.
2. הסר את המחט מהלב.
3. לשחרר את הריאות והלב מחלל בית החזה על ידי חיתוך רקמת החיבור האחורית למדיסטינום עם מספריים קהים. יש להצטמר מנקב את הריאות.
4. הסר בזהירות את הלב מהריאות.
5. מניחים את הריאות בתיקון בן לילה.
   הערה: משך הקיבוינטטיבי משתנה תלוי במחקרים היסטולוגיים במורד הזרם.
   1. מניחים את הריאות לתוך צינור חרוט 50 מ"ל המכיל 20-25 מ"ל של קיבוע. מניחים את החוט המאבטח את קנה הנשימה דרך פתח הצינור החרוט ומאובטח על ידי החוטים של הכובע. הפוך את הצינור החרוט כדי להבטיח כי ריאות מצופות, מנופח אוויר להישאר שקוע לחלוטין קיבוע אחרת הם יצופו לחלק העליון של הנוזל.
6. לעבד את הריאות למחקרים היסטולוגיים.

תוצאות

בבית החזה שלם, הריאות מוחזקות פתוחות על ידי כוחות חיצוניים המופעלים על ידי דופן החזה דרך חלל pleural^6,14. כאשר נכנסים לסרעפת במהלך הניתוק, שלמות החלל הפלורלי מתבטלת והריאות אמורות לקרוס(איור 2A, 2B). כדי להרחיב מחדש את הריאות, אינפלציית האו?...

Discussion

למרות שנעשה שימוש נפוץ, שיטות קיבעון מבוססות פנים-אופן לעקור לויקוציטים מדרכי הנשימה והוא יכול לשנות את ארכיטקטורת הריאות הרגילה. השיטה של אינפלציית אוויר עם זיבולון כלי דם המסופק בפרוטוקול זה מתגברת על מלכודות אלה ושומרת בצורה מדויקת יותר על אנטומיה של הריאות. המפתחות להשגת רקמות באיכו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer	Cole-Parmer	Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF	Stopcock
BD 60 mL syringe, slip tip	BD	309654	Syringe used to construct the water column
BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8	BD Biosciences	305122	Needle for vascular perfusion/fixation
Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer	Nordson Medical	FTLLBMLRL-1	Female Luer
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3393	Heparin solution.
Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge	BD Biosciences	427564	Luer-Stub Adapter
Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee	Nordson Medical	LT787-9	Male Luer
Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing	ThermoFisher Scientific	8000-9020	Tubing
Paraformaldehyde Aqueous Solution - 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline
Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker	Permatex	81724	Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers
Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium	Corning	21-040-CV	Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions
Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container	Sterilite	0342	Animal processing container